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方法論記事

ブタ膵臓移植を行うための外科的ヒントとコツ

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DOI:

10.3791/64203

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2022年7月20日

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1Ajmera Transplant Centre, University Health Network, Toronto general hospital, 2Department of general, visceral, and transplantation surgery, University Hospital Essen

この記事について

サマリー

ビデオ記事は、ブタの3日間の生存モデルにおける膵切除術と膵臓同種移植の技術を要約し、方法の段階的な説明と、不安定で繊細なブタの内臓解剖学的構造に対処するための外科的ヒントとコツに重点を置いています。

要約

1型糖尿病とメタボリックシンドロームにおける膵臓移植の有望な結果にもかかわらず、この最先端の技術に関する最大の懸念は、移植に適していると見なされる臓器の不足のままです。高い血管内抵抗、繊細な実質内毛細血管フレームワーク、および腸間膜血管系の周りの複雑な小葉解剖学的構造は、肝臓や腎臓などの臓器と比較して、この臓器を損傷しやすく、些細な外傷に対する耐性が低いものにしています。綿密な外科的解剖と慎重な組織取り扱いは、膵臓移植の運動全体の基礎を形成します。ブタの膵臓の解剖学的構造と周囲の腸間膜血管および臓器との間の形態学的類似性のために、ブタモデルにおける技術のデモンストレーションは、これを人間の設定に最も正確に外挿するのに役立つ可能性がある。本稿は、ブタの3日間生存モデルでこの非常に感受性の高い臓器の移植の成功率を高めるために、従う必要のある重要な外科的ヒントとトリックを概説することを目的としています。

概要

過去数十年にわたって、周術期管理戦略と外科的技術が大幅に進歩し、膵臓移植は末期腎疾患を伴う糖尿病の治療のための最も有望な戦略の1つに進化しました(通常は腎臓移植と組み合わせて)1。.しかし、移植片膵炎、虚血再灌流障害、血管血栓症などの合併症は、成功した結果を確実にするために克服すべき最大の課題であり、より損傷した拡張基準グラフトではなおさらです2。さらに、膵臓移植片は調達から最も一般的に廃棄される移植片であり、どの臓器でも利用率が最も低い(9%)3。したがって、機械灌流は、肝臓、腎臓、および肺移植で達成されたものと同様に、移植片利用率を高めることを目的として、膵臓移植片に最適な恒常性環境を提供することを目的としています4。ブタの膵臓の解剖学的構造は、その小葉構造(3つの葉を含む)、腸間膜門脈軸の周りのその延長、その腸間膜血管の変化(40%〜50%)、および十二指腸のCループに沿ったその繊細な血管チャネルの点で複雑です5。これらの解剖学的属性は、医原性膵臓無蓋糖尿病状態、すなわち空腹時血糖値が8 mmol / Lを超える外科的に誘発された糖尿病状態を誘発するための膵臓十二指腸移植片およびレシピエント膵切除術の両方の困難な解剖に寄与する。 これらの特徴に基づいて、移植を伴うブタ膵切除術は、末期に対する決定的な治療としてヒトで行うことができる技術の可能な限り最も近い複製を提供します 糖尿病。本稿は、以下の側面をカバーすることを目的としています:(i)レシピエント膵切除術および膵臓移植移植中の周術期ブタケアの概要。(ii)レシピエント膵切除術および膵十二指腸移植片の移植の技術的段階の詳細、および(iii)移植片およびレシピエントの損傷を最小限に抑えるためのブタモデルにおけるドナーおよびレシピエント膵臓手術のヒントおよびコツ。

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プロトコル

プロトコルは、トロント総合研究所の動物管理委員会から倫理的承認を受けました。動物は、カナダのオンタリオ州にある国立衛生研究所(NIH)の実験動物の世話のための全米医学研究協会およびガイドに準拠して人道的なケアを受けました。この研究では、体重40〜50 kgの15週齢の無関係なヨークシャーの雄豚を使用しました。

