細胞培養またはマウス腫瘍モデルにおける化学療法薬によって誘導された老化癌細胞の蛍光フローサイトメトリー定量のためのプロトコルが提示されます。オプションの手順には、共免疫染色、大規模なバッチまたは時点分析を容易にするためのサンプル固定、およびフローサイトメトリーソーティングによる生細胞濃縮が含まれます。
このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。
この記事について
サマリー
要約
細胞老化は、生物学的損傷によって誘発される増殖性停止の状態であり、通常は老化した細胞で何年にもわたって発生しますが、さまざまな癌治療によって誘発される損傷への応答として腫瘍細胞に急速に現れることもあります。老化細胞は死に抵抗性になり、腫瘍の悪性度と治療抵抗性を悪化させながら腫瘍の寛解をブロックするため、腫瘍細胞の老化は一般的に望ましくないと考えられています。したがって、老化した腫瘍細胞の同定は、癌研究コミュニティにとって継続的な関心事です。様々な老化アッセイが存在し、その多くは、よく知られている老化マーカーである老化関連β−ガラクトシダーゼ(SA−β−Gal)の活性に基づいている。
典型的には、SA-β-Galアッセイは、固定細胞上の発色基質(X-Gal)を用いて行われ、光学顕微鏡による「青色」老化細胞のゆっくりとした主観的な列挙が行われる。C12-FDG(緑色)およびDDAO-ガラクトシド(DDAOG;遠赤色)を含む、細胞透過性の蛍光SA-β-Gal基質を使用した改良されたアッセイにより、生細胞の分析が可能になり、フローサイトメーターを含むハイスループット蛍光分析プラットフォームの使用が可能になりました。C12-FDGはSA-β-Galのプローブとして十分に文書化されていますが、その緑色蛍光発光は、リポフスチン凝集体の蓄積により老化中に生じる固有の細胞自家蛍光(AF)と重複しています。遠赤色のSA-β-GalプローブDDAOGを利用することにより、緑色の細胞自家蛍光を老化を確認するための二次パラメータとして使用でき、アッセイの信頼性が向上します。残りの蛍光チャネルは、細胞生存率染色またはオプションの蛍光免疫標識に使用できます。
フローサイトメトリーを使用して、老化した腫瘍細胞を同定するためのデュアルパラメーターアッセイとしてDDAOGとリポフスチン自家蛍光の使用を実証します。生細胞の割合の定量が行われる。所望により、目的の細胞表面抗原を評価するための任意の免疫標識ステップが含まれていてもよい。同定された老化細胞は、フローサイトメトリーで選別し、ダウンストリーム分析のために収集することもできます。集められた老化細胞は、直ちに溶解(例えば、イムノアッセイまたは'オミクス分析のために)またはさらに培養することができる。
概要
老化細胞は通常、通常の生物学的老化の間に何年にもわたって生物に蓄積しますが、放射線や化学療法を含むさまざまな癌治療によって誘発される損傷への応答として腫瘍細胞で急速に発達することもあります。もはや増殖しないが、治療誘発老化(TIS)腫瘍細胞は治療抵抗性に寄与し、再発を引き起こす可能性がある1,2,3。TIS細胞によって分泌される因子は、免疫回避または転移を促進することにより、腫瘍の悪性腫瘍を悪化させる可能性があります4,5。TIS細胞は、複雑な状況特異的な表現型、変化した代謝プロファイル、および独自の免疫応答を発達させます6,7,8。したがって、さまざまな癌治療アプローチによって誘導されるTIS腫瘍細胞の同定と特性評価は、癌研究コミュニティにとって継続的な関心事です。
TIS腫瘍細胞を検出するために、従来の老化アッセイが広く用いられており、主として老化マーカー酵素であるリソソームβ-ガラクト....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
プロトコル
記載されているすべての動物実験は、シカゴ大学の施設動物管理および使用委員会によって承認されました。
1.原液の調製と保管
注:細胞をフローソーティングする場合は、滅菌技術を使用してすべての溶液を調製し、0.22 μmフィルター装置でろ過する必要があります。
- DDAO-ガラクトシドのストック溶液をDMSO溶液5 mg/mLで調製します。チューブあたり50 μL(または希望する容量)で分注します。.-20°Cで暗所で最長1年間保管してください。
- バフィロマイシンA1のストック溶液をDMSO中で1 mMで調製します。チューブあたり50 μL(または希望する容量)で分注します。.-20°Cで最大6ヶ月間保管してください。
- カルセインバイオレット450 AMのストック溶液をDMSO溶液1 mMで調製します。チューブあたり50 μL(または希望する容量)で分注します。.-20°Cで暗所で最長1年間保管してください。
- 培養細胞を in vitroで処理するには、老化誘導剤の10 mM濃縮ストック溶液を適切な溶媒に調製し、0.2 μmシリンジフィルターを使用して滅菌します。-20°Cまたは製造元の指示に従って保管してください。
注:老化誘発化学療法剤 をin vivo (確立された腫....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
結果
SA-β-Galによる老化の検出について、DDAOGとX-GalおよびC12-FDGの比較可能性を実証するために、いくつかの実験が行われました。まず、X-Galを用いて、ETOにより誘導された老化性B16-F10メラノーマ細胞を染色した(図2A)。ETO処理細胞のサブセットでは濃い青色が発達しましたが、他の細胞はそれほど強くない青色染色を示しました。形態は、ほとんどのETO処理細胞で拡大した。ETO処理した細胞を蛍光SA-β-Gal基質C12-FDG(緑)またはDDAOG(遠赤色)で染色すると、X-Galと同等の染色パターンと強度の変動が示されました(図2B)。しかし、緑色のC12-FDG発光は細胞AFと重なり合い(図2C)、老化細胞17に蓄積することが知られている。対照的に、AFはDDAOGの遠赤色発光範囲では無視できる程度であった。
<.......アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
ディスカッション
