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方法論記事

大動脈壁における生体力学的ひずみを再現するためのヒト大動脈平滑筋細胞器官チップモデルの構築

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DOI：

10.3791/64122

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2022年7月6日

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1Department of Cardiac Surgery and Shanghai Institute of Cardiovascular Diseases, Zhongshan Hospital, Fudan University, 2Institutes of Biomedical Sciences and the Shanghai Key Laboratory of Medical Epigenetics, Shanghai Medical College, Fudan University

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

ここでは、ヒト大動脈壁の平滑筋細胞の in vivo 生体力学的ひずみを再現するためのヒト大動脈平滑筋細胞臓器オンチップモデルを開発しました。

要約

従来の二次元細胞培養技術および動物モデルは、ヒト胸部大動脈瘤および解離(TAAD)の研究に使用されてきた。しかし、ヒトTAADは動物モデルによって特徴付けられないことがある。臨床ヒト試験と動物実験の間には、治療薬の発見を妨げる可能性のある明らかな種のギャップがあります。対照的に、従来の細胞培養モデルは、 in vivo の生体力学的刺激をシミュレートすることができません。この目的のために、微細加工およびマイクロ流体技術は近年大きく発展しており、生体力学的微小環境を再現するオルガノイドオンチップモデルを確立するための新しい技術を提供しています。本研究では、ヒト大動脈平滑筋細胞オルガンオンチップ(HASMC-OOC)モデルを開発し、TAADで重要な役割を果たすヒト大動脈平滑筋細胞(HASMC)が経験する周期的ひずみの振幅と頻度を含む、大動脈バイオメカニクスの病態生理学的パラメータをシミュレートしました。このモデルでは、HASMCの形態は形状が細長く、ひずみ方向に対して垂直に整列し、静的な従来の条件下よりもひずみ条件下でより収縮的な表現型を示しました。これは、天然のヒト大動脈壁における細胞の配向および表現型と一致していた。さらに、二尖弁大動脈弁関連TAAD(BAV-TAAD)および三尖弁大動脈弁関連TAAD(TAV-TAAD)患者由来の原発性HASMCを用いて、TAADのHASMC特性を再現するBAV-TAADおよびTAV-TAAD疾患モデルを確立しました。HASMC-OOCモデルは、TAADの病因をさらに探索し、治療標的を発見するための動物モデルを補完する新しい in vitro プラットフォームを提供します。

概要

胸部大動脈瘤および解離(TAAD)は、高い罹患率および死亡率に関連する大動脈壁の局所的な拡張または層間剥離です1。ヒト大動脈平滑筋細胞(HASMC)は、TAADの病因において重要な役割を果たしています。HASMCは終末分化細胞ではなく、HASMCは高い可塑性を保持しているため、異なる刺激に応答して表現型を切り替えることができます2。HASMCは主に生体内でリズミカルな引張ひずみを受けており、これは平滑筋の形態学的変化、分化および生理学的機能を調節する重要な因子の1つです3,4。したがって、HASMCの研究における周期的ひずみの役割は無視できません。しかし、従来の2D細胞培養では、HASMCが経験する環状株の生体力学的刺激をin vivoで再現することはできません。さらに、動物TAADモデルの構築は、二尖大動脈弁(BAV)関連のTAADなど、一部のタイプのTAADには適していません。さらに、臨床ヒト研究と動物実験の間の種のギャップは無視できません。それは臨床現場での医薬品翻訳を妨げます。したがって、大動脈疾患の研究において、in vivo生体力学的環境をシミュレートするためのより複雑で生理学的なシステムが緊急に必要とされています。

