ここでは、出生後マウスの中枢神経系のさまざまな領域に由来するアストロサイトの高度に濃縮された培養物を生成し、転写因子の強制発現によって機能的ニューロンに直接変換するための詳細なプロトコルについて説明します。
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この記事について
サマリー
要約
直接ニューロンリプログラミングは、多能性中間体を介さずに異なるスターター細胞集団から機能的ニューロンを生成する強力なアプローチです。この技術は、例えば、神経変性疾患に罹患している患者の線維芽細胞をニューロンに変換することを可能にするため、疾患モデリングの分野で大きな可能性を秘めているだけでなく、細胞ベースの補充療法の有望な代替手段でもある。この文脈において、主要な科学的ブレークスルーは、アストロサイトなどの中枢神経系内の分化した非神経細胞が、 インビトロで機能的ニューロンに変換できることの実証であった。それ以来、アストロサイトのニューロンへの インビトロ 直接リプログラミングは、強制的な同一性変換の根底にある分子メカニズムと、効率的なリプログラミングを妨げるハードルに関する実質的な洞察を提供してきました。しかし、異なるラボで行われた in vitro実験の結果は、アストロサイトの単離、培養、および再プログラムに使用される方法の違いにより、比較が困難です。ここでは、出生後のマウスの中枢神経系の異なる領域から、磁気細胞選別 を介して 高純度のアストロサイトを確実に単離・培養するための詳細なプロトコールについて述べる。さらに、培養したアストロサイトをウイルス形質導入またはDNAトランスフェクション を介して ニューロンに再プログラムするプロトコルも提供しています。この合理化され標準化されたプロトコルは、細胞同一性の維持、新しいニューロン同一性の確立、ならびに特定のニューロンサブタイプの生成およびそれらの機能的特性の根底にある分子メカニズムを調査するために使用することができる。
概要
哺乳類の中枢神経系(CNS)は非常に複雑であり、膨大な数の異なるニューロンサブタイプ1、2、3、4、5、6を含む何百もの異なる細胞型からなる。他の器官または組織7、8、9とは異なり、哺乳動物CNSは非常に限られた再生能力を有する。外傷性脳損傷または神経変性に続くニューロン喪失は不可逆的であり、しばしば運動的および認知的欠損をもたらす10。脳機能を救うことを目指して、失われたニューロンを置き換えるためのさまざまな戦略が、激しい調査を受けている11。その中で、体細胞を機能的ニューロンに直接リプログラミングすることは、有望な治療的アプローチとして浮上している12。直接リプログラミング、または分化転換は、中間増殖性または多....
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プロトコル
以下の手順は、ヘルムホルツ・ツェントルム・ミュンヘンの動物ケアガイドラインに従い、科学的目的で使用される動物の保護に関する指令2010/63/EUに準拠しています。解剖を行う施設の動物愛護ガイドラインを必ず遵守してください。
1. 解剖・解離・培養材料の調製
メモ:生物学的安全キャビネット内のすべての培養試薬を準備し、オートクレーブまたは滅菌装置のみを使用して作業してください。解剖および解離試薬は、生物学的安全キャビネットの外で調製することができる。
- T25培養フラスコをH2O中のポリD-リジン(原液1mg/mL;作業液20μg/mL)で最低2時間コーティングして培養フラスコを調製する。その後、H2Oで3xですすぎ、風乾します。
- 5 mL の 1 M HEPES 緩衝液を 500 mL のハンクス平衡塩溶液 (HBSS) に添加して、解剖バッファーを調製します。
- 神経組織解離キット(材料表参照)から1950μL の緩衝液Xを加えて、6本の脊髄あたり1本のCチューブ( 材料表を参照)を準備する。解剖中は氷の上に保管してください。Cチューブあたり20 μLの緩衝液Yと10 μLの緩衝液Aを加えて酵素消化マスターミックスを調....
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結果
アストロサイトの初代培養物は、典型的には、MACソーティングおよびプレーティング後7〜10日の間に80%〜90%のコンフルエンシーに達する(図1B)。一般に、単一のT25培養フラスコは約1〜1.5 x106 細胞を生成し、これはウェルあたり5〜5.5 x104 細胞の密度で細胞を播種する場合、20〜30カバースリップに十分である。めっきの翌日、細胞は通常、カバースリップ表面の50%〜60%を覆う(図1C)。この段階では、培養物はほぼ独占的にアストロサイトで構成されていますが、神経芽細胞などの他の細胞型は事実上存在しません(図1D)29。
初期化因子は、レトロウイルスまたはレンチウイルスの形質導入またはDNAプラスミドのトランスフェクションのいずれかを介してアストロサイトに送達することができる。通常.......
