スカッシュにおける種間ハイブリダイゼーションのための胚レスキュープロトコル

ウリ科(2n = 40)は、ウリ科の非常に多様な属であり、27の異なる種を含み、そのうち5種は家畜化されています¹。これらの中で、ククルビタモシャタ、C.ペポ、 およびC.マキシマは世界で最も経済的に重要です。米国では、C. moschataとC. pepoが農業生産において最も重要な2つの種です。C. pepoは、クルックネック、ストレートネック、ドングリ、ホタテ、ココゼル、野菜骨髄、ズッキーニ、カボチャの夏と冬のカボチャの両方の品種グループを含む4つの亜種(オビフェラ、ペポ、兄弟、およびグマラ)で構成されています2,3,4,5。C. moschataは主に、バターナッツ、ディキンソン、チーズグループ¹などの冬カボチャ市場タイプで構成されています。2種は形態学的にも表現型的にも多様であり、C. pepoは収量、早さ、茂みの成長習慣、果実の形、果実の大きさ、果色、皮の模様などの多様な果実形質が評価されています。一方、C. moschataは、熱と湿度、および病害虫抵抗性への適応で高く評価されています^6,7。C. moschataとC. pepoの間の種間交雑は、2つの種間の望ましい特性の導入のための重要な戦略であるだけでなく、育種プログラムにおける遺伝的基盤の拡大も可能にします^7,8。

C. moschataとC. pepoの初期の交配は、それらの適合性および/または分類学的障壁を決定するために行われました9,10,11、その後の研究は主に望ましい形質の伝達に焦点を当てていました^12,13,14。2つの種間の種間交配は、病害抵抗性、非生物的ストレスへの適応性、およびC. moschataからの活力の増加とともに、ブッシュまたはセミブッシュの成長習慣などの新しい形質の伝達とC.ペポからの収量の改善を標的としています14,15,16。例えば、C. pepo(P₅)とC. moschata(MO₃)の間の特定の交配は、より高い果実収量をもたらしました13が、C. moschataアクセッション(ナイジェリアローカルおよびメニーナ)は、栽培されたC.ペポ栽培品種のポチウイルスに対する耐性の主要な供給源として広く使用されています^17,18。

以前の研究では、C. moschataとC. pepoの間のハイブリダイゼーションは可能であるが困難であることが示された^8,15。種間交配は、結実なし(流産)、生存可能な種子のない単為結実の果実(空の種子)、未熟胚が発達しない種なし果実(狭窄精子)、または胚救助によって成熟植物に救助できる未熟胚がほとんどない果実をもたらす可能性があります^15,16。例えば、C. pepo(テーブルクイーン、母方)とC. moschata(大きなチーズ、父方)を交配しても生存可能な種子は得られませんでしたが、相互交配は134の受粉から57の生存可能な種子を生み出しました⁹。早瀬は、10°Cで一晩保存した花粉を用いて、午前4:00に交配を行った場合にのみ、C. moschataおよびC. pepo交配から生存種子を得た¹⁹。バゲットは、8つの異なるC. moschata品種をC. pepo(デリカタ)と交配し、103の総受粉のうち、正常に見える83の果実が得られましたが、それらのどれにも生存可能な種子が含まれていなかったと報告しました⁸。C. pepo (S179) と C. moschata (NK) の交配では、Zhangらは2,994個の種子を含む15個の果実を得たが、そのうち12個のみが生存可能であり、残りは初歩的な発達しか示さなかった。これらの研究は、C. moschataとC. pepoの間の種間交配が非常に有益であるにもかかわらず、交配から生存可能な種子を持つ果実を得ることが要求されていることを示唆しています¹⁶。

