感染性単核球症の小児からの末梢血サンプル中の免疫細胞亜集団の分離

サマリー

免疫磁気ビーズと蛍光活性化細胞ソーティングを組み合わせて、末梢血単核球(単球、CD4+ T細胞、CD8⁺ T細胞、B細胞、およびナチュラルキラー細胞)の定義された免疫細胞サブポピュレーションを分離および分析する方法について説明します。この方法を使用すると、磁気および蛍光標識された細胞を精製および分析できます。

要約

感染性単核球症(IM)は、主に原発性エプスタインバーウイルス(EBV)感染に関連する急性症候群です。主な臨床症状には、不規則な発熱、リンパ節腫脹、および末梢血中のリンパ球の有意な増加が含まれます。IMの発症メカニズムはまだ不明です。それに対する効果的な治療法はなく、主に対症療法が利用可能です。EBV免疫生物学の主な疑問は、感染した個人のごく一部だけが重篤な臨床症状を示し、EBV関連の悪性腫瘍を発症することさえあるのに対し、ほとんどの個人はウイルスで一生無症候性である理由です。

B細胞は、EBV受容体がその表面に提示されるため、最初にIMに関与します。ナチュラルキラー(NK)細胞は、EBV感染細胞を殺すために重要な細胞傷害性の自然リンパ球です。CD4+ T細胞の割合は減少しますが、CD8+ T細胞の割合は急性EBV感染時に劇的に拡大し、CD8⁺ T細胞の持続性はIMの生涯にわたる制御にとって重要です。これらの免疫細胞はIMにおいて重要な役割を果たしており、その機能は個別に同定する必要があります。この目的のために、単球は、CD14マイクロビーズ、カラム、および磁気分離器を使用して、IM個体の末梢血単核球(PBMC)から最初に分離される。

残りのPBMCをペリジニン-クロロフィルタンパク質(PerCP)/シアニン5.5抗CD3、アロフィコシアニン(APC)/シアニン7抗CD4、フィコエリスリン(PE)抗CD8、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)抗CD19、APC抗CD56、およびAPC抗CD16抗体で染色し、フローサイトメーターを使用してCD4+ T細胞、CD8⁺ T細胞、B細胞、およびNK細胞を選別します。さらに、5つの亜集団のトランスクリプトームシーケンシングを実施し、IMにおけるそれらの機能と病原性メカニズムを調査しました。

概要

ヒトヘルペスウイルス4型としても知られるγヘルペスウイルスであるエプスタインバーウイルス(EBV)は、ヒト集団に遍在しており、成人人口の90%以上で生涯にわたる潜伏感染を確立し^{ています1}。ほとんどのEBV一次感染は小児期および青年期に発生し、一部の患者は感染性単核球症(IM)²を呈し、血液中のCD8⁺ T細胞による活性化免疫応答や中咽頭3におけるEBV感染B細胞の一時的な増殖などの特徴的な免疫病理^{を示します。}IMの経過は2〜6週間続く可能性があり、患者の大多数はよく回復します⁴。しかし、一部の個人は、慢性活動性EBV感染症(CAEBV)5に分類される、高い罹患率および死亡率を伴う持続性または再発性のIM様症状を発症します^。さらに、EBVは重要な発癌性ウイルスであり、鼻咽頭癌、バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫(HL)、T/NK細胞リンパ腫などの類上皮性およびリンパ系悪性腫瘍を含むさまざまな悪性腫瘍と密接に関連しています⁶。EBVは50年以上にわたって研究されてきましたが、その病因やリンパ球の増殖を誘導するメカニズムは完全には解明されていません。

