下流循環フリーDNAアプリケーションのための標準化されたリキッドバイオプシー前分析プロトコル

サマリー

リキッドバイオプシーは、腫瘍学のトランスレーショナル研究へのアプローチに革命をもたらし、サンプルの収集、品質、および保管は、臨床応用を成功させるための重要なステップです。ここでは、ほとんどのトランスレーショナルリサーチラボで適用できる、下流の循環のないDNAアプリケーションのための標準化され検証されたプロトコルについて説明します。

要約

リキッドバイオプシー(LB)という用語は、原発性および/または転移性腫瘍に由来する血液および他の体液中のタンパク質、DNA、RNA、細胞、または細胞外小胞などの分子を指す。LBはトランスレーショナルリサーチの柱として浮上し、臨床腫瘍学の実践の一部となり始めており、固形生検に代わる低侵襲の代替手段を提供しています。LBは、血液などの低侵襲サンプル抽出 を介して 腫瘍のリアルタイムモニタリングを可能にします。これらのアプリケーションには、がんの早期発見、疾患進行の検出のための患者フォローアップ、最小限の残存疾患の評価、分子進行および耐性のメカニズムの潜在的な同定が含まれる。診療所で報告できるこれらのサンプルの信頼性の高い分析を達成するためには、分析前の手順を慎重に検討し、厳密に従う必要があります。サンプルの収集、品質、および保管は、ダウンストリームアプリケーションでの有用性を判断する重要なステップです。ここでは、循環のないDNAに基づく下流のリキッドバイオプシー分析のために、血漿および血清サンプルを収集、処理、および保存するための当社のリキッドバイオプシー作業モジュールからの標準化されたプロトコルを紹介します。ここで紹介するプロトコルは、標準的な機器を必要とし、生物学的手順に焦点を当てたほとんどの研究室に適用するのに十分な柔軟性があります。

概要

用語「リキッドバイオプシー」は、2010年¹ 月に、原発腫瘍に由来する血液および他の体液中の分子(例えば、タンパク質、デオキシリボ核酸(DNA)、リボ核酸(RNA))、細胞、または細胞外小胞(例えば、エキソソーム)の存在として定義された。リキッドバイオプシーサンプルの使用は、組織生検としてのトランスレーショナル腫瘍学研究に革命をもたらしており、特定の瞬間に特定の領域に限定され、腫瘍の不均一性のために関連するクローンを見逃す可能性がある。さらに、リキッドバイオプシーは、侵襲的な生検を回避し、患者のコストとリスクを軽減する可能性があるため、一次組織が乏しい、またはアクセスできない腫瘍タイプにおいて適切な役割を果たします。さらに、腫瘍分子特性は、主に治療圧力のために絶えず進化しており、リキッドバイオプシーサンプルは、ベースライン、治療、最良の応答、および疾患の進行時またはそれ以前など、疾患のさまざまな臨床的および治療的時間において、縦方向に採取することができるため、腫瘍クローンダイナミクスを捕捉することができる。「リアルタイムリキッドバイオプシー」の概念は、腫瘍の動的変化をリアルタイムで監視できることを意味し、この疾患における精密医療を可能にする。リキッドバイオプシーは、がんのスクリーニングと早期発見、疾患のリアルタイムモニタリング、最小限の残存疾患の検出、治療抵抗性のメカニズムの研究、治療レベル¹での患者の層別化など、診療所で数多くの潜在的な用途があります。疾患の再発および進行の早期発見は、多くの腫瘍タイプにおいて満たされていない臨床的ニーズであり、がん患者の生存率および生活の質を高める上で重要な要素である。日常的な画像化モダリティおよび可溶性腫瘍マーカーは、このタスクに必要な感度および/または特異性を欠いている可能性がある。したがって、循環遊離核酸に基づくものなど、診療所において新規な予測マーカーが緊急に必要とされている。

リキッドバイオプシー研究に使用されるサンプルの種類には、血液、尿、唾液、および便サンプルが含まれますが、これらに限定されません。他の腫瘍特異的試料は、細胞吸引液、脳脊髄液、胸水、嚢胞液および腹水、喀痰、および膵液²であり得る。前者の液体は、異なるタイプの癌由来物質、循環腫瘍細胞(CTC)、またはエキソソームおよび無細胞循環腫瘍DNA(ctDNA)などの断片を含んでもよい。核酸は、細胞外小胞(EV)に封入されるか、または細胞死および損傷のために体液中に放出され得る。循環遊離DNA(cfDNA)は、主にアポトーシス細胞または壊死細胞から血流に放出され、すべての個体に存在し、炎症性または腫瘍学的疾患におけるレベルの増加を示す³。エキソソームは、核酸、タンパク質、および脂質を含む細胞によって分泌される小さな細胞外小胞(〜30〜150nm)である。これらの小胞は、細胞間通信ネットワークの一部を形成し、多くの種類の体液2に一般的に^{見られる。}EV内部に封入された核酸は、体液中の過酷な環境から保護されているため、リキッドバイオプシー環境でこれらの分子を研究するためのより堅牢な方法を提供します。

