感染性ウイルスと非感染性ウイルスを区別するためのアプタマーのin vitro選択

Summary

感染性ウイルスのみに結合し、消毒法によって非感染性にされたウイルスや他の同様のウイルスには結合しない選択されたアプタマーに一般的に適用できるプロトコルを提供します。これにより、ポータブルで迅速なテストで感染状態を判断する可能性が開かれます。

Abstract

ウイルス感染は社会に大きな影響を与えます。ほとんどの検出方法は、検出されたウイルスが感染性であるかどうかを判断するのが困難であり、治療の遅延とウイルスのさらなる拡散を引き起こします。臨床サンプルや環境サンプルの感染性を知らせることができる新しいセンサーを開発することで、この満たされていない課題に対処できます。しかし、無傷の感染性ウイルスを認識し、消毒法によって非感染性にされた同じウイルスと区別できるセンシング分子を得ることができる方法はほとんどありません。ここでは、指数関数的濃縮によるリガンドの系統的進化(SELEX)を用いて、感染性ウイルスと非感染性ウイルスを区別できるアプタマーを選択するためのプロトコルについて説明します。SELEXの2つの機能を活用しています。まず、SELEXは、カウンター選択を使用して、非感染性ウイルスまたは他の同様のウイルスなどの競合するターゲットを削除するようにカスタマイズできます。さらに、ウイルス表面タンパク質の代わりに、ウイルス全体をSELEXの標的として使用することができる。全ウイルスSELEXは、ウイルスを破壊することなく、ウイルスの天然状態に特異的に結合するアプタマーの選択を可能にします。したがって、この方法は、事前に知る必要のない病原体の表面の機能の違いに基づいて認識剤を得ることを可能にする。

Introduction

ウイルス感染は、最近のCOVID-19パンデミックからますます明らかになったように、世界中で甚大な経済的および社会的影響を及ぼしています。タイムリーで正確な診断は、健康な人へのウイルスの拡散を防ぎながらウイルス感染症を治療する上で最も重要です。PCR検査^1,2やインミュノアッセイ³など、多くのウイルス検出法が開発されていますが、現在使用されている方法のほとんどは、検出されたウイルスが実際に感染性であるかどうかを判断できません。これは、ウイルス核酸やタンパク質などのウイルスの成分のみの存在は、無傷の感染性ウイルスが存在することを示すものではなく、これらのバイオマーカーのレベルは感染性との相関が低いことを示している^ためです4,5,6。たとえば、現在のPCRベースのCOVID-19検査で一般的に使用されているウイルスRNAは、患者が伝染性である場合、感染の初期段階では非常に低いレベルを示しますが、患者が感染から回復し、もはや伝染性ではなくなった場合、RNAレベルは依然として非常に高いことがよくあります^7,8。ウイルスタンパク質または抗原バイオマーカーも同様の傾向に従いますが、通常はウイルスRNAよりもさらに遅く現れるため、感染性の予測はさらに低くなります^6,9。この制限に対処するために、ウイルスの感染状態を知らせることができるいくつかの方法が開発されているが、結果を得るために長い時間(数日または数週間)を必要とする細胞培養微生物学的技術に基づいている^4,10。したがって、臨床サンプルまたは環境サンプルの感染性を通知できる新しいセンサーを開発することで、治療の遅延やウイルスのさらなる拡散を回避できます。しかし、無傷の感染性ビリオンを認識し、非感染性にされた同じウイルスと区別できるセンシング分子を得ることができる方法はほとんどありません。

この文脈において、アプタマーは、ユニークな生体分子ツール¹¹、^12、13、14として特に適している。アプタマーは、特定の塩基配列を持つ短い一本鎖DNAまたはRNA分子であり、特定の3D立体配座を形成して、高い親和性と選択性でターゲットを認識することができます^15,16。それらは、指数関数的濃縮によるリガンドの系統的進化(SELEX)と呼ばれる組み合わせ選択プロセスによって得られ、in vitro選択としても知られ、10 14-10 15配列^17,18,19の大きなランダムDNAサンプリングライブラリを備えた試験管で実行されます.この反復プロセスの各ラウンドにおいて、DNAプールは、最初に、所望の条件下で標的とのインキュベーションを通じて選択圧を受ける。ターゲットにバインドされていない配列はすべて削除され、指定された条件下で結合できる少数の配列のみが残ります。最後に、前のステップで選択された配列はPCRによって増幅され、プールの集団を次の選択ラウンドのために所望の機能配列で濃縮し、このプロセスが繰り返される。選択プールの活性がプラトーに達すると(典型的には8〜15ラウンド後)、ライブラリーをDNAシーケンシングによって分析し、最も高い親和性を示す勝利配列を同定する。