生物医学研究や医薬品開発に使用される動物実験は、費用と時間がかかり、倫理的に疑わしいものです。さらに、動物実験の結果は、ヒト臨床試験で得られた結果を予測できないことがよくあります5,6。ヒトの前臨床モデルの欠如と臨床試験における高い失敗率により、診療所に有効な薬剤がほとんどなく、医療費が増加しています7。したがって、動物モデルを補完する他の実験モデルを見つけることが急務です。微細加工およびマイクロ流体技術は近年大きく発展しており、従来の2D細胞培養技術の欠点を改善し、生理学的研究および医薬品開発のためのより現実的で低コストかつ効率的なin vitroモデルを確立するためのオルガノイドオンチップモデルを確立するための新しい技術を提供しています。マイクロ流体デバイスを使用して、組織または臓器の主要な機能を再現するために、異なる刺激を持つマイクロメートルサイズのチャンバーで生細胞を培養するための臓器オンチップが確立されます。このシステムは、単一または複数のマイクロ流体マイクロチャネルで構成されており、灌流チャンバーで培養された1種類の細胞が1つの組織タイプの機能を複製するか、異なる細胞タイプを多孔質膜上で培養して異なる組織間の界面を再現します。マイクロ流体ベースのオルガノイドと患者由来の細胞を組み合わせると、マウスとヒトの疾患モデル間の大きな種の違いを橋渡しし、疾患メカニズムの研究や創薬のための従来の2D細胞培養の欠点を克服するという独自の利点があります。過去数年間のマイクロフルイディクスの急速な発展に伴い、研究者は複雑なin vivo生物学的パラメータを複製するin vitro臓器オンチップ(OOC)モデルの有用性を認識しました8。これらのマイクロ流体オルガノイドは、周期的なひずみ、せん断応力、液圧などのin vitro生体力学的環境をシミュレートし、3次元(3D)細胞培養環境を提供します。現在までに、肺9、腎臓10、肝臓11、腸12、心臓13などの臓器の生体力学的刺激をシミュレートするためのOOCモデルがいくつか確立されていますが、これらはヒト大動脈疾患の研究に広く適用されていません。

本研究では、TAAD患者由来の初代HASMCに適用される生体模倣的な機械的力とリズムを制御できるヒト大動脈平滑筋細胞オルガンオンチップ(HASMC-OOC)モデルを紹介します。このチップは、チャネルでエッチングされたポリジメチルシロキサン(PDMS)の3層の厚板と、2つの商品化された柔軟性の高いPDMS膜で構成されています。HASMCはPDMSメンブレン上で培養されます。チップの中央にあるチャネルは、細胞培養用の培養液で満たされています。チップの上部と下部のチャネルは、PDMS膜の機械的引張ひずみのリズムと周波数を制御できる真空圧力供給システムに接続されています。HASMCが経験するリズムのひずみをHASMC-OOCでシミュレートすることができ、従来の2D培養システムでは機能的に達成できなかった組織または臓器の生体力学的微小環境を再現します。高解像度、リアルタイムイメージング、および生体力学的微小環境の利点により、生細胞の生化学的、遺伝的、代謝的活動を組織発生、臓器生理学、疾患病因、分子メカニズムおよびバイオマーカー同定、心血管疾患および大動脈疾患について研究することができる。組織特異的および患者細胞と組み合わせることで、このシステムは薬物スクリーニング、個別化医療、および毒性試験に使用できます。このHASMC-OOCモデルは、大動脈疾患の病因を研究するための新しい in vitro プラットフォームを提供します。

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プロトコル

ヒト大動脈標本は、復旦大学倫理委員会中山病院(NO.B2020-158)。大動脈標本は、復旦大学中山病院で上行大動脈手術を受けた患者から収集されました。参加前にすべての患者から書面によるインフォームドコンセントが得られました。