注:研究のプロトコル全体は、次の主要なステップに分かれています:(i)臓器回収とバックテーブルの準備;(ii)レシピエント全摘除術および(iii)移植片移植。ドナーとレシピエントの手術全体は1日で行われます。

1.ドナー臓器回収とバックテーブルの準備

注:臓器検索の方法は、別のプロトコル6に記載されています。ただし、プロトコルは、簡単に言えば、外科的技術に固有のいくつかの追加の持ち帰りポイント(ドナー操作に関連する外科的ヒント)とともにここで説明されています。

  1. 簡単に言えば、ドナーブタに麻酔をかけ、気道と中心静脈カテーテルを固定します(レシピエント膵切除術のセクションで後述)。内臓を切開して露出させます。腸骨血管への分岐まで大動脈解離と動員を行います。
  2. 腸の取り扱い:ブタの小腸は長く曲がりくねっており、大腸はほとんど膨満しています。適切な灌流を確保し、腸間膜捻転の可能性を回避するために、ドナー手術の各ステップの後に腸ループを解剖学的位置に再配置するようにしてください。
  3. 肺門解剖:動脈枝と胆管を結睭化して分割し、門脈を露出させます。膵十二指腸領域の優れた側面に灌流する小さな血管チャネルを傷つけるリスクを回避するために、丘(肝十二指腸靭帯)をできるだけ高く/遠位に解剖します。門脈の前面がむき出しになるまで、右から左の順序で血管のスケルトン化を開始します。
  4. 大動脈盆解離:横隔膜クルラを分割することにより、大動脈の肝上横隔膜下部分を露出させます。膵十二指腸林周辺の下大静脈の解剖は避けてください。両側の腎動脈を解剖の顕著な上限として使用します。
  5. 小嚢を開いて膵臓を露出させます。腎動脈を結睦して分割します。腎下大動脈をカニューレ挿入し、ウィスコンシン大学(UW)の溶液に接続してフラッシングします。
  6. 肝上大動脈とクランプを結睭化します。腸と膵臓の適切な紅潮を確実にするために、1.5 L-2 LのUW溶液で洗い流します(蒼白の視覚的外観によって明らかです)。臓器の その場 洗浄中に、小腸と大腸を正中線に順番に再配置し、腸間膜のねじれがないようにします。このステップは、UW(ウィスコンシン大学)溶液で腸と膵臓の均一な洗浄を確実にし、覚えておくことが重要です。
  7. フラッシュを開始した後、門脈と肝下大静脈を同時に切開して静脈排水を排出します。冷たい灌流を確実にするために腹部を氷で覆います。臓器(後腹膜、腰筋、脾臓、副腎の一部を含む膵十二指腸移植片) をまとめて解剖します。
  8. 寒冷解剖:膵臓と大腸の間の筋膜の鋭い解剖によって、膵臓の尾から頭とコーパスの間の接合部まで、横方向から内側方向への移植片の動員を開始します。このステップを実行している間、鉗子で後腹膜を覆うことによって膵臓を持ち、足に向かって大腸に逆引くようにアシスタントに依頼します。
  9. 腸間膜クランプ:膵臓のコーパス、十二指腸空腸ループ、および大腸の周りの薄い組織を分割した後、アシスタントに腸間膜茎の周りをループし、大腸ループを尾側に引っ張るように依頼します。これにより、腸間膜の描写とクランプの安全な配置が保証され、膵実質を傷つけることなく腸間膜の主要血管を順番に分割できます。
  10. 移植片の完全な腹膜外解剖:腸間膜血管を分割した後、副腎筋膜、副腎、IVCのカフ、腰筋、横隔膜を含む膵外組織を分割して、反時計回りに内側から外側に解剖することによって移植片の回収を開始します。上腸間膜動脈とセリアック動脈を傷つけないように、大動脈から適切な平面を確保してください。
  11. 氷上でバックテーブルの準備を行います。臓器をアイスボックス(冷虚血時間5時間)に保管する。

