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方法論記事

ヒト間葉系幹細胞から小さな細胞外小胞を単離するための簡単なベンチトップろ過法

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DOI：

10.3791/64106

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2022年6月23日

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1Centre for Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Universiti Kebangsaan Malaysia Medical Centre, 2My CytoHealth Sdn. Bhd., 3School of Biosciences, Faculty of Health and Medical Sciences, Taylor's University, 4School of Pharmacy, Monash University Malaysia, 5Haematology Unit, Cancer Research Centre, Institute for Medical Research (IMR), National Institutes of Health (NIH), Ministry of Health Malaysia, 6School of Pharmacy, Faculty of Health & Medical Sciences, Taylor's University, 7Centre for Drug Discovery and Molecular Pharmacology (CDDMP), Faculty of Health and Medical Sciences, Taylor's University

この記事について

サマリー

このプロトコルは、ヒト臍帯由来間葉系幹細胞の小さな細胞外小胞(hUC-MSC-sEV)を、シンプルなラボスケールのベンチトップ設定で分離する方法を示しています。単離されたhUC-MSC-sEVのサイズ分布、タンパク質濃度、sEVマーカー、および形態は、それぞれナノ粒子追跡分析、BCAタンパク質アッセイ、ウェスタンブロット、および透過型電子顕微鏡によって特徴付けられます。

要約

超遠心分離ベースのプロセスは、小さな細胞外小胞(sEV)単離の一般的な方法と考えられています。ただし、この分離方法からの収率は比較的低く、これらの方法はsEVサブタイプの分離に非効率的です。この研究は、ヒト臍帯由来MSC小細胞外小胞(hUC-MSC-sEV)を分離するための簡単なベンチトップろ過方法を示し、hUC-MSCの馴化培地から限外ろ過によって分離することに成功しました。単離されたhUC-MSC-sEVのサイズ分布、タンパク質濃度、エキソソームマーカー(CD9、CD81、TSG101)、および形態を、ナノ粒子追跡分析、BCAタンパク質アッセイ、ウェスタンブロット、および透過型電子顕微鏡でそれぞれ特徴付けました。単離されたhUC-MSC-sEVのサイズは30-200 nmで、粒子濃度は7.75 ×10 10 粒子/mL、タンパク質濃度は80 μg/mLでした。エキソソームマーカーCD9、CD81、およびTSG101の陽性バンドが観察された。この研究は、hUC-MSC-sEVがhUC-MSCs馴化培地から首尾よく単離されることを示し、特性評価は、単離された製品が細胞外小胞の研究のための最小情報2018(MISEV 2018)で言及された基準を満たすことを示しました。

概要

MISEV 2018によると、sEVは、機能性核が存在しない非複製脂質二重層粒子であり、サイズは30〜200 nm1です。MSC由来のsEVには、マイクロRNA、サイトカイン、タンパク質など、組織再生に重要な役割を果たす重要なシグナル伝達分子が含まれています。それらはますます再生医療と無細胞治療の研究「ホットスポット」になっています。多くの研究により、MSC由来のsEVは、免疫調節2,3,4,5、骨形成の増強6、糖尿病7,8、血管再生9,10などのさまざまな状態の治療においてMSCと同じくらい効果的であることが示されています。初期段階の試験が進むにつれて、MSC-EVの臨床翻訳に関連する3つの主要な重要な問題が強調されています:EVの収量、EVの純度(細胞破片やタンパク質やサイトカインなどの他の生物学的汚染物質を含まない)、および分離後のEVのリン脂質二重膜の完全性。

sEV11の密度、形状、サイズ、および表面タンパク質を利用して、sEVを分離するためのさまざまな方法が開発されています。sEVの分離で最も一般的な2つの方法は、超遠心分離ベースと限外ろ過ベースの技術です。

超遠心分離ベースの方法は、EV分離におけるゴールドスタンダードの方法と見なされています。通常採用される2種類の超遠心分離技術は、示差超遠心分離および密度勾配超遠心分離である。しかし、超遠心分離法は収率が低く、高速超遠心分離機(100,000〜200,000 × g)には高価な装置を必要とすることがよくあります11。さらに、超遠心分離技術だけでは、EVサブタイプ(sEVおよび大型EV)を分離するのに非効率的であり、不純な堆積物層11をもたらす。最後に、密度勾配超遠心分離も時間がかかり、加速および減速ステップ12中のグラジエント損傷を抑制するためにスクロースバッファー添加などの追加の予防ステップを必要とする可能性があります。したがって、超遠心分離は通常、比較的低い収率をもたらし、EVの異なる集団を区別することができず13、大規模なEV調製への適用を制限する11。