胚レスキューは、早期流産または発達不良の胚から生じる問題を克服するための適切な方法として提案されており、未熟胚の再生のための最も早く、最も成功した体外培養技術の1つです^16,20。胚救助には、未発達/未熟な胚のin vitro培養とそれに続く無菌栄養培地への移植が含まれ、実生の回復を促進し、最終的には成熟した植物²¹。胚レスキューはスカッシュ育種で一般的に使用されていますが、その日常的な適用を可能にする適切な方法論の詳細な説明は不足しています。Cucurbita種における種間ハイブリダイゼーション障壁を克服するための胚救助技術の使用は、早くも1954年に報告された²²。しかし、初期の研究における胚救助の成功は、報告されていないか、非常に低かった。Metwallyらは、C. pepoとC. martinezii²³の交配から救出された100個の種間雑種胚のうち、10%の成功率(成熟した植物への再生)を報告した。Siskoらは、異なる交配の組み合わせから得られた胚の間で胚再生の成功率がばらつきがあることを報告しました:C. maxima(Bos. Max)とC. pepo(ゴールドラッシュ)を交配することによって得られた雑種の再生率は15.5%、C. pepo(ズッキーニ)とC. moschata(北海道)は20%、C. pepo(ゴールドラッシュ)とC. moschata(ドルガ)は37.5%でした²⁴。 遺伝子型に加えて、培地およびインビトロ培養条件は、技術の成功のための重要な要素である^25,26。本研究では、C. moschataとC. pepoの様々な交雑組み合わせをテストし、スカッシュにおける胚救助技術を利用するための簡単な方法論を開発した。シンプルで容易に再現可能な胚救助技術の開発は、スカッシュ育種プログラムにおける種間ハイブリダイゼーションと生殖質増強を促進するでしょう。

1.植栽と受粉

注:ハイブリダイゼーションが結実と生存可能な胚の生産をもたらす互換性のある遺伝子型を特定することが重要です。

1. 植栽条件とメンテナンス
   1. ハイブリダイゼーションのためにスカッシュ遺伝子型(品種/アクセッション)の種子を入手します(表1)。
   2. 50セルの開始フラット(幅25 cmx長さ50 cm)に、1.38 g / kg N、1.38 g / kg P、および1.38 g / kg Kを含む完全なNPK肥料で修正した培養土を満たします。
   3. 種子をその長さに等しい深さまで播種し、培養土で覆います。立っている水を作らずに干潟に水をまきます。その後、1日1回手で水をやり、メディアを湿らせてください。
   4. 2番目の本葉段階で、苗を直径25cmから30cmの鉢に移植し、大さじ3杯/鉢で完全なNPK肥料で修正します。NPK 20:20:20を含む液体肥料500 mL /ポットを水1ガロンあたり1 gの濃度で添加して、週に1回植物に肥料を与えます。
   5. 自然光の下で22〜28°Cの温度で温室内の植物を維持します。ブドウの遺伝子型については、温室内に支持トレリスを用意します(図1)。
2. 受粉の実行
   1. 通常、カボチャの開花は、品種によって異なりますが、播種から6〜8週間で始まります(図2A、B)。植物が開花し始めたらすぐに制御された交配(交配)を始めます。温室条件下では、受粉は一年中行うことができます。
   2. 翌日受粉の準備が整うC. ペポ および C.モシャタ 品種の雄花と雌花を特定します。そのような花を識別するには、花びらが黄色の色合いを持っているが開いていない花をチェックします。偶発的な昆虫の受粉を防ぐために、マスキングテープを使用して上部で閉じた花をそっとテープで留めます(図2C、D)。
   3. 翌日の朝、花は受粉する準備ができています。ハイブリダイゼーションの成功率を向上させるために、午前10:00までに受粉を実施します²⁷。
   4. 花びらのテープで留められた上部をそっと取り除き、雌花と雄花を開きます。雄花から花びらを取り除き、雌花の柱頭に葯をそっとこすって花粉を移します(図3A)。
   5. 受粉後、直ちに受粉した雌花をマスキングテープで閉じます。タグを使用して、受粉の日付を記録し、十字架で使用される父方と母方の両親を示します(図3B)。
   6. 交配が成功した場合、卵巣が拡張され、1週間以内に小さな果実がすぐに形成されます(図4A)。その後、植物は受粉²⁸ の45〜55日後に収穫の準備が整います(図4B)。