SELEXは^{、ウイルス}22の感染性状態など、他の類似の標的^20、21に対する選択性を高めるために利用され得る独自の利点を有する。第1に、小分子およびタンパク質から病原体および細胞全体まで、多種多様な異なるタイプの標的を選択に使用することができる¹⁶。したがって、感染性ウイルスに結合するアプタマーを得るために、ウイルス表面タンパク質¹⁹の代わりに、無傷のウイルスを標的として使用することができる。全ウイルスSELEXは、ウイルスの破壊を必要とせずに、ウイルスの天然状態に特異的に結合するアプタマーの選択を可能にします。第2に、SELEXは、選択²²の各ラウンドにおけるカウンター選択ステップを使用して、他の類似のウイルスまたは非感染性不活化ウイルスなどの競合する標的^21、23を除去するようにテーラーメイドすることができる。カウンター選択ステップの間、DNAプールは結合が望ましくない標的に曝露され、結合する配列はすべて破棄されます。

この研究では、感染性ウイルスに結合するが、特定の消毒方法によって非感染性にされた同じウイルスまたは他の関連ウイルスには結合しないアプタマーを選択するために一般的に適用できるプロトコルを提供します。この方法は、ウイルス表面の機能の違いに基づいて認識剤を得ることができ、事前に知る必要がないため、新たに出現した病原体の検出や未研究の疾患にさらに利点を提供します。

Protocol

1. 試薬およびバッファーの調製

1. 0.9 Mトリス塩基、0.9 Mホウ酸、20 mM EDTA(二ナトリウム塩)、および脱イオン水を最終容量1 Lまで加えて、10xホウ酸トリスEDTA(10x TBE)を調製します。
2. 以下のようにして10%変性ポリアクリルアミド原液を調製する。250 mL のガラス瓶に、尿素 120 g (8 M)、10x TBE 25 mL、40% アクリルアミド/ビスアクリルアミド (29:1) 溶液 62.5 mL、および最終容量 250 mL に達するのに十分な蒸留水を加えます。すべての成分が溶解するまで混合します。
3. 以下のように2倍のローディングバッファを用意します。50 mLチューブに、尿素21.636 g(8 M)、EDTA(1 mM)1.675 g、および10x TBE4.5 mLを加えます。蒸留水で45 mLまで満たし、すべての成分が溶解するまで混合します。
4. 100 mM 酢酸ナトリウムと 1 mM EDTA (二ナトリウム塩) を加えて抽出バッファーを調製します。最終pHを5に設定します。
5. 以下のようにエタノール沈殿溶液を調製する。3 M酢酸ナトリウムを調製し、pH 5.2に調整し、4°Cで保存する。 70%エタノールv/vを調製し、-20°Cで保存する。 100%エタノールを調製し、-20°Cで保存する。
6. 1x PBS、2.5 mM MgCl 2、および 0.5 mM CaCl₂ を含む 500 mL の SELEX バッファーを調製します。pH 7.4に調整します。1x PBS、2.5 mM MgCl 2、0.5 mM CaCl₂、および 8 M 尿素を添加して、8 M 尿素を含む 100 mL の SELEX バッファーを調製します。pH 7.4に調整します。
   注:SELEXバッファーの選択は、選択したアプタマーがアプタマーが適用される最終サンプルで確実に機能するようにするために重要です。たとえば、SARS-CoV-2に特異的なアプタマーは、生物学的サンプル(唾液や鼻咽頭スワブなど)に使用されます。したがって、目的の生物学的サンプルでこれらの条件を厳密に模倣したイオン濃度、pH、およびバッファーを選択することが重要です。
7. 結合および洗浄バッファーを以下のように調製する。50 mL チューブに、5 mM トリス、0.5 mM EDTA (二ナトリウム塩)、および 2 M NaCl を調製します。pH 7.5に調整します。

2. DNAライブラリーとプライマーの設計と合成

1. 初期ssDNAライブラリおよびプライマーを以下の基準で設計する(例のssDNAライブラリおよびプライマーのセットについては表 1 を参照し、ここでNはランダムなヌクレオチド位置を示す)。
   1. ライブラリに、増幅のプライマー領域として機能する3'末端と5'末端の2つの定数配列に隣接する35〜60ヌクレオチドの中央ランダム領域が含まれていることを確認します。典型的なライブラリの長さは45個のランダムヌクレオチドです。
   2. in vitro選択プロセス中にストレプトアビジンコーティングビーズを使用して増幅された二本鎖PCR産物からssDNAを分離するためのビオチン修飾がリバースプライマーに含まれていることを確認してください。
2. 標準的な脱塩精製で市販のソースからDNAオリゴを購入します。ssDNAライブラリーおよびプライマーを10%変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動(dPAGE)によって精製し、続いて標準的な手順²⁴に従ってエタノール沈殿を行った。
   注意: アクリルアミドモノマーと臭化エチジウムは危険な化学物質(人体発がん性物質)であるため、PAGEを実行するときは適切な個人用保護具(白衣、手袋、目の保護具)を使用してください。可能であれば、臭化エチジウムの使用を避け、より安全な染料と交換してください。
   注:この精製ステップの実行を避けるために、HPLC精製でオリゴを注文することは可能ですが、これは短いオリゴヌクレオチドを効果的に除去しません。
3. ヌクレアーゼフリー水を添加して、エタノール沈殿後のssDNAを所望の濃度(100 μM)まで再懸濁します。λ=260 nmでのUV吸収によりssDNAライブラリーとプライマーの濃度を測定します。-20°Cで保存してください。
4. ハイスループットシーケンシングライブラリの調製および qPCR 定量に使用する未修飾リバースプライマーを購入してください。