EV単離の2番目の方法は、サイズろ過に基づく限外ろ過によるものです。限外ろ過は、高価な装置や長い処理時間を必要としないため、超遠心分離と比較して比較的時間と費用効果が高いです14。したがって、限外ろ過は、前述の両方の超遠心分離方法よりも効果的な単離技術であるように思われます。単離された生成物は、細孔サイズおよびより高い収率に基づいてより具体的にすることができる15。しかしながら、濾過プロセス中に発生する追加の力は、EV16の変形または噴火をもたらす可能性がある。

本論文では、MSC由来のsEVをダウンストリーム分析および治療目的で単離するための費用対効果と時間効率の高いベンチトッププロトコルを提案しました。この論文に記載されている方法は、単純なろ過方法とベンチトップ遠心分離を組み合わせて、粒子サイズ分析、バイオマーカーアッセイ、電子顕微鏡イメージングなどのダウンストリーム分析のために、hUC-MSCから高収率で高品質のEVを分離しました。

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プロトコル

注意: このプロトコルで使用されるすべての材料、機器、およびソフトウェアの詳細については、 材料の表 を参照してください。

1. ヒト臍帯間葉系幹細胞及び培養

  1. hUC-MSCをDMEM中で5 × 103/cm2 の播種密度で培養し、8%のヒト血小板ライセートと1%のペンストレプトを添加しました。細胞を5%CO2中で37°Cでインキュベートする。適切な細胞増殖を確実にするために、3日ごとに細胞培養培地を交換してください。
  2. 細胞をT175フラスコの継代5に展開して、sEV分離を行います。
    注:高収量のsEVを収穫するには、多くのフラスコが必要です(収量は細胞数とともに増加します)。

2. hUC - MSCからの細胞外小胞の低単離

  1. 培養液が継代5で70%〜80%のコンフルエントに達したら、培養液を1%ペンストレプト[コンディショニング培地(CM)]を添加した新鮮なフェノールレッドフリーDMEMと交換します。
    注意: 基礎メディアのみを使用してください。外部sEVによる汚染を避けるために、FBSおよびヒト血小板ライセートサプリメントは避けてください。
  2. 24時間後、CMを200 × g で4°Cで5分間遠心分離し、細胞破片を除去しました。上清を集めて0.22 μmのフィルターでろ過し、220 nmを超える粒子を除去します。
  3. 遠心フィルターユニットに、0.2 μmフィルターでろ過した30 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を満たします。遠心フィルターユニットを3,500 × g で4°Cで5分間遠心分離します。
  4. ろ過したCMを遠心フィルターユニットに充填します(各ユニットの最大容量は70mLです)。CMを4°Cで3,500 × g で遠心分離します。
    注意: 溶液がフィルターの表面に到達するまで、遠心分離の持続時間は時々監視する必要があります。
  5. ろ液溶液カップに溶液を捨てる。濃縮液回収カップでサンプルフィルターカップを1,000 x g、4°Cで2分間逆遠心分離します。
  6. 濃縮されたCMを遠心フィルターユニットに戻します。30 mLのろ過PBSを遠心フィルターユニットに加え、4°Cで3,500 × gでユニットを遠心分離します。
  7. ろ液溶液カップに溶液を捨てる。フィルターユニットに濃縮回収カップを取り付け、1,000 × g で4°Cで2分間逆遠心し、精製されたsEVを得ました。
  8. 0.22 μmのシリンジフィルターでsEVをろ過します。
  9. サンプルを新しいチューブに移し、さらに分析するために-80°Cで保管します。