2.レシピエント膵切除術

  1. 術前の準備
    1. 規定の誘導時間の前に少なくとも6時間動物を絶食させる。ミダゾラム(0.15 mg / kg)、アトロピン(0.04 mg / kg)、およびケタミン(25 mg / kg)を含む注射を皮下(SC)に投与し、動物を手術室(OR)に輸送する15分前に投与します。.ORへの輸送の15分前にブプレノルフィン0.3 mg徐放性注射SCを投与します。.
    2. ポジショニング:動物を手術台に仰臥位に置き、前肢を利用して手術中の安定した位置を確保します。
    3. 気道と誘導:パルスオキシメータプローブを接続し、心拍数とO 2飽和度を監視しながら、毎分3%〜5%イソフルランと2 〜3 Lの酸素を含むバッグとマスクを使用して動物を換気します。
    4. 顎の弛緩と安定した酸素飽和度と心拍数によって確認された適切な弛緩の後、動物の弛緩した上顎と下顎で十分な牽引力で口を開いたままにし、喉頭鏡を使用して声帯を視覚化するようにアシスタントに依頼します。2%のリドカインをスプレーして声帯をリラックスさせ、挿管によるけいれんを防ぎます(ブタの声帯は非常に血管性が高く壊れやすいです!
    5. 7 mmの気管内チューブを使用して挿管し、3〜5 mLの空気を使用してカフを膨らませます。潮汐終末CO 2(ETCO2)プローブを使用してチューブの位置を確認し、チューブを人工呼吸器に接続し、毎分14〜16回の呼吸で、10〜15 mL / kgの一回換気量を達成します。吸入麻酔の維持用量としてイソフルランを2.5%に下げる。
    6. 静脈内ライン:ベタジンで手術部位を無菌的に準備し、滅菌ドレープを置きます。次に、乳様突起、肩峰突起、鎖骨頭の間に形成された三角形の重心である中心静脈カテーテルを配置するランドマークを特定します。16 Gの針を使用して静脈に穴を開けます。色と脈動性の欠如から明らかな静脈血の自由な流れを確保した後、セルディンガー法を使用してガイドワイヤーを導入します。
    7. 付属の拡張器を使用して管を拡張します。ガイドワイヤーと拡張器を8.5 x 10 Frカテーテルと交換し、0-0シルク縫合糸切断針で縫合して所定の位置に固定します。IVラインをセファゾリン(1 gm)とメトロニダゾール(500 mg)を含む静脈内抗生物質に接続し、続いて10 mL / hの割合でプロポフォール注入によって静脈内麻酔を行います。
    8. 侵襲的血圧モニタリング:ベタジンで手術部位を無菌的に準備した後、滅菌ドレープを置き、正中線から2cmの気管に平行に切開します。胸骨乳突筋と傍気管筋膜の線維を、Laheyの直角鉗子と止血鉗子を使用した鈍的解剖により解剖します。
    9. ストラップ筋肉の線維の外側の頸静脈を特定し、上記のように鈍的解剖を使用して頸動脈の内側に区画化する筋肉に沿って解剖します。動脈は、その脈動、質感(紐状)、および血管周囲神経叢によって識別します。容器を動員し、2つのシルク2-0ネクタイを使用してそれをスリングします。
    10. 斜めの先端が上を向いている16G血管カテーテルで血管を穿刺し、血管の中にインナースタイレットを引き出します。セルディンガー技術を使用して外側のカテーテルシースをスライドさせ、出口を動脈血圧(BP)測定システムに接続します。侵襲的血圧モニターを接続する前に、読み取り値をゼロに調整して正確な記録を確保し、シルクタイを使用してカテーテルを所定の位置に固定します。
    11. 温度監視と加温:温度記録プローブを口頭に置きます。動物をベアハガー加熱羽毛布団で覆い、37〜38°Cの温度を確保します。 中性眼潤滑剤ゲルで目を滑らかにします。手術野のペイントとドレープ
  2. 手術
    注:皮膚は、ベタジンスクラブを使用してすべての外科的処置のために無菌的に調製され、その後滅菌ドレープが配置されます。
