ここでは、二次アドヒアランス法と呼ばれるSDラットからBMMを単離するためのプロトコルを提示する。
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方法論記事
二次アドヒアランス法によるラット骨からの単球-マクロファージ系譜細胞の単離
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
骨塩密度が低下すると、骨が骨折する可能性が高くなり、患者の生活の質に悪影響を及ぼします。骨の成長および発達は、主に骨芽細胞および破骨細胞によって調節される。破骨細胞は骨髄単球 - マクロファージ細胞(BMM)に由来することが広く受け入れられている。BMMおよび他の造血幹細胞は、骨髄腔内に位置する。したがって、異なる異種の細胞集団から単一の安定BMMを単離することは大きな課題である。ここでは、二次アドヒアランス法と呼ばれるSDラットからBMMを単離するためのプロトコルを提示する。初代培養で24~48時間培養した付着細胞を回収した。フローサイトメトリー分析により、細胞の約37.94%がCD11b/c+(単球-マクロファージ表面抗原)であることが示された。酒石酸耐性酸性ホスファターゼ(TRAP)染色およびウェスタンブロット分析は、BMMが インビトロで破骨細胞に分化できることを実証した。以上の知見は、二次接着細胞が破骨細胞分化研究に好適な細胞モデルと考えられることを示唆した。
概要
骨髄中に存在する単球・マクロファージ系譜細胞が血液単球や組織マクロファージに分化できることが報告されている1,2。上記の細胞は、骨の成長と発達のバランスをとるために破骨細胞に分化することができ、インビボで破骨細胞を誘導する細胞モデルとして一般的に使用されている3,4。骨髄は、骨髄間葉系幹細胞、骨髄単球 - マクロファージ細胞(BMM)、造血幹細胞、内皮細胞、および免疫細胞を含むがこれらに限定されない、いくつかの異なるタイプの細胞を含む特別な組織である。実際、いくつかの以前の研究は、長骨の骨髄腔から突出した付着細胞が骨芽細胞、破骨細胞、軟骨細胞、または脂肪細胞に分化する可能性を示唆した5、6、7、8。異なる均質な細胞集団を作製するために、異なる単離および培養方法が使用されてきたが、様々な異なる細胞型からBMMを単離および培養することには依然として大きな課題がある。
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プロトコル
本試験における全ての実験は、浙江省中国医科大学実験動物研究センターの動物実験ガイドライン(承認番号:IACUC-20181029-11)に従って実施した。
1. 細胞抽出
- Sprague-Dawleyラット(SDラット、生後1〜10日、雄または雌)をCO2 で満たされた安楽死ケージに、30%〜70%の容器容量/分のバランスのとれた速度で入れる。ラットが意識を失った後(20〜60分)、頸部脱臼によってラットを安楽死させ、痛みのない死を確実にする。
- 消毒のためにラットを75%アルコールに10分間浸漬する。
- はさみと鉗子でラットのすべての四肢を慎重に取り除き、ピペットを使用してPBSで吸引し、四肢に付着した血液を洗い流す。
- 500mLのDMEMに5mLのペニシリン/ストレプトマイシン溶液を加え、よく混ぜる。50 mLの滅菌遠沈管を取り、5 mLのFBSおよび45 mLのDMEM培地を加え、十分に混合して、1%ペニシリン/ストレプトマイシン溶液を含む10%FBS DMEMを得た。上記の培養液2 mLを5 mLチューブに加える。
- 四肢の骨を5mLチューブに移す。はさみを使用してチューブ内の四肢の骨を小片(1〜3mm)に切断し、ホモジネートを混合して骨髄細胞を培養液に再懸濁させる。組織断片がチューブの底に落ち着くまで5分間放置する。<....
