方法論記事

ウェスタンブロッティングを用いたニューロンK-Cl共輸送体KCC2の機能と活性の研究

DOI：

10.3791/64179

⸱

2022年12月9日

 ,  ,  , 
1Institute of Biomedical and Clinical Sciences, Medical School, Faculty of Health and Life Sciences, University of Exeter, Hatherly Laboratories

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本プロトコルは、ニューロンK-Cl共輸送体KCC2の機能と活性を研究するためのウェスタンブロッティング技術の適用を強調しています。このプロトコルは、ウェスタンブロッティング による キナーゼ調節部位Thr906/1007でのKCC2リン酸化の調査について説明しています。また、KCC2活性を確認するための追加の方法は、このテキストで簡単に強調されています。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

塩化カリウム共輸送体2(KCC2)は、ニューロンにのみ見られるカチオン塩化物共輸送体(CCC)の溶質キャリアファミリー12(SLC12)のメンバーであり、Cl- 恒常性の適切な機能とその結果としての機能的なGABA作動性阻害に不可欠です。KCC2の適切な調節の失敗は有害であり、てんかんを含むいくつかの神経疾患の有病率と関連しています。KCC2の調節に関与するメカニズムの理解に関してはかなりの進歩があり、研究者がその機能と活動を研究できるようにする技術の開発に認定されています。直接的(キナーゼ調節部位のリン酸化の評価)または間接的(GABA活性の観察およびモニタリング)調査 のいずれかを介して 。ここでは、キナーゼ調節部位(Thr906およびThr1007)でのKCC2リン酸化をウェスタンブロッティング技術を使用して調べる方法を強調しています。ルビジウムイオンやタリウムイオン取り込みアッセイなど、KCC2活性を直接測定するために使用される他の古典的な方法があります。パッチクランプ電気生理学などのさらなる技術を使用して、GABA活性を測定します。したがって、細胞内塩化物イオン恒常性の評価によって知らされた活性化および/または不活性化KCC2を間接的に反映します。これらの追加のテクニックのいくつかについては、この原稿で簡単に説明します。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

塩化カリウム共輸送体2(KCC2)は、ニューロンにのみ見られるカチオン塩化物共輸送体(CCC)の溶質キャリアファミリー12(SLC12)のメンバーであり、Cl-恒常性の適切な機能、およびその結果としての機能的なGABA作動性阻害に不可欠です1,2,3,4。KCC2による4-6 mMの低神経内Cl-濃度([Cl-]i)の維持は、脳および脊髄におけるγ-アミノ酪酸(GABA)/グリシンの過分極およびシナプス阻害を促進する5。KCC2の適切な調節の失敗は、てんかん4を含むいくつかの神経疾患の有病率と関連しています。さらに、KCC2を介したCl-押し出しの減少、および過分極GABAAおよび/またはグリシン受容体媒介電流の障害は、てんかん、神経因性疼痛、および痙縮に関係しています6,7。ニューロンKCC2は、リジンなし(WNK)-STE20/SPS1関連プロリン/アラニンリッチ(SPAK)/酸化ストレス応答性(OSR)キナーゼシグナル伝達複合体1によるC末端細胞内ドメイン内の主要な調節残基のリン酸化を介して負に調節され、未熟ニューロンにおける脱分極GABA活性の維持を促進します2,8,9.WNK-SPAK/OSR1は、スレオニン残基906および1007(Thr906/Thr1007)をリン酸化し、続いてKCC2のmRNA遺伝子発現を下方制御し、その結果、その生理学的機能を低下させます8,10。しかし、さらに重要なことに、WNK-SPAK/OSR1キナーゼ複合体がKCC2発現をリン酸化および阻害することが知られており1,2,4,11,12、およびThr906/Thr1007をリン酸化するキナーゼ複合体シグナル伝達経路の阻害がKCC2 mRNA遺伝子の発現増加と関連していることはすでに事実です13,14,15。.タンパク質リン酸化を介したニューロンKCC2およびNa+-K+-2Cl-共輸送体1(NKCC1)発現の調節は、同時に、逆のパターンで機能することに注意することが重要です1,4,16。

KCC2の調節に関与するメカニズムの理解に関しては、研究者がその機能と活動を研究できるようにする技術の開発に認定された、一貫したかなりの進歩がありました。直接的(キナーゼ調節部位のリン酸化の評価)または間接的(GABA活性の観察およびモニタリング)調査 のいずれかを介して 。ここで紹介するプロトコルは、キナーゼ調節部位Thr906/1007での共輸送体のリン酸化を調べることにより、ニューロンK+-Cl- 共輸送体KCC2の機能と活性を研究するためのウェスタンブロッティング技術の応用を強調しています。