    1. 切開と露出:ボビーの電気焼灼の純粋な切断モードを使用して、剣胸骨から恥骨結合まで正中線を切開します。怪我をしないように、男根を越えた切開部の下部の尿道の外側を維持するようにしてください。手術野の露出を最適化するために、脾臓と肝臓を傷つけないように注意して自己保持腹壁リトラクターを配置します。
    2. 膵臓頭の動員:アシスタントが膵十二指腸グローブにカウンタートラクションを提供して、膵実質(十二指腸葉)と肝下IVCの間の無血管筋膜面に沿って解剖することから始めます。
    3. 膵臓リング動員:ブタの膵臓は、腸間膜門脈軸(接続葉)の周りにリングを形成します。門脈(PV)のいずれかの側面で筋膜に沿って解剖し、上にあるPVからの接続葉の完全な動員を確実にします。最も安全な方法は、門脈の両側に沿って解剖を開始し、組織を時計回りまたは反時計回りに円周方向に分離することです。
    4. 膵尾部の動員:次に、膵臓組織と副腎組織の間の接合部(白い線として見える)を特定し、実質の近くにとどまっている下にある脾静脈から尾を解剖し始めます。絹の3/0ネクタイを使用して脾静脈を傷つけないように注意しながら、実質への小さな静脈支流を結睦して分割します。
    5. 膵臓コーパス動員:実質を大腸および胃から分離する組織の薄層に沿って解剖し、幽門下領域に沿って薄い血管アーケードを保存するように注意します。
    6. 膵十二指腸動員:次に、十二指腸のCループに沿って薄い血管アーケードを保存するように注意しながら、牽引カウンター牽引による膵臓-十二指腸林の鋭い解剖によって十二指腸のCループから実質を分離します。
    7. 膵管の分割:膵管を特定し、絹の2-0タイで結紮し、十二指腸Cループ上の管の約3〜5 mmの切り株を維持しながら分割し、十二指腸血管アーケードから離れます(管と密接に関連しています)。
    8. 標本の除去:門脈の両側にある接続葉、十二指腸、結腸の間の接合部から実質を解剖することにより、動員の最後の部分を完了します。PVの前方で接続ローブを分割することにより、標本を まとめ て抽出します(図1)。実質の分割は、PVの周りの円周方向の位置のために標本を抽出するために必要です。
    9. 解剖領域に沿って止血を確認し、十二指腸に損傷や血管のうっ血がないか検査します(図2)。
  3. 膵十二指腸移植片の移植
    1. 移植片の準備:吻合のために端をトリミングすることにより、移植片PVと近位大動脈端を準備します。調製した移植片を氷浴上のUW溶液と共に臓器バッグに入れる。膵臓の尾部からコア針生検を採取し、ホルマリンに保存し、スナップフリーズし、後の段階でRNAを抽出します。Prolene 6-0を使用して生検部位を8の字の方法で縫合します。
    2. 大動脈解離:右尿管を特定することから始め、下大静脈の上の後腹膜カバーから尿管を分離する筋膜に沿って解剖します。大動脈の外側の境界に沿って解剖し、下にある大動脈筋からそれを露出させます。次に、大動脈間グローブに沿って解剖し、大動脈をIVCから分離します。
    3. クランプテスト:サティンスキーの血管クランプ配置の試行により、大動脈とIVCの適切な動員を確保します。最初のアシスタントと位置を切り替え、左側の腸ループを引っ込めて吻合のために主要な血管を露出させることで手術野を準備します。IVCと大動脈にトライアルクランプを配置して、吻合のための両方の血管の適切な動員を再評価します。
    4. 静脈吻合:血管側噛みクランプをIVCに配置した後、血管の前壁に小さな開口部を作り、ポットのハサミを使用して頭蓋側と尾側に適切なサイズ(移植血管と一致する)に拡張します。IVカニューレの柔軟なシースを使用して、ヘパリン化生理食塩水で内腔を洗い流します。
    5. Prolene 6-0ダブルニードルを使用して、IVC(インサイドアウト)と移植門脈(インサイドアウト)にコーナー縫合を行います。尾角縫合糸を固定し、移植片とレシピエント静脈の後壁に沿って針の1つを連続的に走らせます。同様の(外側の連続的な)方法で前壁を固定し、ヘパリン化生理食塩水で吻合の内腔を洗い流した後、前壁の中央に結び目を固定します。