3.感染性および非感染性のウイルスサンプル

注意: 感染性および非感染性のウイルスサンプルは、安全かつ適切に取り扱うために特別な注意が必要なバイオセーフティレベル2(BSL2)サンプルです。これらのサンプルを含む手順のすべてのステップは、バイオセーフティキャビネットで実行するか、ウイルス溶液を密閉容器(キャップ付きプラスチックチューブなど)に入れる必要があります。

1. 感染性ウイルスのストック溶液を入手するか、各ウイルスに対応するプロトコルに従って準備します。ここで使用されたSARS-CoV-2、SARS-CoV-1、およびH5N1偽ウイルスは、Lijun Rong教授の研究室(UIC)によってPBSバッファーで提供され、報告されたプロトコル^22、25、26に従って調製されました。
   注:無傷の感染性ウイルスを処理するためにバイオセーフティレベル3の施設を必要とするウイルスの場合、偽ウイルスを扱うことが可能です。偽型ウイルスは、ウイルスエンベロープ内にウイルスの表面タンパク質を表示するレンチウイルス(HIV)から生成されるため、ウイルスの表面と侵入メカニズムを厳密に模倣しますが、継続的なウイルス複製には欠陥があります。
2. 非感染性のウイルス原液を入手するか、消毒手順に従って調製してください。ここで使用されたUV不活化SARS-CoV-2偽ウイルス(p-SARS-CoV-2)ストックは、PBSバッファー中のRong教授ラボ(UIC)によって提供され、以前に報告されたプロトコルがUV不活化に使用されました²²。
   注意: 可能であれば、ウイルスの感染力をテストして、ウイルスが完全に不活化されていることを確認するアッセイを実行します。
3. ウイルスストックの定量化
   1. 標準的な手順^27、28、29に従ってプラークアッセイを使用してウイルスを定量します。このアッセイは、ウイルスの定量を可能にするだけでなく、ウイルスの感染状態を示し、感染性ウイルスの濃度を確認します。
   2. 偽ウイルスまたはプラークアッセイが利用できないウイルスの場合は、市販の定量レンチウイルスELISAキットを使用してウイルスを定量します。
   3. p-SARS-CoV-2、p-SARS-CoV-1、およびp-H5N1用の1 x 10⁸ コピー/ mLのストック溶液を調製します。各ストック溶液をそれぞれ50 μLを含むアリコートで分離し、-80°Cに保ちます。 各実験の前に新しいアリコートを解凍します。

