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方法論記事

げっ歯類の心臓におけるウイルス導入遺伝子発現と心不整脈リスクの評価

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DOI:

10.3791/64073

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2022年7月27日

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1University of Ottawa Heart Institute, 2Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Ottawa, 3Department of Biochemistry, Microbiology and Immunology, University of Ottawa

この記事について

サマリー

本プロトコルは、心エコー検査ガイダンスの下でのウイルスの直接心筋内注射によるラットおよびマウス心臓における導入遺伝子発現の方法を記載する。孤立したランゲンドルフ灌流心臓のプログラムされた電気刺激による心室性不整脈に対する心臓の感受性の評価方法もここで説明されています。

要約

心臓病は、世界中の罹患率と死亡率の主な原因です。取り扱いが容易でトランスジェニック株が豊富であるため、げっ歯類は心血管研究に不可欠なモデルになっています。しかし、心臓病患者の死亡を引き起こすことが多い自然発生的な致死性心不整脈は、心臓病のげっ歯類モデルではまれです。これは主に、ヒトとげっ歯類の心臓の電気的特性の種の違いによるものであり、げっ歯類を用いた心不整脈の研究に課題をもたらします。このプロトコルは、組換えウイルス(アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス)の心エコー検査ガイド下筋肉内注射を使用して、マウスおよびラットの心室心筋における効率的な導入遺伝子発現を可能にするアプローチについて説明しています。この研究では、アドレナリン作動性とプログラムされた電気刺激の両方を備えた単離されたランゲンドルフ灌流マウスおよびラット心臓を使用して、不整脈に対する心臓感受性の信頼性の高い評価を可能にする方法についても概説しています。これらの技術は、心筋梗塞などの損傷後の有害な心臓リモデリングに関連する心臓リズム障害を研究するために重要です。

概要

心血管疾患は世界の主要な死因であり、2017年だけで1,800万人の命を奪っています1。げっ歯類、特にマウスおよびラットは、取り扱いが容易であり、様々なトランスジェニック過剰発現またはノックアウトラインが利用可能であるため、心血管研究において最も一般的に使用されるモデルとなっている。げっ歯類モデルは、疾患メカニズムを理解し、心筋梗塞2、高血圧3、心不全4、およびアテローム性動脈硬化症5の潜在的な新しい治療標的を特定するための基礎となっています。しかしながら、心不整脈の研究におけるげっ歯類の使用は、ヒトまたは大型動物モデルと比較して、心臓のサイズが小さく、心拍数が速いために制限されている。したがって、心筋梗塞後のマウスまたはラットにおける自然発生的致死性不整脈はまれです2。研究者は、不整脈負荷または不整脈促進傾向に意味のある変化を示すことなく、線維症や遺伝子発現などの不整脈支持の基質を反映する可能性のある間接的な二次的変化に焦点を当てることを余儀なくされています。この制限を克服するために、遺伝子改変6、7 または心筋梗塞2 後の心室頻脈性不整脈に対するマウスおよびラット心臓の感受性の信頼できる評価を可能にする方法が、本プロトコルに記載されている。この方法は、アドレナリン受容体刺激とプログラムされた電気刺激を組み合わせて、孤立したランゲンドルフ灌流8 匹のマウスとラットの心臓に心室頻脈性不整脈を誘発します。

げっ歯類の心筋組織におけるウイルス遺伝子導入のための標準的なアプローチは、しばしば開胸術9,10,11による心臓の曝露を含み、これは侵襲的処置であり、処置後の動物の回復の遅延と関連している。この記事では、導入遺伝子の過剰発現に対する超音波画像ガイダンスの下でウイルスを直接心筋内注射する方法について説明します。この侵襲性の低い手順は、開胸術と比較して、ウイルス注射後の動物の回復を早め、組織損傷を減らし、動物の術後の痛みや炎症を軽減し、したがって、トランスジェニック遺伝子の影響をより適切に評価することができます心機能。

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プロトコル

記載されているすべての方法と手順は、オタワ大学の動物研究倫理審査委員会およびオタワ大学心臓研究所のバイオセーフティ審査委員会によって承認されました。開発された安全プロトコルには、組換えアデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルス(AAV)を扱うすべての手順がレベルIIのバイオセーフティキャビネットで実行されたことが含まれます。実験後、ウイルスと接触したすべてのアイテムを完全に除染しました。Ctnnb1フロックス/フロックスおよびαMHC-MerCreMerマウス(8〜12週齢、性別のいずれか)およびSprague-Dawleyラット(200〜250g、雄)を本研究に使用しました。動物は商業的な供給源から入手した(材料表を参照)。動物を扱うすべての手順は、機関の規制委員会によって訓練され承認されたスタッフによって実行されました。すべての手順で適切な個人用保護具が使用されました。