ウェスタンブロットは、組織または細胞のサンプルから目的の特定のタンパク質を検出するために使用される方法です。この方法では、まず電気泳動によってタンパク質をサイズ別に分離します。次に、タンパク質を固体支持体(通常はメンブレン)に電気泳動で転写してから、特異的抗体を使用して標的タンパク質をマーキングします。抗体は、比色法、化学発光法、または蛍光法のいずれかを使用して検出されるさまざまなタグまたは蛍光色素標識抗体に結合されます。これにより、タンパク質の混合物から特定の標的タンパク質を検出することができます。この技術は、KCC1 のリン酸化特異的部位を特徴付けるために使用されており、KCC3 Thr991/Thr1048リン酸化を阻害するキナーゼ阻害剤を同定するために使用されています17。このプロトコルに従うことにより、細胞/組織溶解物から総リン酸化KCC2を特異的に検出することができます。原理的には、本手法によるタンパク質結合抗体の検出は、KCC2のリン酸化部位における協同活性の理解に役立ち、その生理制御に関わる分子機構の解明に大いに役立ちます。全タンパク質発現の定量分析は、KCC2の機能と活性を代表するものです。KCC2活性を直接測定するために使用される他の古典的な方法、例えばルビジウムイオンおよびタリウムイオン取り込みアッセイがある。パッチクランプ電気生理学などのさらなる技術を使用して、GABA活性を測定します。したがって、細胞内塩化物イオン恒常性の評価によって知らされた活性化および/または不活性化KCC2を間接的に反映します。

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プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

注:このプロトコルでは、目的の特定のタンパク質を検出するためのウェスタンブロッティング法について説明しています。

1. 細胞培養とトランスフェクション

  1. 細胞培養手順の前に、すべての試薬をビーズバス(37°C)で温めます。10%ウシ胎児血清、各1%2mM L-グルタミン1%、非必須アミノ酸100x、ピルビン酸ナトリウム100 mM、およびペニシリン-ストレプトマイシン100単位を添加した培養培地、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)を準備します。
  2. ヒト胚性腎臓293細胞(HEK293rnKCC2b)18 をビーズバス(37°C)中で安定にトランスフェクトしたラットKCC2bを完全に解凍する。細胞をクライオバイアルチューブから5 mLの新鮮な培地を含む遠沈管に移します。セルを1200 ×gで3〜5分間回転させます。
  3. アスピレーターピペット(真空ポンプに固定)を使用して上清を吸引し、10 mLの新鮮な培地を加えて細胞を再懸濁します。細胞懸濁液を10cmのディッシュプレートに移す。
  4. 皿をインキュベーターに入れ、加湿した5%CO2 雰囲気中で37°Cで48時間増殖させます。健康な細胞増殖を確実にするために潜伏期間を監視します。インキュベーション期間後に90%以上のコンフルエントに達した細胞をさらに分割します。
  5. 細胞皿から古い培地を吸引し、2 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で細胞を穏やかに洗い流します。2 mLのトリプシンを加え、室温で約1〜2分間インキュベートします。
  6. 2 mLの完全培地を使用して、ディッシュ内のトリプシン処理細胞を穏やかに洗浄します。9 mLの新鮮な培地を新しい皿に加え、古い皿から1 mLの溶液を新しい皿のそれぞれに加えます。スプリットセルディッシュをインキュベーターに48時間戻し、90%のコンフルエンシーを達成≥。
  7. 細胞を溶解バッファーで回収する前に、コントロールとしてジメチルスルホキシド(DMSO)、8 μMスタウロスポリン、または0.5 mM N-エチルマレイミド(NEM)のいずれかで15分間処理します。