いくつかの研究は、トランスクリプトームシーケンシングによるEBV感染の免疫病理学の分子シグネチャを調査しています。Zhong et al.は、IMまたはCAEBVの中国の子供の末梢血単核細胞(PBMC)の全トランスクリプトームプロファイリングを分析し、CD8+ T細胞の増殖が主にIMグループ⁷で見られ、CD8⁺ T細胞がIMで主要な役割を果たしている可能性があることを発見しました。同様に、別の研究では、EBVの再活性化と他の薬剤の両方によって引き起こされるIMの患者よりも、原発性EBV感染によって引き起こされたIM患者では、EBV特異的細胞傷害性T細胞およびCD19⁺ B細胞の割合が低く、CD8 ⁺ T細胞の割合が高いことがわかりました⁸。B細胞は、EBV受容体がその表面に提示されるため、最初にIMに関与します。Al Tabaaらは、IM⁹の間にB細胞が多クローン的に活性化され、形質芽細胞(CD19+、CD27+およびCD20−、およびCD138−細胞)および形質細胞(CD19+、CD27⁺およびCD20⁻、ならびにCD138⁺)に分化することを発見した。さらに、Zhongらは、単球マーカーCD14およびCD64がCAEBVでアップレギュレーションされていることを発見し、単球が抗体依存性細胞傷害(ADCC)および活動亢進食作用を介してCAEBVの細胞性免疫応答に重要な役割を果たす可能性があることを示唆しています⁷。Alkaらは、IMまたはHLの4人の患者からのMACSソーティングCD56^dim CD16⁺ NK細胞のトランスクリプトームを特徴付け、IMおよびHLの両方のNK細胞が自然免疫およびケモカインシグナル伝達遺伝子を下方制御し、NK細胞の低応答性の原因となる可能性があることを発見し^ました10。さらに、Greenoughらは、IMを有する個体の10個のPBMCからの選別されたCD8⁺ T細胞の遺伝子発現を分析した。彼らは、IM中のCD8⁺ T細胞の大部分がウイルス特異的であり、活性化され、分裂し、エフェクター活性を発揮するようにプライミングされていることを報告しました¹¹。T細胞を介したEBV特異的応答とNK細胞を介した非特異的応答の両方が、一次EBV感染中に重要な役割を果たします。しかし、これらの研究は、免疫細胞の多様な混合物またはリンパ球の特定の亜集団のみのトランスクリプトーム結果を調査しただけであり、同じ疾患状態のIMを有する小児における異なる免疫細胞亜集団の分子特性および機能の包括的な比較には十分ではない。

この論文では、免疫磁気ビーズと蛍光活性化セルソーティング(FACS)を組み合わせて、PBMC(単球、CD4+ T細胞、CD8⁺ T細胞、B細胞、およびNK細胞)の定義された免疫細胞亜集団を分離および分析する方法について説明します。この方法を使用すると、磁気および蛍光標識された細胞を磁気分離器およびFACSを使用して精製するか、フローサイトメトリーによって分析することができます。RNAは、トランスクリプトームシーケンシングのために精製細胞から抽出することができる。この方法により、IM患者の同じ疾患状態における異なる免疫細胞の特性評価と遺伝子発現が可能になり、EBV感染の免疫病理学の理解が広がります。

プロトコル

血液サンプルは、IM(n = 3)、健康なEBVキャリア(n = 3)、およびEBVに感染していない小児(n = 3)の患者から得られた。首都医科大学の北京小児病院からボランティアを募集し、すべての研究が倫理的に承認されました。倫理的承認は、首都医科大学北京小児病院の倫理委員会によって取得されました(承認番号:[2021]-E-056-Y)。この研究では残りのサンプルのみを臨床試験に使用したため、患者のインフォームドコンセントは放棄されました。すべてのデータは完全に匿名化され、患者のプライバシーを保護するために匿名化されました。