1. げっ歯類の心室組織におけるウイルス導入遺伝子発現

注:Ad-GFP(1 x 10 10 PFU / mLの力価)またはAAV9-GFP(力価1 x10 13 GC / mL)などの標的遺伝子と対応するコントロールウイルスを発現する組換えアデノウイルスまたはAAV( 材料の表を参照)を-80°Cの冷凍庫に保管します。

  1. ウイルス注射の日に、氷上でウイルスを解凍します。標的遺伝子を発現するウイルスとコントロールウイルスを30 G 1/2針で2本の別々のシリンジ(容量=50 μL)に吸引し、使用するまで氷上に保ちます。
    注意: シリンジと針の気泡は慎重に取り除く必要があります。
  2. ブプレノルフィンをラットまたはマウスに投与し(ラットの場合は0.05 mg / kg、マウスの場合は0.1 mg / kg、皮下)、1時間後に3%イソフルランを使用して麻酔を誘発し、その後の手順ではイソフルランを2%(100%酸素で0.5〜1.0 L / minの流速で)に維持します。.
  3. 動物の体(尾など)を鉗子でそっとつまみ、動物が体の動きでつまんで反応しない場合は、適切な麻酔を確認します。
  4. 電気加熱パッドを使用して体温を37°Cに維持します。バリカンを使用して胸部の毛を剃ります。
    注意: 電気加熱パッドを使用するときは、熱分布が不均一になる可能性があるため、注意が必要です。
  5. 角膜の乾燥を防ぐために両眼に眼科用軟膏を塗布します。
  6. 動物を仰臥位に保ち、前臨床イメージングシステム( 材料の表を参照)を使用して、動物の心臓を短軸方向に超音波イメージングします。
    注:次の手順は、無菌環境を提供するレベルIIのバイオセーフティキャビネットで実行されます。安全な針の取り扱いを含む標準的な安全手順が採用されています。
  7. 動物の左下胸部を、ヨウ素ベースまたはクロルヘキシジンベースのスクラブとアルコールを交互に3回円を描くように滅菌します。
  8. 超音波画像ガイダンスの下で、ステップ1.1で準備したウイルスを含むシリンジの30 G 1/2針を挿入します。体の左下胸側を介して動物の胸に。
  9. 針先を左心室前部自由壁に近づけ、10〜15μLのウイルスをゆっくりと注入します。針の先端近くの明るさを高めることにより、超音波画像への注入が成功したことを確認します。
    注:心筋組織への物理的損傷を防ぐために、各部位に注入されるウイルスの量は15μL以下です。
  10. 心臓から針を引き出し、左心室の他の領域に挿入して、同量のウイルスを2回目と3回目に注射します。
    注:注射部位の総数は、実験計画によって決まります。限局性導入遺伝子発現が必要な場合は、1回の注射のみが必要です。より拡散的な導入遺伝子発現が必要な場合は、通常、複数の注射部位(3〜5)が必要です。
  11. 注射が完了したら、動物をケージに戻します。
  12. 動物が胸骨横臥を維持するのに十分な意識を取り戻すまで動物を注意深く監視し、飼育室に戻します。
  13. ブプレノルフィンHCl(0.1 mg / kg、マウスの場合は1日2回、0.05 mg / kg、ラットの場合は1日2回、皮下)を次の2日間動物に投与します。.動物をビバリウムに戻し、痛みや苦痛の異常な兆候がないか毎日監視し、見つかった場合は、施設動物管理委員会のプロトコルに従って動物を治療します。