4. インビトロ 選択またはSELEXプロセス:最初のラウンド

注意: 感染性ウイルスを使用するすべての手順では、BSL2キャビネットで作業してください。

1. ssDNAライブラリを変性させます。10 μL の ssDNA ライブラリ (1 nmol) を取り、240 μL の SELEX バッファーと混合します。ドライバスで95°Cで15分間加熱し、次にチューブを氷の上に15分間置きます。
2. 以下のように、ssDNAライブラリーを感染性ウイルスと共にインキュベートする(ポジティブ選択ステップ)。ステップ4.1のSELEXバッファー中の250 μLのssDNAライブラリを50 μLの感染性ウイルス(1 x 10⁸ コピー/mL)と混合します。室温で2時間インキュベートします。
3. 以下のように遠心分離フィルターで非特異的部位をブロックします。ステップ4.2を待っている間に、次のステップのために遠心分離機フィルターを準備します。
   1. 使用する各0.5 mL遠心分離フィルターに400 μLの1 mM T20シーケンス(表1)を追加します-カットオフが100 kDaの遠心分離フィルターが1つとカットオフが10 kDaの遠心分離フィルターが1つ。
   2. 室温で30分間インキュベートし、14,000 x g で10分間遠心分離して、フィルター内のT20溶液を除去します。SELEXバッファーで3倍洗浄して、余分なT20配列を除去します。
4. 非結合シーケンスを次のように洗浄します。ステップ4.2でインキュベートしたミックスをブロックされた100 kDa遠心分離機フィルターに加え、14,000 x g で10分間遠心分離します。3倍洗浄し、400 μLのSELEXバッファーを添加し、14,000 x g で10分間遠心分離します。フラクションをフィルターに保持し、フロースルーを廃棄します。
5. 以下に述べるように結合配列を溶出する。
   1. 遠心分離機フィルターの収集チューブを交換し、ステップ300で8 M尿素を含む4.4 μLのSELEXバッファーを遠心分離フィルターに追加します。遠心分離機フィルターを95°Cでドライバスで15分間加熱した後、14,000 x g で10分間遠心分離します。
   2. 溶出した配列を含むフィルターを流れた画分を収集します。さらに3回繰り返します。BSL2キャビネットで作業し、すべての材料を10%漂白剤で洗浄してウイルスを不活化してから、材料を廃棄します。
6. 次のように濃縮して脱塩します。4.5で収集した溶液を、ブロックされた10 kDa遠心分離機フィルターに追加します。14,000 x g で15分間遠心分離します。フィルターを流れた画分を捨てます。
   注:ウイルスは前のステップでフィルター内の8 M尿素で保持および不活化されるため、この手順と次の手順をバイオセーフティキャビネットで実行する必要はありません。ステップ4.5のようにすべての溶液が収集されるまで0.5 mLの遠沈管を使用する場合は、この手順を繰り返す必要があり、1.2 mLがフィルターを流れます。
7. 300 μLのSELEXバッファーで3回洗浄し、14,000 x g で15分間遠心分離して尿素を除去します。フィルターを流れた画分を捨てます。フィルター内の溶液を清潔な収集チューブで逆さまにして5分間遠心分離することにより、溶液を回収します。
8. プラスチックチューブ内のピペットを使用して、4.7から回収された溶液の最終容量を測定します。この解はR i aと名付けられ、_iはラウンド数に対応します。典型的には、30μLから50μLの間の容量が得られる。溶出したssDNAを1 μL採取し、qPCRによりDNA量を定量します。
   注:これは可能な一時停止ポイントであり、R₁aサンプルを-20°Cに保ち、別の時間に継続することができます。
9. 以下のようにPCR増幅を行う。
   1. 第1ラウンドでは、_R1の90%をPCRテンプレートとしてサンプルを採取する。次のラウンドでは、ステップ4.8で総容量の60%を取り、PCRを実行し、他の画分を-20°Cで保存します。
   2. 指定された最終濃度の50 μLのPCR反応をセットアップします:1x PCR反応バッファー、200 μM dNTP、10 μLのDNAテンプレート(_R1サンプル)、200 nMの各プライマー、および1.25 Uポリメラーゼ(2.5 U/μLストック)。
   3. プライマーとssDNAライブラリの各セットのサイクル数とアニーリング温度を含むPCR条件を最適化します。プライマーダイマーなどの望ましくないPCRサブプロ産物を生成するサイクルをあまり多く使用しないでください。プライマーの融解温度に基づいて異なるアニーリング温度をテストします。
   4. 最適化された条件を用いてPCRを95°Cで5分間行い、続いて95°Cで1分、52°Cで30秒、72°Cで1分間の18サイクルを行い、72°Cで10分間の最終伸長ステップを経て、dsDNAプールを取得しました。
      注:これは別の可能な一時停止ポイントであり、PCR産物を-20°Cに保ち、別の時間に続行することができます。
10. ストレプトアビジン修飾磁気ビーズを用いてssDNAを回収します。
    1. PCR産物の80%を取ります。残りの画分を-20°Cで保存する。
    2. PCR産物を50 μLのアリコートに分割し、50 μLのストレプトアビジン修飾磁気ビーズ(MB)を含むマイクロフュージチューブに追加します。室温で穏やかな攪拌(例えば、回転シェーカーを使用)で30分間インキュベートします。次に、マイクロフュージチューブを磁気ラックに置き、MBを分離し、ピペッティングによって上清を除去します(透明な溶液である必要があります)。
    3. 200 μLの結合および洗浄バッファーをチューブに加えて洗浄します。磁気ラックからチューブを取り外し、チューブをタップし、ピペッティングによってMBを均一な溶液に再懸濁します。マイクロフュージチューブを磁気ラックに戻し、MBを分離し、ピペッティングで上清を除去します。この洗浄手順を2回繰り返します。
    4. 洗浄が完了したら、MBを合計100 μLのSELEXバッファーに再懸濁し、溶液を95°Cに10分間加熱します。チューブが冷える前にすぐにチューブを磁気ラックに入れ、ssDNAプールを含む上清を取ります。この回収手順を繰り返し、50 μLのSELEXバッファーを追加します。
11. ピペットを使用して4.10から回収された画分の最終容量を測定します。この分数はR i xと呼ばれ、iは丸め数に対応します。一般に、140〜150μLの容量が得られる。1 μLの_R1xを取り、qPCRによりDNA量を定量します。