3. hUC-MSC-sEVの特性評価

  1. ナノ粒子追跡解析
    1. 分離されたhUC-MSC-sEVをろ過されたPBSで20〜100粒子/フレームに希釈します。
    2. 1 mLの使い捨てシリンジを使用して、1 mLの希釈サンプルをNTAチャンバーに入れます。
    3. それに応じて測定設定を設定します:カメラレベルをレベル14に調整し、10〜100個の赤い十字がカウントされ、青い十字の数が5つに制限されるという制限で、できるだけ多くの粒子を含むように検出しきい値を決定します。
    4. 測定ごとに、5つの1分間ビデオを録画し、検出しきい値を5のNanoSightソフトウェアを使用して分析します。
    5. 各サンプルについて3回に分けて測定します。
  2. ウェスタンブロッティング分析
    1. hUC-MSC-sEVを氷冷放射免疫沈降アッセイ(RIPA)溶解バッファーで溶解し、4°Cで30分間インキュベートし、200 × g で4°Cで5分間遠心分離します。 上清を集める。
    2. ビシンコニン酸(BCA)タンパク質アッセイキットを使用してタンパク質を定量します。それに応じてゲル電気泳動セットを組み立て、タンパク質がスタッキングゲルの末端に達するまで90 Vでゲル電気泳動を実行します。電圧を200 Vに変更して、分解ゲルが終了するまでタンパク質を分離します。
    3. セミドライ転写を行い、タンパク質をゲルからポリフッ化ビニリデン(PVDF)膜に15 Vで1時間転写します。
    4. PVDFメンブレンを3%ウシ血清アルブミン(BSA)/トリス緩衝生理食塩水-0.1%v/v Tween 20(TBS-T)で室温のシェーカーで1時間ブロックします。PVDFメンブレンを一次抗体とともにインキュベートします:マウス抗CD9モノクローナル抗体(1:500)、マウス抗CD81モノクローナル抗体(1:500)、マウス抗GRP 94モノクローナルマウス抗TSG 101モノクローナル抗体(1:500)を4°Cで一晩、絶えず振とうします。
    5. 翌日、PVDFメンブレンをTBS-Tで5 x 5分間洗浄し、さらに二次抗体である西洋ワサビペルオキシダーゼ結合マウスIgGカッパ結合タンパク質(m-IgGκ BP-HRP)(1:5,000)とともに室温で攪拌しながら1時間インキュベートします。
    6. 再度、PVDFメンブレンをTBS-Tで5回洗浄し、化学発光検出試薬を用いて電荷結合(CCD)イメージャーでメンブレンを可視化します。ImageJソフトウェアを使用してタンパク質の発現レベルを分析します。まず、ImageJで画像ファイルを開きます(ファイル|開く...)。明るさとコントラストを調整して画像の品質を向上させます(画像|調整 |明るさ/コントラスト)。しみがはっきりと見えるまで画像を調整し、[ 適用 ]ボタンをクリックしてから、画像をTIFF形式で保存します(ファイル|名前を付けて保存 |ティフ...)。
  3. 透過型電子顕微鏡
    1. hUC-MSC-sEVサンプル1部を4部のろ過PBSで希釈して総容量10 μLにし、炭素被覆銅グリッド上で15分間インキュベートします。
    2. 実験室用ワイプを使用して余分なサンプルを取り除き、3分間風乾させます。
    3. 10 μLの1%リンタングステン酸(PTA)溶液をインキュベートし、サンプルを3分間染色します。
    4. 実験室用ワイプを使用して余分な1%PTA溶液を取り除き、3分間風乾させます。
    5. 透過型電子顕微鏡イメージングに使用します。
      注: 概略実験手順の概要については、 図 1 を参照してください。

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結果

図2 は、hUC-MSC-sEVが53 nmで粒径モードを持っているのに対し、他の有意な粒径ピークは96 nmと115 nmであることを示しています。NTAによって測定されたhUC-MSC-sEVの濃度は、7.75 × 1010 粒子/ mLでした。BCAアッセイで測定したhUC-MSC-sEVのタンパク質濃度は約80 μg/mLでした。

ウェスタンブロッティング解析では、hUC-MSC-sEVはエキソソームマーカーCD9、CD81、およびTSG101で陽性のバンドを示しましたが、GRP94では陰性でした(図3)。GRP94は、sEVのネガティブマーカーとして一般的に使用される小胞体マーカーです。単離されたhUC-MSC-sEVをTEMで可視化し、サイズと形態を決定しました。hUC-MSCs-sEVは~100 nmの大きさで、カップ状の二分子膜構造を示しました(図4)。

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ディスカッション

EVは、MSCのセクレトームの重要なサブセットの1つであり、正常および病理学的プロセス中に重要な役割を果たします。しかし、サイズ範囲が30〜200nmのsEVは、過去10年間で無細胞治療の潜在的なツールとして台頭しています。MSCからsEVを分離するために、さまざまな技術が開発されました。しかしながら、示差超遠心、限外濾過、ポリマーベースの沈殿、免疫親和性捕捉、およびマイクロ流体ベースの沈殿は、異なる長所と短所を有する17。これらの単離技術のいずれも、高い回収率および特異性を達成することはできません。したがって、研究者は、高い回収率または高い特異性に基づいて、好みに応じて適切な方法を選択する必要があります。

間葉系幹細胞のsEVを単離する前に、MSCは、前述のようにフローサイトメトリーによって陽性表面マーカー(CD90、CD105、CD73)および陰性マーカー(CD34、CD11b、CD19、CD45、およびHLA-DR)について評価されました18。このsEV研究の技術的利点は、現在の...