2. 細胞ライセートの調製とサンプルのローディング

  1. 培養皿上の培地を吸引します(トランスフェクション手順から)。細胞培養物を氷上に置き、氷冷したPBSで細胞を洗浄します。
  2. PBSを吸引し、50 mMトリス塩酸塩(pH 7.5)、1 mMエチレングリコールビス(β-アミノエチルエーテル)-N,N,N′,N′-四酢酸(EGTA)、1 mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA)、50 mMフッ化ナトリウム、5 mMピロリン酸ナトリウム、10 mMナトリウム-β-グリセロリン酸、1 mMオルトバナジン酸ナトリウム、1%(w / v)トリトンX-100、0.27 Mスクロースを含む1 mLの氷冷溶解バッファーを加えます。 1 mMベンザミン、0.1%(v / v)2-メルカプトエタノール、および2 mMフェニルメチルスルホニルフルオリド(PMSF)をディッシュに。
    注:細胞回収時の溶解バッファーの容量はディッシュのサイズによって異なりますが、例えば、1 x 107 セル/100 mmディッシュ/150 cm2 フラスコあたり1 mLの溶解バッファーが適しており、5 x 106 セル/60 mmディッシュ/75 cm2 フラスコあたり0.5 mLが適しています。
  3. 冷たいプラスチック製のセルスクレーパーを使用して皿の底から細胞をこすり落とし、次にピペットを静かに使用して、細胞懸濁液をすでに氷上にあるマイクロ遠心チューブに移します。チューブを4°Cで30分間絶えず攪拌します。
  4. 細胞溶解物を16,000 x g の冷たい遠心分離機(4°C)で20分間回転させ、チューブを遠心分離機からそっと取り出して氷上に置きます。上清を予冷した新鮮なチューブに集め、ペレットを廃棄します。
    注:細胞の種類によっては、遠心分離力と時間を変える必要がある場合があります。ただし、一般的なガイドラインでは、16,000 x g で20分間遠心分離することを推奨しています。ただし、これは実験ごとに決定する必要があります。たとえば、白血球のような繊細な細胞には、非常に軽い遠心分離速度が必要です。

3. 細胞溶解液からの免疫沈降剤の調製

  1. 300 μLのタンパク質-G-セファロースをマイクロ遠心チューブにピペットで入れます。溶液を500 x g で2分間回転させ、上清を廃棄します。
  2. 500 μLのPBSを加え、溶液をよくボルテックスします。溶液を500 x g で2分間回転させ、上清を廃棄します。この手順を繰り返します。
  3. 1 mgの抗KCC2 Thr906および抗KCC2 Thr1007抗体を200 μLのタンパク質G-セファロースビーズと混合し、PBSで500 μLの容量に構成します。振動プラットフォームまたは回転ホイールで4°Cで2時間振とうします。 PBSで2回洗浄します。
  4. 細胞ライセート全体に対してタンパク質定量を行い、洗浄したビーズに1 mgの細胞ライセートを加えます。エンドツーエンドのローテーターで4°Cで2時間穏やかにインキュベートします。 ビーズをスピンダウンし、150 mM塩化ナトリウム(NaCl)を含むPBSで3回洗浄します。
  5. 免疫沈降剤(ビーズ)を200 μLのPBSで3回洗浄します。最終ペレットを100 μLの1xドデシル硫酸リチウム(LDS)サンプルバッファーに再懸濁します。
  6. チューブをローターシェーカーで室温で5分間振とうし、75°Cの加熱ブロックで10分間インキュベートします。ローディングサンプルを11,000 x g で2分間遠心分離し、上清をゲルローディングに使用します。

4. ウェスタンブロットの実行

  1. キャスティング装置を組み立て、新しく調製した8%分離ゲル(レシピ/準備については 表1 を参照)を注ぎ、キャスティンググラスの上部から約2cmのスペースを確保してゲルをキャストします。200 μLの無水イソプロパノールをセットアップに加え、室温で60分間放置します。
    注:ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)のポリアクリルアミドゲルレシピは、目的のタンパク質のサイズによって異なります(表2)。したがって、目的のゲルパーセンテージを決定する前に、タンパク質のサイズをメモしてください。
  2. ピペットを使用してイソプロパノールを除去し、約200μLの蒸留水でゲルを注意深くすすぎます。新しく準備した6%スタッキングジェル(レシピ/準備については 表1 を参照)を追加して、キャスティングセットアップの約2cmのスペースを埋めます。ウェルコームにそっとはめ込み、室温で30分間放置します。
  3. キャストしたゲルを電気泳動タンクに固定します。
  4. トリス塩基30.3 g、グリシン144.1 g、SDS10 gを蒸留水1000 mLに溶解し、10xトランスファーバッファーを調製します。10 mLの10%SDSと100 mLの10xトランスファーバッファーを890 mLの蒸留水に加えて、1xランニングバッファーを調製します。
  5. 1xランニングバッファーをタンクに注ぎます。5 μLの分子量マーカーを最初のウェルにロードし、等量のタンパク質をSDS-PAGEゲルの各ウェルにロードします(使用するコームサイズに応じて18〜30 μL)。空のウェルを1x LDSで満たし、120 Vで約90〜120分間ゲルを実行します。
  6. 58.2 gのトリス塩基と29.3 gのグリシンを1000 mLの蒸留水に溶解し、10xトランスファーバッファーを調製します。20%メタノールを含む1xトランスファーバッファーでニトロセルロースメンブレンを活性化します。ゲルとメンブレンをトランスファーバッファーですすぎ、準備スタックに静かに広げます。
    注:ランニングバッファーとトランスファーバッファーのpHは、必要な最適なpHにする必要があるため、調整する必要はありません。また、時間を節約するために、実験の前にこれらのバッファーを準備して室温で保存することをお勧めします。
  7. 転写するサンドイッチを、負極(黒枠/端)-サンドイッチフォーム-ろ紙-すすぎSDS-PAGEゲル-すすぎニトロセルロースメンブレン-ろ紙-サンドイッチフォーム-正極(赤枠)の順に並べます。組み立てたサンドイッチをトランスファータンクに積み重ね、90Vで90分間、または30Vで360分間運転します。