1.一次ヒト大動脈平滑筋細胞の分離

  1. 上行大動脈の右側領域を滅菌PBS、1x-2xで洗浄する。
  2. 2つの眼科用鉗子で組織の内膜層と外膜層を取り除き、培地層を保持して細胞を採取します。
  3. 培地層を10 cmの培養皿に置き、ハサミで小片(2〜3 mm)に切ります。10%FBSおよび1%ペニシリン-ストレプトマイシンを含む平滑筋細胞培養培地(SMCM)を5 mL加えます。
  4. 滅菌スポイトで小さな組織を培養ボトルに移動し、組織を均等に広げます。培地はできるだけ捨ててから、ボトルを逆さまにします。
  5. 2 mLのSMCMを倒立培養ボトルに加え、37°Cのインキュベーター(5%CO2)に1〜2時間置き、ゆっくりと裏返してさらに2 mLのSMCMを加えます。
  6. 5〜7日間のインキュベーション後、SMCMを4 mLの新鮮なSMCMと交換します。一般的に、散発的な平滑筋細胞は約2週間で登ります。
  7. SMCMをゆっくりと破棄し、培地を交換するときにゆっくりと追加します。顕微鏡ステーションに移動するときは、培養ボトルをゆっくりと輸送します。さもなければ、組織は浮遊し、細胞はゆっくり成長するでしょう。
  8. 細胞が約80%のコンフルエントに達したら、2 mLのPBSで洗浄し、2 mLの0.25%トリプシンで消化し、4 mLの新鮮なSMCMを含む2つの新しい培養ボトルに分割します。
  9. 平滑筋細胞の4つの異なる特異的マーカー(CNN1、SM22)の免疫蛍光分析を通じて細胞を同定します14。

2. PDMSチップの作製

  1. PDMSを重合するには、硬化剤(B成分)をベース(A成分)にA:B = 10:1 w / wの重量比で添加し、複合体を5分間完全に混合します。量は研究の必要性によって異なります。
  2. 調製したPDMSゲルを真空抽出タンクに30〜60分間入れ、圧力を-0.8mPa未満に維持します。
    注:高圧は、チップ製造の次のステップに影響を与えるPDMSゲル内の小さな気泡の抽出が不十分になります。
  3. コンピューター支援設計(CAD)ソフトウェアを使用して、100 mm×40 mm× 8 mmの外枠構造と70 mm×6 mm×4 mmチャネルで金型を設計します。
  4. 高精度のコンピューター数値制御彫刻機を使用して、3層の金型をカスタム作成します。ポリメチルメタクリレート(PMMA)プレートを使用して金型のフレームとマイクロチャネルを切り開き、それらを別のPMMAプレートに接着します。
  5. 調製したPDMSゲルを、外枠100 mm×40 mm×6 mm、70 mm×6 mm×4 mmチャンネルの型に注ぎ、70°Cで1〜2時間架橋します。
  6. 架橋PDMSスラブを金型から剥がし、製品化したPDMSメンブレンを100mm×40mmの切片に切断します。
  7. 準備した3枚のPDMSスラブと2枚のPDMSメンブレンを酸素プラズマで5分間処理し、PDMS表面活性化を行います。次の特定の設定を適用します:プロセスガスとしての室内空気。圧力は-100 kPaに設定されています。電流は180〜200 Maに設定されています。電圧は200Vに設定されています。処理時間は5分です。
  8. 1 mmの穴あけ機を使用して3つのPDMSスラブに穴を開け、PDMSチップ上の空気と媒体マイクロチャネルの入口と出口を作ります。
  9. 3つのPDMSスラブと2つのPDMSメンブレンを、エアチャネルPDMSスラブ(最上層)-PDMSメンブレン-ミディアムチャネルPDMSスラブ(中間層)-PDMSメンブレン-エアチャネルPDMSスラブ(最下層)の順に接着します。このステップを実体顕微鏡で4倍に実行して、空気マイクロチャネルと中程度のマイクロチャネルを完全に重ね合わせます。
  10. 組み立てたPDMSチップを70°Cのインキュベーターに1時間入れます。
  11. 内径1mm、長さ3cmのラテックスホースを数本用意します。用意したホースの一方の端に外径1mm、長さ1cmのステンレス針を挿入し、ホースのもう一方の端にルアーを挿入して、PDMSチップの空気および中マイクロチャネルに接続されたチューブを作成します。
  12. 準備したチューブをPDMSチップ上の空気および中程度のマイクロチャネルの出口と入口に挿入します。

3. PDMSチップの表面処理と滅菌

  1. 2 mLシリンジを使用して、2 mLの80 mg/mLマウスコラーゲンをPDMSチップの培地マイクロチャネルに注入し、室温で30分間インキュベートします。
  2. インキュベーション後、チャネルからコラーゲンを取り除き、2 mLシリンジで回収します。コラーゲンコーティングされたPDMSチップを60°Cのインキュベーターに一晩入れます。
  3. PDMSチップをUV滅菌器に1時間以上入れます。滅菌したPDMSチップを超クリーンベンチに置き、細胞実験の準備をします。