過去10年ほどで、フローサイトメトリーは、腫瘍免疫学の人気の高まり、低コストのフローサイトメーターの開発、および学術機関での共有機器施設の改善により、癌研究においてより一般的なアッセイプラットフォームになりました。マルチカラーアッセイは現在標準であり、ほとんどの新しい機器には紫、青緑、赤から遠赤色の光学アレイが装備されています。したがって、このDDAOGプロトコルは、幅広いフローサイトメーターと互換性がある可能性があります。もちろん、どのフローサイトメーターもユーザーが評価する必要があります。蛍光色素(蛍光、コンジュゲート抗体など)をDDAOGアッセイに追加する場合は、特に注意が必要です。チャンネル間の蛍光色素クロストークの評価は、他のすべての関連チャンネルで可視化された単一染色コントロールを使用して実施する必要があります。オーバーラップが観察される場合、スペクトル補償は、典型的な方法に従って補正のために20 行うことができる。
ここに示されている知見は、DDAOGフローサイトメトリーアッセイが、細胞または腫瘍における化学療法薬によっ.......
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
開示事項
著者らは、この研究のために宣言する利益相反はありません。
謝辞
シカゴ大学のサイトメトリーおよび抗体コアファシリティには、フローサイトメトリー機器のサポートに感謝します。シカゴ大学の動物研究センターは動物の住居を提供しました。
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| バフィロマイシンA1 | 研究製品インターナショナル | B40500 | |
| ブレオマイシン硫酸塩 | ケイマン | 13877 | |
| ウシ血清アルブミン (BSA) | US Biological | A1380 | |
| Calcein Violet 450 AM 生存率色素 | ThermoFisher Scientific | 65-0854-39 | eBioscience |
| DPP4 抗体、PE コンジュゲート | バイオレジェン | 137803 | クローン H194-112 |
| 細胞株: A549 ヒト肺腺癌 | アメリカンタイプカルチャーコレクション | CCL-185 | |
| 細胞株:B16-F10マウスメラノーマ | アメリカンタイプカルチャーコレクション | CRL-6475 | |
| セルスクレーパー | コーニング | 3008 | |
| セルストレーナー、100&マイクロ;m | Falcon | 352360 | |
| DDAO-Galactoside | Life Technologies | D6488 | |
| DMEM medium 1x | Life Technologies | 11960-069 | |
| DMSO | Sigma | D2438 | |
| DNAse I | Sigma | DN25 | |
| ドキソルビシン、塩酸塩注射 (USP) | ファイザー | NDC 0069-3032-20 | |
| ドキソルビシン、PEG化リポソーム(USP) | Sun Pharmaceutical | NDC 47335-049-40 | |
| EDTA 0.5 M | Life Technologies | 15575-038 | |
| Etoposide | ケイマン | 12092 | |
| FBS | オメガ | FB-11 | |
| Fc受容体ブロッキング試薬 | Biolegend | 101320 | 抗マウス CD16/32 |
| フローサイトメーター (細胞分析装置) | ベクトン・ディキンソン (BD) | 各種 | LSRFortessa |
| フローサイトメーター (細胞ソーター) | ベクトン・ディキンソン (BD) | 各種 | FACSAria |
| GlutaMax 100x | Life Technologies | 35050061 | |
| HEPES 1 M | ロンザ | BW17737 | |
| リベラーゼTL | シグマ | 5401020001 | ロシュ |
| パラホルムアルデヒド 16% | 電子顕微鏡 | Sciences 15710 | |
| ペニシリン/ストレプトマイシン 100x | Life Technologies | 15140122 | |
| リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 1x | コーニング | MT21031CV | ダルベッコのPBS(カルシウムとマグネシウムを含まない) |
| レインボーキャリブレーション粒子、ウルトラキット | SpheroTech | UCRP-38-2K | 3.5-3.9 & マイクロ;m, 2E6/mL |
| RPMI-1640 medium 1x | Life Technologies | 11875-119 | |
| 塩化ナトリウム 0.9% (USP) | Baxter Healthcare Corporation | 2B1324 | |
| サイトメーターデータ取得用ソフトウェア, "FACSDiva" | Becton Dickinson (BD) | 該当なし | BDライセンス用 |
| サイトメーターデータ解析用ソフトウェア, "FlowJo" | TreeStar | 該当なし | ライセンスTreeStarに連絡する |
| プシン-EDTA 0.25% | ライフテクノロジー | ズ25200-114 |
参考文献
- Saleh, T., Tyutyunyk-Massey, L., Gewirtz, D. A. Tumor cell escape from therapy-induced senescence as a model of disease recurrence after dormancy. Cancer Research. 79 (6), 1044-1046 (2019).
- Wang, B., Kohli, J., Demaria, M. Senescent cells in cancer therapy: fri....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
再版と許可