5. その後の選考ラウンド

1. ssDNAプールを変性させます。サンプルR₁xの60%を取り、50 μLのSELEXバッファーと混合します。ドライバスで95°Cで15分間加熱します。チューブを氷の上に15分間置きます。
2. ssDNAプールを非感染性ウイルスおよびその他の潜在的な干渉ウイルスとインキュベートします(カウンター選択ステップ)。5.1のSELEXバッファー中の変性 ssDNA プールを、各ウイルス 50 μL (非感染性の p-SARS-CoV-2、p-SARS-CoV-1、p-H5N1 など) と混合します。室温で1時間インキュベートします。
3. 遠心分離機フィルター内の非特異的部位をブロックします。ステップ5.2を待っている間に、次のステップのために遠心分離機フィルターを準備します。通常、カットオフが100 kDaの遠心分離フィルターとカットオフが10 kDaの2つの遠心分離フィルターを使用します。4.3 と同じ手順に従います。
4. 非標的ウイルスに結合した配列を洗い流します。ステップ5.2でインキュベートしたミックスを、ブロックされた100 kDaの遠心分離機フィルターに加えます。14,000 x g で10分間遠心分離し、遠心分離フィルターを流れる画分を回収します。2 回洗浄し、100 μL の SELEX バッファーを添加し、14,000 x g で 10 分間遠心分離します。フィルターを流れた割合を保ちます。
5. ssDNAプールを感染性ウイルスとともにインキュベートします(ポジティブ選択ステップ)。ステップ5.4の画分300 μLを取り、感染性ウイルス50 μL(1 x 10⁸ コピー/mL)と混合します。室温で2時間インキュベートします。手順 4.4 から 4.11 に従います。

6.セレックスプロセスの監視

注:プールの濃縮を監視するために、qPCRは2つの方法で使用されます。まず、絶対定量により、プールの濃縮度(溶出収率)を試験することができる。第2に、融解曲線をモニタリングすることにより、プールの多様性(アプタマー種の収束性)を評価できる³⁰。

1. qPCR用に設計された96ウェルプレートで、10 μLの反応容量ですべてのqPCRアッセイを実行します。
2. 5 μLのマスターミックス、0.3 μLの500 nMの各非標識プライマー、3.4 μLの_H2O、および1 μLのDNAテンプレートを含む標準qPCR混合物を調製します。
   1. 精製したssDNAライブラリの希釈液を調製し(ステップ2.3)、検量線を実行します。
   2. DNAサンプルを希釈して、濃度が検量線に収まるようにします。_{Ri a}サンプルの場合は、希釈せずに1 μLのサンプルと1:10希釈の1 μLをqPCR混合物に加えます。R_ixサンプルの場合は、1:10または1:100の希釈液を含めます。
3. 次のプロトコルを設定して qPCR を実行します。まず、初期変性工程を98°Cで2分間セットする。次に、98°Cで5秒間40回の変性サイクルを設定し、52°Cで10秒間アニーリングと伸長を行います。最後に、融解曲線解析を65〜95°Cに設定する。 自動閾値分析により閾値サイクル(Ct)値を決定します。
4. 検量線を用いて、_Riaおよび_Rixサンプル中のssDNAの量を定量する。
5. 溶出収率は、結合したDNAの量(Ri-aのモル数)を初期DNAの量(_Ri-1xのモル数)で割ったものとして算出します。溶出収率対ラウンド数をプロットして、ラウンドでの濃縮が観察されるかどうかを確認します。
6. 異なるラウンドの融解曲線をプロットします。ラウンド数が増えるにつれて、75/85°C付近のピークでより高い融解温度へのシフトが予想されます。これは、プールの多様性が低下することを意味します。

7. ハイスループットシーケンシング

1. 利用可能なシーケンシングタイプとスケールについては、ハイスループットシーケンシング施設に相談し、ライブラリの調製方法を決定します。
   注:この決定では、配列決定されるプールの長さ(プライマーを含む)と提出されるプールの数(通常、プールあたり少なくとも1 x 10^{5-10 6} 配列を目指します)の両方が考慮されます。特定のシーケンシングスケールがプールの全長を読み取ることができない場合、片端からのみ読み取るシングルエンドとは対照的に、ペアエンドシーケンシングを使用してシーケンスの両端から読み取ることができます。
2. シーケンシング施設と相談して、シーケンシングの種類に基づいて適切な市販キットを選択してください。1 つのレーンを使用してすべてのラウンドのサンプル分析を可能にするプールごとにアダプター内の異なるインデックスのペアを使用して、高、中、低エンリッチメントを表す選択ラウンドの複数のプールと最終的なプールを準備します。
   注:PCR増幅を使用して、ハイスループットシーケンシングに必要なアダプターとインデックスを組み込むこともできますが、これは通常、市販のキットと同様のコストがかかり、パフォーマンスは向上しません。
   1. 断片化されたDNAの修復終了、アダプターライゲーション、PCR増幅の手順に従ってライブラリ調製を行い、最終的なライブラリを作成します。
   2. 製造元の指示に従って、磁気DNAクリーンアップビーズでPCR産物を精製します。
   3. 蛍光ベースの定量キットを使用してDNAを定量します。少量のUV測定など、精度の低い方法の使用は避けてください。
   4. 特定のインデックスを含む各プールライブラリのほぼ等量(容量ではなくDNAの量)を混合します。
   5. qPCR定量とDNAフラグメントアナライザーで最終ライブラリーの品質を確認します。このステップは、多くの場合、シーケンシング機能によって実行されます。
      注:シーケンシング施設の担当者は、ライブラリの準備方法と推奨される品質管理に関する有用な情報を提供できます。図書館を準備する前に、彼らと話し合う必要があります。
3. 準備された最終ライブラリを、要件に従ってシーケンシング施設に送信します。