全体として、リキッドバイオプシーサンプル中の循環核酸のレベルは非常に低いため、デジタルPCRや次世代シーケンシング(NGS)などの検出には高感度な方法が必要です。サンプルの事前分析管理は、血球溶解および無傷のDNAの放出を防ぎ、cfDNAとゲノムDNAの汚染を引き起こすために不可欠です。さらに、サンプルを抽出する際には、酵素ベースの分析方法の阻害剤の存在を避けるために注意する必要があります。

ここでは、循環核酸分析を含むリキッドバイオプシーベースの下流アプリケーションにとって重要な最初のステップである、血漿および血清サンプルの収集と保存のための標準化された方法を紹介します。

プロトコル

血液サンプルの抽出前に、参加センターから事前の倫理的承認が得られました。血清および血漿単離のための以下のプロトコールは、生物医学研究のための倫理的原則に従って実施された。

メモ: プロトコルを開始する前の事前の考慮事項については、こちらを参照してください。生物医学研究におけるヒトサンプルの使用には、対応するインフォームドコンセントとともに、事前の倫理的承認が必要です。血液サンプルを処理するには、クラスIIバイオセーフティキャビネットが必要です。白衣、保護手袋、眼鏡は、血液媒介性病原体による感染を避けるために、手順全体を通して着用する必要があります。血清サンプルの処理には最低30分が必要です。抗凝固剤を含まないチューブで血液を抽出した後、凝塊形成を可能にするために室温(RT)で30〜45分間維持する。血漿調製には最低40分が必要であり、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)チューブを使用する場合は抽出時から4時間以内、細胞安定化収集チューブまたは特定の無細胞DNA収集チューブを使用する場合は24〜48時間以内にサンプルを処理する必要があります。しかし、一部のメーカーによると、サンプルはこれらの特殊なチューブで最大2週間安定しています。血漿または血清画分に赤みを帯びた外観を与える溶血をチェックすることが重要です。ディスカッションの溶血サンプルについては、トラブルシューティングのセクションを参照してください。

1. リキッドバイオプシー研究のための血清製剤

メモ:この手順の実行に必要な合計時間は30分です(図1)。

1. 抗凝固剤(赤または赤/灰灰黒キャップ)を含まないチューブで4〜10mLの血液を抽出し、RTで30〜45分間維持する。抽出時から4時間以内にこれらのサンプルを処理します。
2. サンプル抽出の日時と被験者識別(ID)を、適切に設計されたサンプルデータベースに記録します。
3. 白衣、保護手袋、眼鏡を着用し、鮮血液の入ったチューブをRT(15°C-25°C)で1,600(±150)x gで10分間遠心分離し、最大ブレークを適用します。
4. 遠心分離後、チューブを遠心分離機から慎重に取り外します。血清上清の上相は、透明で黄色がかったように見えます(図2)。サンプルが溶血の兆候を示しているかどうかを確認し(図3)、必要に応じて溶血の存在を記録します。
5. クラスIIバイオセーフティキャビネットで、血清を250μLアリコートとして収集チューブに移します。
   注:アリコートの量は、試験要件に合わせて調整する必要があります。
6. 直ちに血清を-80°Cの貯蔵ボックス内で直立して凍結し、サンプル貯蔵の時間を記録する。
7. サンプルが必要な 4 時間枠内に処理されたことを確認します。

2. リキッドバイオプシー研究のための血漿調製

メモ:この手順の実行に必要な合計時間は40分です(図4)。

1. エチレンジアミン四酢酸(EDTA)を含むチューブに血液4〜10mLを抽出する。抽出時から4時間以内にサンプルを処理します。
2. サンプル抽出の日時とサブジェクト ID を、適切に設計されたサンプル・データベースに記録します。
3. 白衣、保護手袋、眼鏡を着用し、EDTAチューブをRT(15°C-25°C)で1,600(±150)x gで10分間遠心分離し、最大ブレークを適用します。
   メモ: 他の収集チューブを使用する場合は、製造元の指示書を参照してください。
4. 遠心分離後、血漿上清は透明で黄色がかった色に見えます。サンプルが溶血の徴候を示しているかどうかを確認し(図3)、使い捨て血清学的ピペット(または使い捨てバルブピペットまたはフィルターチップ付きp1000ピペット)を使用して細胞層を乱すことなく血漿(上清)を15 mL遠沈管に移します。プラズマの残留体積をセル層の上に残しておきます(約5mm)。
5. 溶血が観察された場合は、さらなる分析のためにサンプルを廃棄してください。(図5)。溶血を評価するには、「ディスカッション」のトラブルシューティングセクションを参照してください。
6. 血漿を15 mL遠沈管中でRT(15°C-25°C)で3,000(±150)x gで10〜20分間遠心分離します 。 このステップを実行して、第1の遠心分離ステップから引き継がれた残留無傷の血球を除去する。
7. 遠心分離後、遠心分離機からチューブを慎重に取り出し、使い捨て血清学的ピペット(または使い捨て電球ピペットまたはフィルターチップ付きp1000ピペット)を使用して、1〜4mLの血漿を1〜4mLポリプロピレン極低温バイアルに移す。血漿の残留量(約0.3mLまたは高さ7mm)は、血漿を血球で汚染しないようにチューブの底部に残す必要があります(図5)。
8. 直ちに-80°Cで貯蔵ボックス内のプラズマを直立して凍結し、サンプル貯蔵の時間を記録する。サンプルが必要な 4 時間枠内に処理されたことを確認します。
9. P1000とろ過した先端を使用して細胞層(バフィーコート)を集め、2mLチューブに移します。直ちに凍結し、-80°Cで保存する。