2.胚救助技術

1. メディアの準備
   1. 抗生物質ストックの準備:セフォタキシム(ナトリウム塩)の場合、抗生物質を4 mLの脱イオン水または蒸留水に溶解し、滅菌済みの0.22 μmシリンジフィルターでろ過し、0.5 mLのアリコートを作ります。-20°Cで保存してください。 得られたストック溶液の濃度は250 mg/mLになります。
   2. アンピシリン(ナトリウム塩)の場合は、粉末を10 mLの水に溶解し、滅菌済みの0.22 μmシリンジフィルターでろ過し、最終濃度100 mg / mLの1 mLストックに分注します。-20°Cで保存してください。
   3. 1Lボトルに2.45gの培地(濃度4.91g/L)を蒸留水500mLに溶解してムラシゲ・スクーグ(MS)培地を作ります。ジェランガム1.5 gを加え、オートクレーブを121°Cで20分間加えます。ジェランガムはオートクレーブ中に完全に溶解します。
   4. オートクレーブ処理後、ボトルを50°Cの水浴に入れて培地を冷却する。 冷凍庫から抗生物質ストックを取り出し、層流キャビネットで解凍します。
   5. ミディアムボトルを層流フードに移します。0.6 mLのセフォタキシムストック溶液(250 mg / mL)と0.25 mLのアンピシリンストック(100 mg / mL)を培地ボトルに加え、よく混ぜます。約7 mLの培地を滅菌ペトリ皿(60 mm x 15 mm)に注ぎます。
   6. 培地をペトリ皿で約15〜20分間固化させます。ペトリ皿をシーリングラップで閉じ、収納ボックスに入れます。室温で保管してください。
2. 胚レスキュー
   1. 開始する前に、層流キャビネットを70%エチルアルコールで洗浄および滅菌します。
   2. カボチャの果実をメインのつるから壊したり切り取ったりして収穫し、緩んだ汚れがすべて取り除かれるまで、ラボシンクで液体洗剤(0.3%クロロキシレノールなど)で洗浄して果物の表面を消毒します(図5A)。
   3. 十分な水道水ですすいでください。清潔なペーパータオルで果物を乾かします。果物を層流キャビネットに移動します(図5B)。
   4. 滅菌層流キャビネット内の果物に70%エタノールを噴霧することにより、果物を表面滅菌します。滅菌ナイフで果実を二等分し(図5C)、種子を抽出します。
   5. 滅菌鉗子を使用して種皮を無菌的に開き、未熟な胚を露出させます(図6)。未熟胚を、セフォタキシムとアンピシリンを添加したMS培地を含むシャーレに注意深く入れます(図7A)。ペトリ皿を閉じ、ラッピングフィルムで密封します。
      注:胚のサイズに応じて、5つまたは6つの胚をペトリ皿に入れることができます。
   6. 胚の入った密封されたペトリ皿を、25°C、相対湿度70%の16時間日長以下の成長チャンバーに入れます。汚染が発生した場合は、汚染されていない胚をすぐに同じ培地で新しいプレートに継代培養します。
   7. 子葉は4日後に拡大し始め、10日後に緑色に変わります(図7B)。この時点で、必要に応じて、組織増殖を可能にするために、同じ培地を含む新しいプレートに継代培養を実行します。根は14日目に現れ始め(図7C)、21日目に子葉に根と子葉が伸びます(図7D)。
      注:プロトコルで使用される培地は、補助的な成長調節剤なしで新芽および根への分化に適しています。
   8. この段階で、ペトリ皿から小植物を取り除き、水道水で根から培地をそっと洗い流します(図8)。小植物をプラスチック容器(14 cm x 9 cm x 4 cm)に入れ、根を濡れたペーパータオルで覆います(図9A)。容器を覆い、必要に応じてペーパータオルを再び湿らせます。
   9. 容器を室温(25〜28°C)で16時間の日長で保管してください。このステップは苗を順応させるでしょう。コンテナ内で7〜10日間順応した後、実生の長さは約3〜4になります。この間、必要に応じてペーパータオルを湿らせ直します。
   10. 前述のように肥料で修正した50セルの開始フラット(幅25 cmx長さ50 cm)に苗を移し、温室に移動します(図9B)。腐敗を防ぐために苗に水をやりすぎないでください。必要に応じて、細胞あたり約10〜20 mLを追加します。.
   11. 2〜3回目の本葉の段階で、前述のように肥料を修正した培養土で満たされた直径30cmの鉢に苗を移植します(図10A)。前述のように、ブドウの木にトレリスサポートを提供し、植物が開花し始めたときに制御されたハイブリダイゼーションを実行します(図10B)。
   12. 温室内の植物を自然光下で22〜28°Cの温度に維持します。果物と種子の特性について植物を評価します。