5. 抗体染色と画像現像

  1. 膜を取り外して乾かします。0.1%の1x Tween 20(1x TBS-T)を含むトリス緩衝生理食塩水中の5%スキムミルクから作られたブロッキングバッファーを使用して、室温で1時間メンブレンをブロックします。
  2. 一次抗体8,15,19およびβ-アクチン(ローディングコントロール)の適切な希釈液を用いてメンブレンをブロッキングバッファー中で室温で1時間、または4°Cで一晩インキュベートします。 1x TBS-Tの3回の洗浄でメンブレンをそれぞれ5分間洗浄します。
    注:β-アクチン、α-チューブリン、またはグリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ抗体などのローディングコントロールを使用した個別のメンブレンのインキュベーションは、その後の定量中に他のウェスタンブロッティング結果を正規化することです。各一次抗体の推奨希釈率は、メーカーのマニュアルに記載されています。
  3. 洗浄したメンブレンをブロッキングバッファーで5000倍に希釈した二次抗体とともに室温で60分間インキュベートします。再度、メンブレンを1x TBS-Tでそれぞれ5分間3回洗浄します。
    注:二次抗体は、一次抗体が産生される種に対して産生させることを強くお勧めします。例えば、総KCC2の一次抗体がマウス抗KCC2である場合、抗マウスの二次抗体を使用する必要があります。
  4. 洗浄したメンブレンをイメージングボードに置きます。各増強化学発光(ECL)試薬を等量混合し、混合溶液をメンブレン上に穏やかに広げてシグナルを発生させます。

6. イメージングシステムによる画像取得とデータ定量化

  1. イメージングボードをイメージングシステムの適切なコンパートメントに移してイメージングします。画像処理のためにコンピュータ上のイメージングソフトウェアを開きます。
  2. ツール バーで、[新しいプロトコル] をクリックし、[シングル チャネル] を選択します。ゲルイメージング/アプリケーションダイアログボックスで選択をクリックし、ブロットまでスクロールして、ケミハイ感度またはケミハイ解像度のいずれかを選択します。次に、[信号蓄積設定]をクリックして、取得する画像の持続時間と数を設定します。
  3. プロトコル設定の下にある Position Gel をクリックし、必要に応じてイメージングシステムでゲルを調整します。[ プロトコルの実行 ] をクリックしてイメージを取得します。
  4. イメージングカタログボックスの下にある集録画像の1つを右クリックして、画像をコンピュータに保存します。目的の画像に移動し、[実行]ダイアログボックスの[ 画像の選択と続行 ]をクリックします。
  5. 画像変換アイコンをクリックして、画像のコントラストとピクセル彩度を調整します。一般ツールバーのスクリーンショットアイコンをクリックして、目的の画像形式に応じて画像をコンピューターに保存します。
  6. ImageJソフトウェアを使用してバンド密度を測定し、適切な統計ツールを使用して分析します。

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結果

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ここでは、図1に示す代表的な結果を、ウェスタンブロッティング技術を用いて、KCC2b(HEK rnKCC2b)18を安定発現するHEK293細胞株におけるWNK-SPAK/OSR1を介したKCC2およびNKCC1のリン酸化に対するスタウロスポリンおよびNEMの影響を調査した。代表的な結果に関する包括的な詳細は、Zhang et al.15で議論されている。NEMと同様に、スタウロスポリンは、KCC2輸送活性を増強し、NKCC1活性を阻害することができる広範なキナーゼ阻害剤である15,20。HEK293細胞をスタウロスポリンおよびNEMで処理すると、SPAK標的部位(Tループキナーゼドメインに位置するThr233およびhsSPAKのSループリン酸化部位Ser373)でのリン酸化が低下しました。したがって、両方の化合物は、前述のSP...