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ディスカッション
マウスアストロサイトの初代培養物は、直接ニューロンのリプログラミングを研究するための注目すべきin vitroモデルシステムである。実際、出生後の段階で単離されるにもかかわらず、細胞は典型的なアストロサイトマーカー29を発現し、パターニング遺伝子28、29の発現を保持し、増殖する能力を維持し、同等の年齢におけるインビボアストロサイトと同様に38である。MACS媒介性単離後、細胞は最初にフラスコに接着し、次いで増殖し始め、高度に濃縮されたアストロサイト培養物29を生じる。重要なことに、培養アストロサイトは多能性細胞状態に脱分化せず、不死化することもない。さらに、それらはレポータータンパク質(例えば、DsRedまたはGFP)の発現に続いて自発的にニューロンを生成するのではなく、アストロサイト同一性を維持する。また、それらは無期限に増殖するのではなく.......
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開示事項
著者は利益相反がないと宣言しています。
謝辞
リプログラミングのためにコンストラクトをクローンしてくれたInes Mühlhahn、バイラル制作のためにPaulina Chlebik、原稿に対するコメントをしてくれたMagdalena GötzとJudith Fischer-Sternjakに感謝します。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 0.05% トリプシン/EDTA | ライフテクノロジー | 25300054 | |
| 4', 6-ジアミジノ-2-フェニンドール, ジラクテート (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9564 | |
| アンチマウス IgG1 アレクサ 647 | サーモフィッシャー | A21240 | |
| アンチマウス IgG1 ビオチン | サザンバイオテック | Cat# 1070-08;RRID: AB_2794413 | |
| 抗マウス IgG2b Alexa 488 | Thermo Fisher | A21121 | |
| 抗ウサギ Alexa 546 | Thermo Fisher | A11010 | |
| Aqua Poly/Mount | Polysciences | Cat# 18606-20 | |
| B27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | |
| BDNF | Peprotech | 450-02 | |
| bFGF | Life Technologies | 13256029 | |
| ウシ血清アルブミン (BSA) | Sigma-Aldrich | Cat# A9418 | |
| cAMP | Sigma Aldrich | D0260 | |
| C-Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 21331020 | |
| Dorsomorphin | Sigma Aldrich | P5499 | |
| EGF | Life Technologies | PHG0311 | |
| Fetal Bovine Serum | PAN Biotech | P30-3302 | |
| Forskolin | Sigma Aldrich | F6886 | |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | |
| gentleMACS Octo Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| GFAP | Dako | Cat# Z0334;RRID: AB_100013482 | |
| Glucose | Sigma Aldrich | G8769 | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050038 | |
| HBSS | Life Technologies | 14025050 | |
| Hepes | Life Technologies | 15630056 | |
| Lipofectamine 2000 (トランスフェクション試薬) | Thermo Fisher | Cat# 11668019 | |
| MACSスマートストレーナー70µm | Miltenyi Biotec | 130-098-462 | |
| MiniMACS セパレータ | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| マウス抗 ACSA-2 MicroBeat キット | Miltenyi Biotec | 130-097-678 | |
| マウス IgG1 抗シナプトフィジン 1 | シナプティックシステム | Cat# 101 011 RRID:AB_887824) | |
| マウス IgG2b 抗 Tuj-1 (βIII-tub) | Sigma Aldrich | T8660 | |
| MS カラム | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| N2 Supplement | Life Technologies | 17502048 | |
| Neural Tissue Dissociation Kit | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | |
| NT3 | Peprotech | 450-03 | |
| octoMACS セパレーター | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | |
| OptiMEM –GlutaMAX (血清還元培地) | サーモフィッシャー | Cat# 51985-026 | |
| ペニシリン/ストレプトマイシン | Life Technologies | 15140122 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma Aldrich | P1149 | |
| Rabbit anti-RFP | Rockland | Cat# 600-401-379;RRID:AB_2209751 | |
| ウサギ抗Sox9 | グマアルドリッチ | 猫#AB5535;RRID:AB_2239761 | |
| ストレプトアビジン アレクサ 405 | サーモフィッシャー | Cat# S32351 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | Cat# T9284 |
参考文献
- Johnson, T. S., et al. Spatial cell type composition in normal and Alzheimers human brains is revealed using integrated mouse and human single cell RNA sequencing. Scientific Reports. 10 (1), 18014(2020).
- Lake, B. B., et al.
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再版と許可
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