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開示事項

著者は利益相反を宣言しません。

謝辞

このビデオの公開は、My CytoHealth Sdn. Bhdによってサポートされました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
40% アクリルアミドNacalai Tesque06121-95ウエスタンブロット
95% エタノールNacalai Tesque14710-25消毒剤
アブソリュート メタノールChemiz45081PVDF 膜 (ウエスタンブロット)
AccutaseSTEMCELL Technologies7920細胞解離酵素
過硫酸アンモニウムChemiz14475触媒ゲル重合 (ゲル電気泳動
抗CD 81 (B-11)Santa Cruz Biotechnologysc-166029sEVsマーカー
TSG 101 (C-2)Santa Cruz Biotechnologysc-7964sEVsマーカー抗体
ウシ血清アルブミンNacalai Tesque00653-31PVDF膜ブロッキング
モフェノールブルーNacalai Tesque05808-61電気泳動カラーマーカー
Centricon Plus-70 (100 kDa NMWL)MilliporeUFC710008sEVs isolation
ChemiLumi One LNacalai Tesque7880化学発光検出試薬
CryoStor 凍結培地Sigma-AldrichC3124-100ML細胞凍結保存
Dulbecco'修正されたイーグル」s mediumNacalai Tesque08458-45細胞培養培地
ExcelBand Enhanced 3-color High Range Protein MarkerSMOBIOPM2610タンパク質分子量マーカー
極厚ブロッティングペーパーATTOバッファーリサーブ(ウェスタンブロット)
グリセロールメルクG5516ウェスタンブロット用薬品
グリシン1塩基BIO-2085-500g緩衝剤(ウエスタンブロット)
セイヨウワサビペルオキシダーゼ結合マウスIgGカッパ結合タンパク質(m-IgGκBP-HRP)Santa Cruz Biotechnologysc-516102二次抗体(ウェスタンブロット)
Human Wharton's ゼリー由来間葉系幹細胞(MSC)Centre for Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Faculty of Medicine, The National University Malaysia
Mouse antibodies anti-CD 9 (C-4)Santa Cruz Biotechnology sc-13118
CMOSカメラ、20倍対物レンズ、青色レーザーモジュール(488 nm)、およびNTAソフトウェアv3.2Malvern Panalytical、英国
パラホルムアルデヒドNacalai Tesque02890-45TEM
ペニシリン中のサンプル固定–ストレプトマイシンナカライ テスク26253-84培地用抗生物質
フェニルメチルスルホニルフッ化物ナカライ テスク27327-81溶解緩
衝リン酸緩衝生理食塩水ギブコ10010023洗浄、サンプル希釈
ポリフッ化ビニリデン (PVDF) 膜、
0.45 mm 孔径		ATTOタンパク質転写中にタンパク質を保持するため(ウェスタンブロット)
プロテアーゼ阻害剤カクテルナカライテスク25955-11溶解バッファーを追加した後、sEVサンプル中のプロテアーゼを阻害する
タンパク質アッセイ ビシンコニネートキットナカライテスク06385-00タンパク質測定
サンプル緩衝液と2-MEナカライテスク30566-22ウェスタンブロットナトリウムの還元剤
塩化物Nacalai Tesque15266-64ウェスタンブロット用化学薬品
ドデシル硫酸ナトリウムNacalai Tesque31606-62イオン性界面活性剤 ゲル電気泳動中
Tecnai G2 F20 S-TWIN 透過型電子顕微鏡FEI、米国
テトラメチルエチレンジアミンNacalai Tesque33401-72を調製するための化学薬品
1st BaseBIO-1400-500gバッファー用薬品(ウェスタンブロット)
 Tween 20GeneTexGTX30962ウェスタンブロット用化学薬品
UVP(Ultra Vision Product) CCDイメージャーウェスタンブロットシグナル検出用CCDイメージャー
抗ブロ ゲルトリスベース

参考文献

  1. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
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  3. Li, T., et al. Exosomes derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells alleviate liver fibrosis. Stem Cells and Development. 22 (6), 845-854 (2013).
  4. Wang, C., et al. Mesenchymal stromal cell-derived small extracellular vesicles induce ischemic neuroprotection by modulating leukocytes and specifically neutrophils. Stroke. 51 (6), 1825-1834 (2020).
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  7. Li, F. X. Z., et al. The role of mesenchymal stromal cells-derived small extracellular vesicles in diabetes and its chronic complications. Frontiers in Endocrinology. 12, 1741(2021).
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  10. Du, W., et al. Enhanced proangiogenic potential of mesenchymal stem cell-derived exosomes stimulated by a nitric oxide releasing polymer. Biomaterials. 133, 70-81 (2017).
  11. Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. Progress in exosome isolation techniques. Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).
  12. Nicolas, R. H., Goodwin, G. H. Overview of extracellular vesicles, their origin, composition, purpose, and methods for exosome isolation and analysis. Cells. 8 (7), 727(2019).
  13. Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (8), 968-977 (2016).
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