結果

抗凝固剤を含まない血液チューブの遠心分離後、上相は淡黄色で表示され、血清画分に相当する(図2)。この画分は慎重に除去され、その後の分析のために小分けされます。

溶血は血漿または血清画分のいずれかに存在することができ、上相は赤みを帯びた外観を有し、これは溶血の存在および程度を示す(図3)。

EDTAチューブの遠心分離後、いくつかの相または層が明らかになる。上相(淡黄色)は血漿画分であり、総血液量の55%を占める。薄い灰色がかった白い界面は、白血球および血小板を含むバフィーコート層であり、総血液量の<1%を占める。下相(赤色)には赤血球が含まれており、これは総血液量の45%を占める)。白血球層の1cm上方を吸引し、血球細胞による血漿の汚染を減らすために細胞層が乱れていないことを確認します(図5)。この画分は慎重に除去し、その後の分析のために小分けす...

ディスカッション

リキッドバイオプシーは、癌の管理中の異なる時期に多数の潜在的な用途を有する。第一に、診断時に、臨床的にさらに調査される可能性のある潜在的な腫瘍病変の存在を示唆する腫瘍分子マーカーを同定する。第二に、治療中に疾患のリアルタイムモニタリング、治療分子応答の評価、クローン進化、および疾患再発または治療抵抗性の早期発見を行う。最後に、外科的処置の後、最小限の残存疾患を検出するためのツールとして。欧州腫瘍医学会(ESMO)は最近、実用的な治療標的を同定するために、転移性非小細胞肺癌(NSCLC)におけるctDNA変異検査の実施に関するガイドラインを発表しました。これらのガイドラインには、方法論的考察、ctDNAプロファイリングの技術的評価と検証、体細胞モザイク、低バリアント対立遺伝子頻度(VAF)、および付随的な生殖細胞系列病原性バリアント検出などのいくつかの課題の議論^{が含まれます4}。転移性乳がん患者の診断、病期分類、および治療に関する最近発表されたESMO臨床実践ガイドラインは、治療アプローチに変更がある場合、または臨床試験に入るための必要条件である場合のctDNAベースの分析を示しています

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1.5 mL エッペンドルフチューブ	Eppendorf	0030 120.086	任意の標準チューブ/機器が使用可能
10 mL 血清学的ディスポーザブルピペット	BIOFIL	GSP010010	任意の標準チューブ/機器が使用可能
10 mL Vacutainer K2 EDTAチューブ	ベクトン・ディキンソン	367525	これらのチューブは血漿採取に使用できます
15 mLポリプロピレン遠心分離チューブ	BIOFIL	CFT411150	標準的なチューブや機器であれば、どのような標準でも使用可能
3.5mL BDバキュテイナーチューブ 抗凝固剤を含まない	ベクトン・ディキンソン	368965	8.5mLまたは3.5mLのチューブを血清採取に使用可能
4mLポリプロピレン製極低温バイアル、丸底、自立	コーニング	430662	標準的なチューブ/機器であれば、
4mL Vacutainer K2 EDTAチューブ	ベクトン・ディキンソン367864		これらのチューブは、血漿収集
4200 TapeStationシステム	Agilent	G2991BA	いくつかの定量化方法は、a cfDNA
5 mL血清学的使い捨てピペット	BIOFIL	GSP010005	任意の標準チューブ/機器は、
抗凝固剤なしで8.5mL BDバキュテイナーチューブ	ベクトン・ディキンソン	366468	8.5 mLまたは3.5 mLのチューブを血清採取に使用できます
遠心分離機、スイングバケットローター付きで~3000 x gが可能	Thermo Fisher Scientific	Sorvall ST 16  10688725	任意の標準チューブ/機器を
1&ndash用の冷凍庫収納ボックスで使用できます。4 mL極低温バイアル	Corning	431120	これらのボックスは、4 mLバイアルをストレージに使用するときに必要です
p1000ピペットチップ	CORNING	4809	任意の標準チューブ/機器を使用することができます
QIAamp循環核酸キット	Qiagen	55114	cfDNA分離に特化した市販のキットは、この血液処理プロトコルで使用できます。
ストレック 無細胞 DNA BCT CE チューブ 10 mL	Streck	218997	これらのチューブは、血漿収集に使用することができます
温度冷凍庫 (-80 °C)	ESCO	2180104	任意の標準チューブ/機器を使用できます