4. PDMSチップへの細胞播種と細胞延伸プロセス

  1. 2%ウシ胎児血清(FBS)および1%ペニシリン-ストレプトマイシンを含む平滑筋細胞培地(SMCM)を用いて、患者由来の4 x 10 5初代ヒト平滑筋細胞(HASMC)を37°Cの5 %CO2 インキュベーター内で培養する。
  2. HASMC密度が80%に達したら、SMCMを廃棄し、2 mLのPBSで細胞を洗浄します。
  3. 1 mLの0.25%トリプシンを使用して細胞を2分間消化し、100 x g で5分間遠心分離します。上清を除去し、細胞ペレットを1 mLの新鮮なSMCMに再懸濁します。8 mLのSMCMを使用して、10 cmの培養皿で細胞を培養します。
  4. サイトメーターを使用して細胞数を計算し、2 x 105 細胞/mLの最終濃度で細胞を使用します。
  5. コラーゲンコーティングおよび滅菌されたPDMSチップ培地マイクロチャネルに2 mLのPBSをゆっくりと注ぎ、後で2 mLシリンジを使用して廃棄します。
  6. 2 mLシリンジを使用して、合計2 mLの2 x 105 セル/mL HASMC懸濁液をPDMSチップの培地マイクロチャネルにゆっくりと注ぎます。次に、PDMSチップの入口と出口にあるルアーを閉じます。PDMSチップをインキュベーター(5%CO2)に入れ、37°Cで1日間入れます。
  7. セルがPDMSチップのPDMSメンブレンに取り付けられた後、ほぼ24時間後に、PDMSチップ上の空気マイクロチャネルの出口を真空コントローラシステムに接続します。細胞が付着すると、懸濁した丸い細胞とは対照的に、細長い正常な細胞形態が顕微鏡下で観察され得る。
  8. 電磁弁と真空ポンプをオンにします。真空レギュレーターを開き、圧力レベルを10 kPaに調整します 7.18 ± 0.44%ひずみの場合、15 kPa 17.28 ± 0.91%ひずみの場合。
  9. 制御システムのパラメータを設定した後、PDMSチップを37°Cのインキュベーター(5%CO2)に入れ、24時間ストレッチします。

5.機械制御システムの準備

  1. いくつかのソレノイドバルブ、真空フィルター、真空レギュレーター、真空ポンプ、蠕動ポンプ、およびソレノイドバルブを制御するプログラマブルロジックコントローラー(PLC)を準備します。
  2. PLCコントローラーをプログラムし、オン/オフ時間間隔を1Hzに設定します。 電磁弁をプログラムされたコントローラーに接続します。
  3. 真空ポンプの入口を真空フィルターに接続し、次に真空フィルターの出口を真空レギュレーターに接続します。真空レギュレーターの出口をソレノイドバルブに接続し、最後にソレノイドバルブの出口をPDMSチップのエアマイクロチャネルの出口に接続します。
  4. 蠕動ポンプの出口をPDMSチップの培地マイクロチャネルの入口に接続し、蠕動ポンプの入口を培地マイクロチャネルPDMSチップの出口に接続して、培地の交換と薬物処理を行います。
  5. レギュレータによるひずみの振幅とマイクロコントローラによるひずみ周波数を調整します。

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結果

HASMC-OOCモデルは、真空制御システム、循環システム、PDMSチップで構成され、HASMC-OOCモデルの概略設計です(図1)。真空制御システムは、真空ポンプ、電磁弁、およびPLCコントローラで構成されています。循環システムとして機能するために、蠕動ポンプを使用して細胞培養培地をリフレッシュし、薬物を添加しました。PDMSチップは、2つの真空チャンバーと、細胞増殖用のSMCMで満たされた中央チャンバーで構成されていました。チップ構造の設計に従って、PMMAモールドを準備し、3つのPDMSスラブをモールドに流し込み、70°Cで2時間架橋することによって準備しました。血漿処理後、3つのPDMSスラブと2つのPDMS膜を結合しました(図2)。PDMSチップを調製すると、HASMCをチップ内のPDMSメンブレン上で培養し、PDMSチップを真空制御システムと循環システムに接続しました。システム全体の概略図を補足図1に示します。PDMSチップのパラメータを図