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ディスカッション

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KCC2を含むニューロンで発現されるCCCのSLC12の活性を測定するために多くの方法が用いられてきた。これらの技術の多くは、これらのトランスポーターの機能的関連性と、さまざまな疾患関連変異におけるそれらの構造機能パターンの分析に関する科学的知識を強化することが証明されています。重要なことに、さまざまな方法21には利点と注意点があります。しかし、上記のプロトコルでは、KCC2の機能と活性の研究に役立つウェスタンブロットを使用して、キナーゼ調節部位であるThr906およびThr1007でのKCC2リン酸化を評価する方法を概説しています。

KCC2の調節は、重要なセリン/スレオニン残基1でのリン酸化および脱リン酸化によって起こります。ウェスタンブロッティングは、Thr906およびThr1007のキナーゼ調節部位におけるKCC2リン酸化を調べるために使用できる効率的な技術です。原則として、KCC2のリン酸化の変化は、目的のイムノブロットサンプル/タンパク質のリン酸化ペプチドに対するリン酸化特異...

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は開示するものは何もありません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この研究は、英国王立協会(助成金番号IEC\NSFC\201094)、および連邦博士号奨学金によってサポートされました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
40% アクリルアミドSigma-AldrichA2917SDS-PAGE 
硫酸アンモニウムSigma-Aldrich248614SDS-PAGE用の分離およびスタッキングゲルの製造に使用されます 
抗pSPAKダンディー大学S670Bウェスタンブロッティング
抗KCC2ダンディー大学S700Cウェスタンブロッティング
pSer940サーモフィッシャーサイエンティフィックPA5-95678ウェスタンブロッティング
pThr1007ダンディー大学S961Cウェスタンブロッティング
抗KCC2 pThr906ダンディー大学S959Cウェスタンブロッティング抗マウスの一次抗体として使用
Cell Signalling technology66002ウェスタンブロッティング
抗NKCC1ダンディー大学S841Bの一次抗体として使用
pThr203/207/212ダンディー大学S763Bウェスタンブロッティング
抗ウサギシグナル技術C29F4ウェスタンブロッティング
抗ヒツジabcamab6900ウェスタンブロッティング抗SPAKの二次抗体として使用
ダンディー大学S669Dウェスタンブロッティング
の一次抗体として使用抗β;-Tubulin IIISigma-AldrichT8578ウェスタンブロッティングの一次抗体として使用
ベンザミンMerck UK135828溶解バッファーの成分として使用
β-メルカプトエタノールSigma-AldrichM3148ローディングバッファーおよび溶解バッファーの成分として使用
Bradford CoomasieThermo Scientific1856209ライセートタンパク質の定量に使用
鋳造装置アト WSE-1165WSDSページ電気泳動の実行に使用
遠心分離機エッペンドルフ5804ライセート調製に使用
遠心分離機 VWRMicroStar 17Rサンプルの紡糸に使用
ジメチルスルホキシド(DMSO)Sigma-AldrichD2650-100ML細胞培養実験に使用
乾燥スキムミルクマーベルN/Aブロッキングに使用バッファー
ダルベッコのモディファイドイーグルズミディアム-高グルコースSigma-AldrichD6429細胞培養
に使用 ECL試薬Perkin ElmerORTT755/2655ウェスタンブロッティングのイメージ開発に使用
EDTAフィッシャーサイエンティフィックD/0700/53溶解バッファーEGTAの成分として使用
Sigma-Aldriche4378溶解の成分として使用バッファ
電気泳動電源BioRadPowerPAC HCSDSページ電気泳動を実行するための電源を供給するため
エタノールサーモフィッシャーE/0650DF/17滅菌機器と環境の準備に使用
ウシ胎児血清 -  熱不活性化メルクライフサイエンスUKF9665細胞培養に使用
フュームフードウォーカーA7277細胞培養に使用
ゲルブロッティング - WhatmanGE Healthcare 10426981ウェスタンブロッティングでトランスファーサンドイッチを作るために使用
GlycineSigma-Aldrich15527バッファーを作るために使用