    6. 静脈のクランプ解除:ブルドッグの血管クランプをグラフト門脈に置き、吻合から離し、側噛みクランプをレシピエントIVCからゆっくりと解放します。静脈の補充と吻合による大きな出血がないか確認してください。
    7. 動脈吻合:血管の後壁に沿って腰椎の枝を傷つけないように注意しながら、大動脈に側噛みクランプを配置します。麻酔科医に、中心静脈カテーテルからヘパリン(100 U / kg BW)とメチルプレドニゾロン(500 mg)を注射するように指示します。
    8. 血管の前壁に開口部を作り、血管壁に沿って解剖しないように注意しながら、頭蓋側と尾側に伸ばします。内腔をヘパリン化生理食塩水で洗い流し、Prolene 6-0ダブルニードルを使用して、移植片大動脈の近位端をパラシュート技術によって連続的にレシピエント大動脈開口部に縫合します。血管の前壁に最後の結び目を結ぶ前に、ヘパリン化生理食塩水で内腔を洗い流します。
    9. 再灌流:この手順を実行する際には、次の2つの側面に注意してください。第一に、平均血圧の劇的な低下が起こる血行力学的変化。侵襲性血圧を分単位で監視し、昇圧剤の用量滴定(ノルエピネフリン注入)を実行し、液体プリロードを実行して、目標平均血圧を45〜50mmHgに保ちます。
    10. 第二に、止血を維持します。ブルドッグクランプを静脈から取り外した後、実質、傍大動脈領域、および門脈周囲領域からの大きな出血を評価します。次に、大動脈クランプを解除し、動脈吻合部位からの出血を確認します。結紮糸と止血縫合で出血点を固定します。麻酔科医に、中心静脈カテーテルを通してトラネキサム酸のバイアルを注入するように依頼します。
      注:重要なルールは、再灌流のこの段階での膵臓の積極的な取り扱いを最小限に抑えることです(移植片浮腫と血腫を避けるため)。
    11. 腸吻合:腸間膜捻転がないことを確認した後、十二指腸接合部から40〜50 cm離れた空腸のループを分離し、移植片に近づけます。ポリジオキサノン4-0縫合糸を使用して、移植片十二指腸をレシピエント空腸に左右に連続的に吻合し、1.5〜2cmの適切な管腔直径を確保するように注意します。
    12. 止血および再灌流後の生検:移植片の周囲および吻合部位での止血を確実にする。再灌流後1時間で膵尾部から3本のコア針生検を行い、ホルマリンに保存し、スナップフリーズし、後の段階でRNAを抽出します。生検部位をプロレン6-0で8の字状に縫合する。
    13. 腹壁閉鎖:モップの保持を評価し、止血を確保した後、ポリジオキサノン0針を使用して腹直筋を連続的に縫合し、尿道から遠ざけるために下正中線に注意を払います。シルク0縫合糸を連続的に使用して皮膚を閉じる。
      注意: 理想的には、モノフィラメント縫合糸(ナイロン)をお勧めします。ただし、これは3日間の生存モデルであるため、これらの実験モデルでは絹が許容されます。
    14. 中心静脈カテーテルのストラップ:首に皮下トンネルを作成し、中心静脈カテーテルをトンネルの下に埋め、シルク0-0切断針で上にある皮膚を縫合して固定します。
    15. 動脈カテーテルの取り外し:安定した平均BP(40-50 mmHg)と血液ガス分析でpHと乳酸レベルの改善傾向を確保した後、動脈カテーテルを取り外し、血管を結紮して首の止血を確保します。シルク0縫合糸で上にある皮膚を連続的に閉じる。
    16. 動物と抜管を配置する:必要なすべての予防措置の下で、輸送カートで動物の胸骨を回します。O 2の飽和および麻酔の逆転(手足の動き、自発呼吸の努力、SpO2 >O2 の95%オフ、および人工呼吸器のサポート)を観察し、 動物を抜管します。ペンに輸送し、動物の胸骨を配置し、安定するまで血行動態を監視します。