2.心不整脈感受性の評価

注:アデノウイルス注射後4〜6日およびAAV注射後1〜2週間で、動物の心臓の心不整脈に対する感受性を評価します 手順2.1.-2.2に従います。

  1. ラットまたはマウスの心臓のランゲンドルフ灌流を行う。
    1. 1 Lの水に以下を加えてタイロード溶液を調製します:NaCl、7.9 g(最終= 135 mM);KCl, 0.37 g (5.0 mM);CaCl2, 0.27 g (1.8 mM);MgCl 2, 0.24 g (1.2 mM);ヘペス, 2.38 グラム (10 ミリメートル);グルコース、1.8 g(10 mM)。NaOHでpHを7.40に調整します(材料表を参照)。
    2. 溶液を0.2μmのフィルターでろ過し、ステップ2.1.6.〜2.2.8の間、100%O2 で連続的に泡立てます。
    3. ヘパリンをラットまたはマウスに投与し(500 U / kg、腹腔内注射)、10分後に3%イソフルランで動物を麻酔します。.体を優しくつまんで適切な麻酔をかけてください。
    4. メスを使用して、左開胸術のために鎖骨中央線に1〜1.5 cmの垂直切開を行い、心臓を露出させます。
    5. 大動脈弓レベルでハサミで切って心臓を集め、すぐに心臓を氷のように冷たいタイロード溶液に入れます。
      注意: 心臓の収集中に心臓を傷つけないように注意してください。
    6. 固定流量モードで修正されたランゲンドルフ灌流システム( 材料の表を参照)に接続された鈍い針(ラットの場合は18 G、マウスの場合は23 G)で心臓の大動脈をカニュレーションします。灌流圧力を70〜80mmHgに保つように流量を調整します。
      注意: 大動脈カニューレ挿入の前に、灌流針の気泡を取り除く必要があります。解剖顕微鏡を使用すると、カニューレ挿入が容易になります。
    7. カニューレ付き心臓を左心室を上に向けてシリコーンエラストマーでコーティングされた9、10 cmのプラスチック皿に入れ、心臓9,12をO2バブルタイロード溶液で37°Cに灌流します。
    8. 最初の2〜3回の心拍中の心臓からの血液の洗い流しと、心臓の色が赤から淡い色に変化するのを観察することにより、灌流開始時の正しい大動脈カニュレーションを確認します。
    9. 小動物のECGシステム( 材料の表を参照)の電極を皿のシリコーンエラストマーコーティングに挿入して、心臓の周りに配置します(図1)。互換性のあるソフトウェアを使用してECGを記録します。
  2. アドレナリン受容体刺激とプログラムされた電気刺激を実行して、心室頻脈性不整脈を誘発します。
    1. 大動脈カニューレ挿入が成功した後、心臓の準備を安定させるために、Tyrode溶液で心臓を20分間灌流し続けます。
    2. ステップ2.2.3.-2.2.8で心臓灌流に使用するタイロード溶液に1μMイソプロテレノール( 材料の表を参照)を追加します。
    3. イソプロテレノール灌流を10分間行った後、電気刺激装置に接続された2つの白金電極で心臓を頂点で刺激します( 材料の表を参照)。
    4. 刺激手順(図2)から始め、10回の連続した刺激(S1、5 V、100ミリ秒間隔)が含まれ、その後に80ミリ秒の初期間隔で追加の刺激(S2)が続きます。心拍をキャプチャできなくなるまで(つまり、心臓の有効不応期であるERPに達するまで)13、S2間隔を毎回2ミリ秒ずつ繰り返し短縮します。
    5. ECGによって誘発された心室頻脈性不整脈(心室頻拍および細動を含む)を監視します。.
    6. 上記の手順で不整脈が誘発されない場合は、ERPに達するまで、S2の後に同じ初期(80ミリ秒)とデクリメント(2ミリ秒)間隔で別の刺激(S3)を追加します。
    7. それでも心室頻脈性不整脈が誘発されない場合は、ERPに達するまで、S3の後に同じ初期間隔と減少間隔でもう1つの刺激(S4)を追加します。
    8. 心室頻脈性不整脈がまだ誘発されない場合(コントロール健康な心臓で予想されるように)、電気刺激プロトコルを停止し、心臓は非誘導性であると考えてください。

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結果

ここで説明するプロトコル(図1)に従って灌流すると、単離されたラットまたはマウスの心臓は、少なくとも4時間、リズミカルかつ安定して鼓動します。実験デザインでより長い期間の心臓灌流が必要な場合は、長時間灌流後の心筋浮腫の発生を減らすために、灌流溶液にアルブミンを添加することが有用です14。灌流溶液にイソプロテレノールを含めると、心筋梗塞や心不全などの多くの不整脈病で発生する交感神経系の活性化を模倣します。.プログラムされた電気刺激の間、心臓の成功したペーシングは、(1)連続したS1刺激中の心拍の1:1キャプチャと(2)S1ペーシング中の長時間の(またはより広い)QRS複合体によって検証されます(図3 および 図4)。後者は、心臓が頂点でペースを合わせており、心室組織における活性化の伝導が遅いとQRS複合体の持続時間が長くなるためです。