結実と種子の生存率
さまざまな交配の組み合わせで結実と種子の生存率を決定するために、最初のテストが実施されました。合計15のスカッシュ遺伝子型、4つのC. ペポ と11の C.モシャタが選択されました(表1)。試みられた24の種間交差の組み合わせのうち、22のフルーツセットが得られ(表2)、フルーツセット全体で>92%の成功を表しています。OとMおよびEとJを交配しても成熟した果実は得られなかったが、FとJを交配することによって最も多くの果実(n=6)が得られた(表2)。異なる交配の組み合わせで受粉された花の数は1から11の範囲であり、受粉の成功率は0%から100%の範囲でした。交雑の組み合わせによって受粉された花の数は,花セットの数と雄花と雌花間の開花の同期によって異なりました。2つを除くすべての交配から果実を得たが、それらを切断した後の果実の評価は、ほとんどの果実が生存可能な種子のない胚を流産したことを明らかにした。ほとんどの交配からの果実は正常に見えましたが、種子がないか、初歩的な胚を持つ種子で構成されていました。すべての交雑の組み合わせから合計44個の果実が生産され、CとJを交配して開発された1つの果実だけが、胚救助技術によって回収できる発達不良の胚を持っていました。

胚の救出とさらなる進歩
CとJを交配して発達したF1種間雑種は合計44個の種子を有していたが、そのうち10個のみが世代進学のために救助できる胚を有していた。残りの種子には胚がいなかった。10個の胚すべてを胚レスキュー培地で培養し、成長と発達を毎日チェックしました。10個の未熟胚のサイズは3.51mmから8.26mmの範囲であった。胚救助の成功率は80%であった。C. moschataとC. pepo(CとJ)を交配することによって開発されたF1種間雑種(架橋系統)は、両種のゲノムを1:1(それぞれ50%)の比率で含んでいました。これらの植物は、2つの種間で経済的に重要な形質を導入するための橋渡し線として使用されました。例えば、これらの橋線をC. moschataと交差させると、それぞれ75%のC. moschataと25%のC. pepoの遺伝的背景を持つ雑種が生まれます。 これらの架橋線から得られた果実は、生存不能な種子および未熟な胚を有する種子の混合物を有し、その後、再生のために組織培養を必要とした。たとえば、果物の1つには合計54の種子があり、そのうち14の種子には未熟な胚があり、ここで説明するプロトコルを使用して救助されました。

図1:温室内で垂直に成長するカボチャ植物のためのトレリスのサポート。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:開いた花とテープで留められた花のイラスト。 温室で(A)男性と(B)女性のカボチャの花を開きます。(C) ククルビタ・モシャタ の父方の親からのテープで留められた雄花。(D) ペポカボチャ の母方の親からのテープで留められた雌花。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:受粉の図。 (A)雌花の柱頭に葯をそっとこすりつけて、雄花から花粉を移します。(B)受粉後、雌花をテープで留め、タグを使用して受粉日と十字架で使用した父方と母方の両親を記録します。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:結実 。 (A)受粉後、卵巣は急速に拡張し、1週間以内に小さな果実を形成します。(B)果実は受粉後45日で収穫の準備ができています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図5:果物の準備 。 (A)果物を洗剤で洗います。実験室の流しで液体洗剤で果物を洗うことによって果物の表面を収穫して消毒します。(B)果物をすすぎ、乾燥させます。十分な水道水ですすいだ後、清潔なペーパータオルで果物を乾かし、層流キャビネットに移動します。(C)滅菌ナイフで果物を二等分して開きます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図6:種子から胚を抽出します。 滅菌鉗子を使用して種皮を無菌的に開き、未熟胚を露出させます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図7:MS培地での胚再生 。 (A)MS培地を入れたシャーレに未熟胚を慎重に入れる。(B)子葉は10日以内に拡大し、緑色になります。(C)根は14日で現れ始めます。(D)21日目に、子葉には根と子葉が伸び、順応のためにプラスチック容器に移す準備が整います。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図8:根を洗う。 ペトリ皿から小植物を取り除き、水道水で根から培地をそっと洗い流します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図9:小植物を順応させる 。 (A)小植物をプラスチック容器に入れ、根を濡れたペーパータオルで5日間覆い、順応させます。(B)完全なNPK肥料で修正された市販の培養土を含むセルトレイに小植物を移します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図10:苗を鉢に移植 します。 (A)2〜3本葉の段階で、肥料を修正した培養土を満たした直径30cmの鉢に苗を移植します。(B)ブドウの木植物にトレリスサポートを提供し、植物が開花し始めたときに制御されたハイブリダイゼーションを行います。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

表 1: 種間交配の研究には、合計15のスカッシュ遺伝子型、4つのC .ペポ と11の C.モシャタが使用されました。

表 2: スカッシュの15の遺伝子型と対応する結実、流産種子の数、未熟胚、および成功した胚救助との交配が試みられました。

著者は利益相反を宣言しません。