8. シーケンシング解析

1. シーケンシング解析に使用できるほとんどのソフトウェアは、Linuxオペレーティングシステムのコマンドラインで実行するように設計されています。小さなデータセットの場合は、目的のLinuxオペレーティングシステムをセットアップし、必要なプログラムをパーソナルコンピューターにインストールします。大規模なデータセットの場合、HTS分析は高性能コンピューティングリソースまたはスーパーコンピューターで実行されます(推奨)。
   注:高性能コンピューティングリソースを使用するには、アクセスとトレーニングが必要であり、取得に時間がかかる場合があります。さらに、UNIXコマンドラインの使用方法に関する基本的な知識が必要になります。基本的なコマンドラインの使用に関する多くの無料のリソースがオンラインで利用でき、コンピューティングリソースはシステムを使用するための追加情報を提供する可能性があります。
2. シーケンス機能によって提供される情報を使用して、通常は圧縮されたFastQファイル形式のシーケンスファイルにアクセスします。
   1. FTP クライアントを使用して、ファイルを自分のコンピューターやハイパフォーマンス コンピューティング リソースに転送します。多くのシーケンス分析プログラムは圧縮ファイルを直接使用できるため、可能であればファイルを圧縮してファイルサイズを制限します(50 M+シーケンスの大きなシーケンス読み取りは、圧縮解除時に100 Gb+のファイルスペースを占有する可能性があります)。
   2. シーケンスファイルを解凍する必要がある場合は、ほとんどのLinuxインストールで標準であるgzip関数を使用してください。gzip とそのオプションに関する追加情報は、コマンドラインで "man gzip" と入力して、インストールされているマニュアルから入手してください。
3. 逆多重化、シーケンシングアダプタの取り外し、低品質の読み取りの削除、順方向と逆方向の両方の読み取りを含めることで、解析前にシーケンスをクリーンアップします。
   1. 以下の各ステップの後にFastQCプログラム³¹ を使用して、シーケンスに関する基本的な品質管理情報を取得し、各クリーンアップステップの有効性を評価します。
   2. シーケンスを逆多重化して、シーケンス・アダプターに含まれる索引に基づいて、単一の読み取りファイルからすべてのシーケンスを異なるプールに分離します。このステップは、多くの場合、シーケンシング施設によって実行されますが、正確な手順は使用するシーケンシングマシンに依存するため、シーケンシング施設に相談する必要があります。
   3. コマンド ライン プログラム Cutadapt³² を使用してシーケンス アダプターを削除します。(シーケンシングアダプターではなく)選択プライマーをリンクアダプターモードの入力として使用します。--discard-untrimed オプションを使用して、選択プライマーを含まない配列を破棄します。
   4. アダプターに一致する最大エラー率のオプション、および受け入れるシーケンスの最小長と最大長のオプションを設定します。ペアのエンドリードを使用する場合は、使用可能な特定のパラメータを入力し、Read 1とRead 2の両方のシーケンスファイルを指定します。必要に応じて、Cutadaptマニュアル³²を参照して追加のパラメータを設定します。
      注:シーケンシングアダプターのプールへのライゲーションは方向に依存しず、順方向に約50%、逆方向に50%のシーケンスが組み込まれます。逆方向の50%の配列が失われないようにするために、選択プライマーの逆相補を入力として使用して、Cutadaptをもう一度実行できます。
   5. (オプション)ペアエンドシーケンスを使用する場合は、Read 1 ファイルと Read 2 ファイルを PEAR³³ プログラムとマージします。
   6. FASTX−Toolkitプログラム³⁴ を使用して、任意のヌクレオチドにおいて特定の閾値を下回る品質を有する低品質の配列を除去する。30の品質カットオフスコアは、良い出発点です。全体的な品質が一般的に良好な場合は、この手順をスキップできます。
   7. 逆方向のシーケンス ファイルと順方向のシーケンス ファイルをマージするには、逆方向のファイルで FASTX-Toolkit fastx_reverse_complement 関数を使用します。次に、組み込みのcatプログラム(ほとんどのLinuxインストールで標準)を使用して、順方向と逆方向の補数-ファイルを1つのファイルにマージします。
4. 異なる選択プールにわたる配列の濃縮を分析するには、FASTAptamer 解析ツールキット³⁵ を使用します。
   1. FASTAptamer-Count を使用して、各シーケンスの出現回数をカウントします。次に、シーケンスを豊富にランク付けして並べ替えます。カウント出力ファイルは、他のすべての FASTAptamer プログラムの入力として必要です。
   2. FASTAptamer-Clust を使用して、ファイル内のすべての配列を密接に関連する配列のクラスターにグループ化します。「distance」パラメーターを使用して、クラスターにグループ化できる一塩基変異またはインデルの数を定義します。
      注: FASTAptamer-Clust プログラムは、多数の一意のシーケンスが存在する場合 (特に初期のラウンドの場合)、完全に完了するまでに数日または数週間かかる場合、計算コストが非常に高くなります。カットオフ フィルター パラメーターを使用して、存在量の少ないシーケンスをクラスタリングから除外できます。一般に、10 回または 5 回の読み取り/百万 (RPM) などの高いカットオフから始めて、プログラムがすぐに終了する場合はカットオフを減らすことをお勧めします。プールが非常に異質である場合、妥当な時間枠でシーケンスをクラスタリングすることは現実的ではない可能性があります。
   3. FASTAptamer - Enrich を使用して、選択範囲の複数のラウンドに存在する各シーケンスのエンリッチメントを計算します。ある母集団の配列のRPMを別の母集団のRPMと比較します。Enrich プログラムは、カウント ファイルまたはクラスター ファイルのいずれかで使用します。出力はタブ区切り値 (.tsv) ファイルで、任意のスプレッドシート ソフトウェアで開くことができ、詳細な分析と簡単な並べ替えを行うことができます。
      注: FASTAptamer-Enrich プログラムは、多数の一意のシーケンスが存在する場合、計算コストが非常に高くなります。カットオフフィルターパラメーターを使用すると、存在量の少ないシーケンスを出力から除外して、大きすぎてスプレッドシートソフトウェアで開くことができないファイルを回避できます。
   4. (オプション)多くのプールが異種すぎる場合 (一意のシーケンスが多く、重複するシーケンスがほとんどない場合)、Clust プログラムまたは Enrich プログラムを使用することができない可能性があります。この場合、Count 出力ファイルを使用して手動エンリッチメント チェックを実行し、シーケンスを豊富さ (最も豊富で一番上) で並べ替え、RPM などの重要な情報を含むようにシーケンス識別子の名前を変更します。
      1. Countファイルで標準のLinux「ヘッド」プログラムを使用して、最も豊富なシーケンスのリストを取得します。次に、標準のLinux「grep」プログラムを使用して、他のすべての関連するプールのカウントファイル内の最も豊富なシーケンスのそれぞれを検索します。一致するものがある場合は、変更されたシーケンス識別子を使用してそのプール内の RPM を判別し、エンリッチメント情報を手動で構築します。
         注:すべてのシーケンシング解析ステップのスクリプトは、 補足コーディングファイル1〜11にあります。