figure-protocol-1
図1:膵切除標本をまとめて切除した。in vivoの門脈を取り囲む膵臓組織の輪に注目してください。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-protocol-2
図2:十二指腸の画像。 保存された血管アーケード(矢じり)を有する十二指腸のCループを周囲の空腸ループと比較し、鬱血について評価した。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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結果

5つの膵臓移植生存モデルからの周術期および術後、最大3日間の生化学的パラメータを以下に要約する(年表ではPTX1〜5として番号が付けられている)。5つの総膵臓移植のうち、一般的な健康状態と膵臓損傷および内分泌機能検査から明らかなように、すべてが3日間の生存期間中に良好に推移しました。以下に示す結果は、レシピエントの3日間生存モデルの経験を代表するものです 移植片の静的冷蔵保存後の膵臓他家移植術。

膵切除術の平均手術時間は52分(45-64分)であった。これは脳死心拍動モデルであったため、ドナーには収縮期温虚血期はありませんでした。側噛みカバクランプを適用してから移植片の再灌流までの温虚血時間の平均レシピエントは49.5分(40-55分)であった。5つの移植片はすべて、研究プロトコルに従って5時間(300分)の冷虚血時間を有していた。全ての動物は、1日2回、300mgのSypシクロスポリンの形態で免疫抑制を受けた。

周術期の臨床および生化学的パラメータ
再灌流後の1時間の平均心拍数は135...

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ディスカッション

現在のプロトコルは、ブタモデルにおける膵切除術および膵臓同種移植の技術と実現可能性を実証するために実施されています。動物を移植後3日間観察し、膵切除術および同種移植の技術の信頼性を実証した。すべての動物は、抗生物質、体液、鎮痛薬、補足栄養、および免疫抑制剤(すなわち、シクロスポリン)の標準化された動物ケアプロトコルを使用して、手術後3日間監視および授乳されました。それらは、倫理的に承認された人道的技術によって、術後3日目(臨床的悪化によって義務付けられている場合は72時間後またはそれ以前)に犠牲にされました。.尾部、コーパス、頭部、十二指腸から生検を採取して病理組織学的解析に送り、残りの切片をRNA単離バッファーに保存し、後で使用するために急速凍結(-80°C)しました。

膵切除術によるブタモデルにおける医原性糖尿病の誘発を首尾よく実証する最も初期の試みの1つは、2011年にChaibaらによって体重27〜33 kgの10頭の白人オスブタのコホートで発表されました7。このグループは、ブタモデルで膵臓切除術を成功させるためのロードマップ...

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開示事項

著者は開示する利益相反を持っていません。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Belzer UW Cold storage solutionBridge to life Ltd (コロンビア、サウスカロライナ州、米国)4055
グルコン酸カルシウム (10%)Fresenius Kabi Canada Ltd (トロント、オンタリオ州)C360019
Composelect (採血バッグ)Fresenius Kabi Canada Ltd (トロント、オンタリオ州)PQ31555
ヘパリン (10000 IU/10 ml)Fresenius Kabi Canada Ltd (トロント、オンタリオ)C504710
Lactated Ringer'sBaxter (Mississauga, ON, Canada)JB2324
Percutaneous Sheath Introducer Set with Integral Hemostasis Valve/side Port for use with 7-7.5 Fr Catheters Arrow International LLCSI-09880
重炭酸ナトリウム (8.4%)Fresenius Kabi Canada Ltd (トロント、オンタリオ州)C908950
Solu-MedrolPfizer Canada Inc. 52246-14-2
外科用回収および移植器具セット
州

参考文献

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