公表されたデータ

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ディスカッション

ランゲンドルフ灌流された単離心臓製剤の成功には、いくつかのステップが重要です。まず、心臓採取中の心臓への損傷を避けることが重要です(たとえば、誤って絞ったり、はさみで切ったりすることによる)。第二に、これは心拍を停止し、心臓の酸素消費量を減らすため、収集した心臓をできるだけ早く冷たいタイロード溶液に入れることが重要です。第三に、大動脈への針の挿入は深すぎてはいけません—理想的には、針の先端が大動脈弁レベルに近いため、心臓は冠状動脈を通して十分に灌流されます。最後に、灌流針の気泡は大動脈カニュレーションの前に除去する必要があります—通常、カニューレ挿入の直前にポンプを数秒間オンにして、針の先端の気泡を除去すると便利です。

ランゲンドルフ灌流心臓製剤は、動物におけるin vivo試験に比べていくつかの利点があります。第一に、心臓に適用される薬物(例えば、この研究で使用されるイソプロテレノール)の濃度および持続時間を正確に制御することができる。第二に、刺激(例えば、この原稿の頂点での電気的ペーシング)または生理学的信号記録(例えば、Ca2+感受性ま...

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開示事項

著者は競合する金銭的利益を持っていません。

謝辞

この研究は、カナダ衛生研究所(CIHR)プロジェクト助成金(PJT-148918およびPJT-180533、WL)、CIHR早期キャリア研究者賞(AR8-162705、WL)、カナダ心臓脳卒中財団(HSFC)マクドナルド奨学金および新研究者賞(S-17-LI-0866、WL)、学生奨学金(JWおよびYXへ)、およびオタワ大学心臓基金からのポスドクフェローシップ(ALへ)心臓研究所。著者は、リチャード・シーモア氏の技術サポートに感謝します。 図 2 は、承認されたライセンスを持つ Biorender.com で作成されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
30 G 1/2 PrecisionGlide NeedleBecton Dickinson (BD)305106
アデノ随伴ウイルス (AAV9-GFP)Vector Biolabs7007
アデノウイルス (Ad-GFP)Vector Biolabs1060
アデノウイルス (Ad-Wnt3a)Vector BiolabsADV-276318
バイオセーフティキャビネット (レベル II)Microzone CorporationN/Aモデル #: BK-2-4
ブプレノルフィン獣医DIN 02342510
塩化カルシウムSigma-Aldrich102378
D-GlucoseFisher ChemicalD16-1
バリカンWAHL Clipper Corporation78001
ハミルトン シリンジSigma-Aldrich20701705 LT, volume 50 μL
の暖房パッドの生命ブランドE12107
ヘパリンのフレゼニウスKabiのDIN 02264315
のHEPESのΣAldrichH4034
のイソフルランのFresenius Kabi株式会社M60303
イソプロテレノール塩酸塩Sigma-Aldrich1351005
LabChart 8 ソフトウェアADInstruments Inc.ECG記録用のバージョン8.1.5
マグネシウム六水和物Sigma-AldrichM2393
マウス(Ctnnb1flox/flox)Jackson Labs4152
マウス(αMHC-MerCreMer)Jackson Labs5650
LensLeicaS9ifor Langendorff system
MS400 transducerVisualSonic Inc.N / A
眼科軟膏シスタンDIN 02444062
塩化カリウム(KCl)Sigma-AldrichP9541
圧力計NETECHDigiMano 1000Langendorffシステム
用 ポンプCole-ParmerUZ-77924-65Langendorffシステム
用 ラット(Sprague-Dawley、男性)Charles River400
メスの刃ファインサイエンスツール10010-00
メスのハンドルファインサイエンスツール10007-12
シリコーンエラストマーダウン株式会社Sylgard 184ランゲンドルフシステム
小動物心電図システムADInstruments Inc.N/APowerlab 8/35 and Animal Bio Amp
塩化ナトリウムSigma-AldrichS7653
水酸化ナトリウムSigma-Aldrich567530
刺激装置IonOptixMyoPacer EP
VEVO3100 前臨床イメージングシステムVisualSonic Inc.該当なし
の塩化

参考文献

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