9. アプタマー結合バリデーションとアッセイ

1. 配列解析によって得られた濃縮情報から、後続の選択ラウンドで最も濃縮度が高い配列および/または最終選択ラウンドで最も豊富な配列に基づいて、候補アプタマー配列を同定する。最も濃縮されたアプタマーが必ずしも最良の性能を発揮するとは限らないため、さらなる試験のためにいくつかの異なる候補配列(少なくとも10〜20)を選択します。
2. 複数のサンプルに対して迅速に実行できる結合アッセイを使用して、候補アプタマーの初期スクリーニングを実行します。カラムベースの限外ろ過結合アッセイ³⁶ または酵素結合オリゴヌクレオチドアッセイ(ELONA)は、この初期スクリーニングに適した方法です。
3. 少なくとも2つの独立した結合アッセイ(MicroScale Thermophoresis (MST)^37,38、酵素結合オリゴヌクレオチドアッセイ(ELONA)³⁹、表面プラズモン共鳴法(BLI)⁴¹など)を用いて、最初のスクリーニングから最良の結合活性を示す配列の特異性と親和性を解析します。

Results

DNAアプタマーは試験管¹⁵内でSELEXを用いて得ることができるので、このSELEX戦略は、無傷の感染性ウイルス全体に対するポジティブ選択ステップ(すなわち、感染性ウイルスに結合するDNA分子を保持する)と、特定の消毒方法によって非感染性にされた同じウイルスに対するカウンター選択ステップの両方を含むように慎重に設計され、 具体的にはUV処理は、非感染性ウイルスに結合し得るDNA配列を破棄することによる。選択プロセスの概略図を 図1に示します。

このプロトコルの代表的な結果として、感染性SARS-CoV-2のアプタマーの選択を選択しました。無傷の感染性SARS-CoV-2を処理するためのバイオセーフティレベル3(BSL3)の作業条件の要件により、代わりに疑似型ウイルスを使用することを選択しました。偽型ウイルスは、比較的無害な骨格ウイルス(この場合はレンチウイルス(HIV)の一種)から生成され、ウイルスエンベロープ内に目的の異なるウイルスの表面タンパク質を表示するように改変され...