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結果
二次付着細胞集団は安定かつ均一であった。連続的な細胞増殖に伴い、細胞の大部分は不規則な形状でより大きくなり、放射状の接着円盤に成長した(図2C、D)。フローサイトメトリーは、単球-マクロファージ系譜細胞の表面上の分子マーカーであるCD11b/cを発現する細胞の割合が約37.94%であることを示した(図2A、B)。さらに、CD11b/c陽性細胞が単球-マクロファージ系譜細胞であることを確認するために、RANKLおよびM-CSFによる細胞処理後に二次接着細胞から破骨細胞への分化を誘導した。TRAP染色の結果、対照群と比較して、RANKLおよびM-CSFで誘導された細胞において細胞内紫赤色顆粒の数が有意に増加したことを示した(図2E、F)。さらに、破骨細胞特異的タンパク質TRAPおよびカテプシンKの発.......
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ディスカッション
破骨細胞は、骨疾患の発生および発症に関与する最も重要な細胞型の1つであり、骨疾患研究の主要な目的の1つである20。単球/マクロファージは破骨細胞に分化することができる。単核マクロファージ(RAW264.7細胞)は高価すぎて購入できず、培養中に活性化されやすいため、この細胞株を用いた 体外 分化実験を行うことは困難である。骨髄から単球/マクロファージを抽出するために、密度勾配遠心分離、コラゲナーゼ消化、ミクロスフェア濃縮およびフローサイトメトリーを含むいくつかの方法が開発されているが(表1)、これらの方法は時間がかかり、高いサンプル量と高価な装置を必要とする。そこで、本研究では、骨髄試料からモノサイト/マクロファージを簡便かつ迅速に抽出する方法を提案することを目指した。
骨髄には、BMMに加えて、BMSC、内皮細胞および免疫細胞を含む多くの細胞集団が存在する。BMSCが骨芽細胞に分化することができ、このプロセスが破骨細胞へのBMMの分化に影響を与えることは誰もが知っているように
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開示事項
著者らは、競合する利害関係はないと宣言している。
謝辞
この研究は、浙江省自然科学財団の支援を受けました(助成金番号。LY19H060001)および浙江省漢方薬科学技術計画プロジェクト(番号2022ZB093)。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 35 mm2 細胞上昇スライス | NEST バイオテクノロジー | 80102 | |
| 抗カテプシン K | Abcam | ab19027 | 1:1,000 |
| 抗 CD11 アイソタイプ制御 | Abcam | ab172730 | 1 μg /テスト、1.675 mg / Ml |
| 抗CD11b / c | アブシン | abs124232 | 1μg/test, 1 mg/mL |
| Anti-TRAP | Abcam | ab191406 | 1:1,000 |
| アンチβ;-アクチン | Beyotime | AF5003 | 1:1,000 |
| 細胞クライミングスライス | NEST バイオテクノロジー | 80102 | |
| 細胞培養皿 | コーニング | 430167 | |
| 細胞培養フラスコ | コーニング | 430168 | |
| ダルベッコの改変イーグル培地 (DMEM) | ギブコ | C11995500BT | |
| ウシ胎児血清 (FBS) | ギブコ | 10099141C | |
| ヤギ抗ウサギIgG | Abcam | ab150077 | IF用、1:2,000 |
| ヤギ抗ウサギIgG | Abcam | ab6721 | WB用、1:2,000 |
| M-CSF | Pepro技術 | 400-28 | |
| PBS | バイオシャープ | BL302A | |
| RANKL | Pepro技術 | 400-30 | |
| SDラット | 上海SLAC実験動物有限公司 | 1-10日前 | |
| SDS-PAGE ゲル調製キット | ソーラーバイオ | P1200 | |
| TRAP/ALP 染色キット | 和光 | 294-67001 | |
| トリプシンEDTA溶液 | バイオシャープ | BL512A | |
| ライト・ギムサ溶液 | キーゲン・バイオテック | KGA225-1 |
参考文献
- Jakubzick, C. V., Randolph, G. J., Henson, P. M. Monocyte differentiation and antigen-presenting functions. Nature Reviews. Immunology. 17 (6), 349-362 (2017).
- Locati, M., Curtale, G., Mantovani, A. Diversity, mechanisms, and significance of macrophage plasticity.....
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