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ディスカッション

マイクロ流体技術の急速な発展に伴い、生物学、医学、薬理学への応用のために、1つまたは複数の臓器の生物学的機能と構造をin vitroで再現できるOOCモデルが近年登場しています15。OOCは、疾患メカニズムの探索と前臨床薬物翻訳の促進に不可欠な、ヒトの生理学的微小環境の主要な機能をシミュレートすることができます8,16。OOCはまだ初期段階にあり、OOCの設計を最適化するにはより多くのインプットが必要ですが、近年多くの進歩が見られました17,18。他の3次元細胞培養モデルとは異なり、OOCは、組織の発達と臓器機能の維持に不可欠な人体の生体力学的パラメータを模倣することができます。心血管系の器官および組織は、in vivoで流体流誘発せん断および周期的張力に絶えずさらされている。したがって、心血管系のin vitro...

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開示事項

著者は開示するものは何もありません。

謝辞

著者らは、この研究が上海市科学技術委員会(20ZR1411700)、中国国家自然科学財団(81771971)、上海セーリングプログラム(22YF1406600)からの助成金によって支援されたことを認めている。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
4% パラホルムアルデヒドBeyotimeP0099-100ml細胞固定化に使用
Alexa Fluor 350 標識ヤギ 抗ウサギ IgGBeyotimeA0408免疫染色に使用した抗体
BeyotimeST025-20g
カルシウム AM/PIInvitrogenL3224
細胞培養フラスコ コーニング430639
CNN1Abcam Ab46794
Commercial flexible
PDMS membrane		Hangzhou Bald Advanced MaterialsKYQ-200
F-actinInvitrogenR415
FBSSigmaM8318
HosesRunze Fluid96410内径 1 mm、外径 3 mm、壁厚 1 mm;公式ウェブサイトアドレス:https://www.runzefluidsystem.com
大動脈平滑筋
筋細胞株CRL1999		ATCCロット番号:70019189
画像JImagej.net/fiji/downloads無料ダウンロード:https://fiji.sc 蛍光強度を特定するために使用されるイメージングプラットフォーム
インキュベータサーモフィッシャーサイエンティフィック実験全体を通して、温度、
湿度、および光曝露
がまったく同じであることを確認します
。
ルアールンゼフルードRH-M016公式サイトアドレス:https://www.runzefluidsystem.com.
顕微鏡オリンパス
マウスコラーゲンSigmaC7661
酸素プラズマ 常州Hongmingの器械HM-Plasma5L
パスツールピペットBiologix30-0138A1
PBSBeyotimeC0221A
ペン連鎖球菌シグマP4458-100mlの抗生物質は培養の間に細胞の細菌の
の汚染を防ぐために使用されて。
蠕動ポンプKamoerF01A-STP-B046
ペトリ皿コーニング430167
PLCコントローラー浙江省 Jun Teng (BenT) CNC工場BR010-11T8X2M詳細なプログラム設定は補足に記載されています。公式ウェブサイトアドレス: files.http://www.btcnc.net
ポリジメチルシロキサン(PDMS)ダウコーニングシルガード184
SM22Abcam ab14106
SMCMScienCellCat 1101
電磁弁SMC (中国)VQZ300
シリンジベクトン、ディキンソン アンド カンパニー300841
Triton-X 100BeyotimeST795細胞膜を貫通するために
TrizolInvitrogen10296010RNA 抽出
トリプシンに使用シグマ15400054
真空フィルターSMC(中国)ZFC5-6公式ウェブサイトアドレス:https://www.smc.com.cn
真空ポンプKamoerKVP15-KL-S
真空レギュレータAirTACGVR-200-06
Primers
Primer名前フォワード(5 'から3')リバース (5' から 3')
SM22CCGTGGAGATCCCAACTGGCCATCTGAAGGCCAATGACAT
CNN1CTCCATTGACTCGAACGACTCCAGGTCTGCGAAACTTCTTAGA
ウシ血清アルブミンの ヒトー

参考文献

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