GraphPad Prism SoftwareGraphPad Software, Inc., USAVersion 6.0のグラフのプロットとデータの分析に使用   ウェスタンブロッティング
HClAcros Organics10647282SDS-PAGE用のセパレーションゲルとスタッキングゲルを作るために使用 
ヒーティングブロックグラントQBT1WBローディングサンプルの加熱に使用
HEK293細胞メルク UK12022001-1VL培養実験用細胞株
ImageJ SoftwareWayne Rasband and Contributors;NIH、米国 ImageJ 1.53eウェスタンブロッティング画像からバンド強度の測定に使用
イメージングシステムBioRadChemiDoc MPウェスタンブロッティング画像の取得に使用
インキュベーターLEEC LEEC 精密 190D細胞培養に使用
イソプロパノールハネウェル24137電気泳動用キャスティングゲルに使用
L-グルタミン溶液Sigma-AldrichG7513細胞培養に使用
ドデシル硫酸リチウム(LDS)NovexNP0008ウェスタンブロッティングMEM用ローディングバッファーとして使用
非必須アミノ酸 Merck Life Sciences UKM7145細胞培養に使用
微量遠心分離機Eppendorf5418ライセート調製に使用
BioRadiMarkライセートタンパク質濃度の読み出しに使用
Microsoft PowerpointMicrosoft, USAPowerPoint2016ウェスタンブロッティング画像の編集に使用
分子量マーカーバイオラッド1610373ウェスタンブロッティングに使用
N-エチルマレイミドサーモフィッシャーサイエンティフィック23030細胞培養実験に使用
ニトロセルロースメンブレンフィッシャーサイエンティフィ45004091ウェスタンブロッティングに使用
ペニシリン-ストレプトマイシンギブコ15140122細胞培養に使用
pHメーターメトラー・トレド・セブンコンパクトs210緩衝液のpHのモニターに使用
フェニルメチルスルホニルフッ化物(PMSF)Sigma-AldrichP7626溶解緩衝液の成分として使用
リン酸緩衝液生理食塩水Sigma-AldrichD8537細胞培養に
使用 PKCδ pThr505細胞シグナル伝達技術9374ウェスタンブロッティングの一次抗体として使用
ファロースプロテイン GジェネロンPG50-00-0002免疫沈降に使用
塩化ナトリウムSigma-AldrichS7653洗浄バッファーの成分として使用
塩化ナトリウムSigma-AldrichS7653TBS-Tバッファーの調製に使用
ドデシル硫酸ナトリウムSigma-AldrichL5750SDS-PAGEのセパレーションおよびスタッキングゲルの製造に使用 
オルトバナジン酸ナトリウムSigma-AldrichS6508溶解緩衝液の成分として使用
ピルビン酸ナトリウムSigma-AldrichS8636細胞培養に使用
ナトリウム-&β;-グリセロリン酸メルクUKG9422溶解緩衝液の成分として使用
スタウロスポリン(Streptomyces sp.)Scientific Laboratory Supplies, UKS4400-1MG細胞培養実験に使用
ショ糖Scientifc Laboratory SuppliesS0389溶解バッファーの成分として使用
TEMEDSigma-AldrichT7024SDS-PAGEの分離およびスタッキングゲルの製造に使用 
トランスファーチャンバーBioRad1658005EDUウェスタンブロッティングでメンブレン上のタンパク質を転写するために使用されます
TrisSigma-AldrichT6066SDS-PAGE 
Triton-X100Sigma-AldrichT8787溶解バッファーの成分として使用
トリプシン-EDTA溶液Merck Life Sciences UKT4049細胞培養に使用
Tween-20Sigma-AldrichP3179TBS-Tバッファーとして使用
真空ポンプチャールズ・オースティン・ダイマックス5細胞培養に使用
ボルテックス・サイエンティフィック・インダストリーズK-550-GEサンプル調製に使用
ボルテックスミキサーScientific Industries LtdVortex-Genie K-550-GE分離した試料の混合に使用
ウォーターバスグラントインスツルメンツ株式会社(JBアカデミー)JBA5溶液のインキュベーションに使用
の一次抗体として使用 抗KCC2の一次抗体として使用 抗KCC2の一次抗体として使用 の二次抗体として使用 ウェスタンブロッティング抗NKCC1細胞の一次抗体として使用 の二次抗体として使用 WBマイクロプレートリーダーのック セ

参考文献

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