Discussion

SELEXは、pM-nM範囲22,43,44,45の高い親和性を有するアプタマーの同定だけでなく、高い調整可能な選択性を有するアプタマーの同定も可能にする。カウンター選択を利用することで、難しい選択性を有するアプタマーを得ることができます。例えば、Liグループは、病原性細菌株を非病原性株から区別することができる配列を取得する能力を実証した²¹。また、Leらは化膿レンサ球菌細菌の血清型を鑑別できるアプタマーを同定した⁴⁶。これにより、異なる機能DNAセンサー12,47,48,49,50に独自の選択性を有するアプタマー分子を新しいナノ^{テクノロジー22,51,52}

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% 過硫酸アンモニウム (APS)	BioRad	1610700
100% エタノール	Sigma-Aldrich	E7023
1x PBS カルシウム&マグネシウムなし	コーニング	21-040-CM
40% アクリルアミド/ビスアクリルアミド (29:1) 溶液	BioRad	1610146
Agencourt AMPure XP ビーズ	ベックマン・コールター	A63880	DNAクリーンアップビーズ - セクション 7.2.2
Amicon Ultra-0.5 遠心フィルターユニット	Merck	UFC501024	カットオフ 10 kDa
Amicon Ultra-0.5 遠心フィルターユニット	Merck	UFC510024	カットオフ 100 kDa
ホウ酸	Sigma-Aldrich	100165
C1000 タッチサーマルサイクラー、デュアル 48/48 高速反応モジュール	BioRad	1851148
塩化カルシウム	Sigma-Aldrich	C4901
CFX Connect リアルタイム PCR 解析システム	BioRad	1855201
デジタルドライバス/ブロックヒーター	Thermo Scientific	88870001
Dynabeads MyOne ストレプトアビジン C1	Thermo Fisher	65001	ストレプトアビジン修飾磁気ビーズ - セクション 4.9
EDTA 二ナトリウム塩	Sigma-Aldrich
Eppendorf Safe-Lock 微量遠心チューブ	Sigma-Aldrich	T9661	1.5 mL
Lenti-X p24 Rapid Titer Kit	Takara Bio USA, Inc.	632200	レンチウイルス定量キット - セクション 3.3.2.1
MagJET セパレーションラック、12 x 1.5 mL チューブ	Thermo Scientific	MR02
塩化マグネシウム	Sigma-Aldrich	M8266
マイクロシール 'B' PCR プレート シーリングフィルム、接着剤、光学	BioRad	MSB1001
レディゲルプレキャストゲル用 Mini-PROTEAN テトラセル		1658004EDU
ミニプロティアン ショート プレート	BioRad	1653308
ミニプロティアン スペーサー プレート 0.75 mm 一体型スペーサー付き	BioRad	1653310
分子生物学グレード ウォーター	ロンザ	51200
マルチプレート 96 ウェル PCR プレート、ハイプロファイル、スカートなし、クリア	BioRad	MLP9611
Nanodrop One	Thermo Scientific	ND-ONE-W
OneTaq DNA ポリメラーゼ	New England BioLab	M0480S
Ovation Ultralow v2 + UDI	Tecan	0344NB-A01	High-troughput シーケンシングライブラリ調製キット - セクション 7.2.
ピペットマンG(100-1000 & マイクロ;L、20-200 µL、2-20 µLおよび0.2-2 µL)	Gilson	F144059M, F144058M, F144056M, F144054M
Purifier Logic+ Class II, Type A2 Biosafety Cabinets	Labconco	4261
Qubit dsDNA BR Assay Kit	Invitrogen	Q32850	蛍光ベース  dsDNA 定量  キット - セクション 7.2.3
SHARP Classic Low Retention Pipet Tips (10 uL, 200 uL, 1000 uL)	Thomas Scientific	1158U43, 1159M44,1158U40
酢酸ナトリウム	Sigma-Aldrich	S2889
塩化ナトリウム	Sigma-Aldrich	S7653
Sorvall Legend Micro 17R 微量遠心分離機	Thermo Scientific	75002440
SsoFast EvaGreen Supermix	BioRad	1725201	qPCR mastermix - セクション 6.2.
トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン	Sigma-Aldrich	T1503
チューブとウルトラクリアキャップ、8	米国の科学	AB1183	PCRチューブ
素	Sigma-Aldrich	U5128