1.末梢血からのPBMCの分離

1. IM患者から新鮮な末梢血(2 mL)を標準的な静脈穿刺によってK₃EDTAチューブに収集します。.
   注:細胞の生存率を維持するために、プロセスは迅速である必要があります。
2. 末梢血をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で2倍の容量に希釈し、15 mL遠沈管内のヒトリンパ球分離培地(密度:1.077 ± 0.001 g / mL)の上に重ねます。
   注:血液、PBS、および分離媒体の体積比は1:1:1でした。血液を分離媒体にゆっくりと加え、血液が分離媒体に沈降しないようにすぐに遠心分離します。
3. 室温で20分間、800 × g で遠心分離します。中間層(濃縮PBMC)を別の15 mL遠心チューブに移します。
   注:遠心分離後、チューブの下部には赤血球、中間層は分離媒体、最上層は血漿、血漿層と分離液体層の間にはPBMC(リンパ球と単球を含む)がありました。
4. PBMCを10 mLのPBSで洗浄し、800 × g で室温で20分間遠心分離します。上清は慎重に捨ててください。
5. 洗浄と遠心分離(ステップ1.4)を2回繰り返します。PBMCを1.5 mLの微量遠心チューブに1 mLのPBSで再懸濁し、トリパンブルーベースの自動カウンターで細胞をカウントします。

2. CD14マイクロビーズを用いたPBMCからのCD14⁺ 単球の単離

1. 0.5%ウシ胎児血清(FBS)と2 mM EDTAをPBS(pH 7.2)で含む緩衝液を調製します。バッファーを冷たく保ちます(2〜8°C)。
   注意: 気泡がカラムを塞ぐ可能性があるため、使用前にバッファーを脱気してください。細胞表面上の抗体のキャッピングや非特異的細胞標識を防ぐために、細胞を冷たく保ちます。
2. PBMCを300 × g で室温で10分間遠心分離します。上清は慎重に捨ててください。細胞を80 μLのバッファーで再懸濁します。20 μLのCD14マイクロビーズを細胞懸濁液に加えます。
   メモ:⁷ PBMC が 10 ≤ ある場合は、上記のボリュームを使用します。>10⁷ PBMCがある場合は、すべての試薬量と総量を比例的に増やします。
3. CD14マイクロビーズと細胞を1.5 mLマイクロ遠心チューブでよく混合し、4°Cの冷蔵庫で15分間インキュベートします。PBMCを1 mLのバッファーで洗浄し、室温で300 × g で10分間遠心分離します。上清を完全に捨ててください。細胞を500 μLのバッファーで再懸濁します。
   メモ: ≤10⁸ PBMC がある場合は、上記のボリュームを使用します。>10⁸ PBMCがある場合は、それに比例してバッファー量を増やします。
4. カラムによる磁気分離:
   1. カラムを磁気ビーズ分離器の上に置き、3 mLのバッファーでカラムを洗浄します。細胞懸濁液(ステップ2.3から)をカラムに追加します。
   2. カラムを通過した非標識細胞を15 mLの遠沈管に回収し、3 mLのバッファーでカラムを洗浄します。3 x 3 mLのバッファーでカラムを洗浄します。総排水を15 mL遠沈管に集めます。
   3. カラムを新しい15 mL遠沈管に入れます。5 mLのバッファーをカラムに加えます。プランジャーをカラムにしっかりと押し込み、磁気標識された細胞をすぐに15 mLの遠沈管に洗い流します。
   4. 磁気標識した細胞を300 × g で5分間遠心分離し、上清を除去します。細胞を1.5 mLマイクロ遠心チューブ内の500 μLのPBSに再懸濁し、その後のトランスクリプトームシーケンシングに使用します。

3. 蛍光標識抗体染色とFACSによるPBMCからのリンパ球集団の分離

1. 非標識細胞を300 × g で5分間遠心分離し(ステップ2.4.2)、上清を除去します。細胞を1.5 mLの微量遠心チューブ内の100 μLのPBSに再懸濁します。
2. 各標識抗体(CD3、CD4、CD8、CD16、CD19、CD56)2 μLを100 μLの細胞懸濁液(抗体の容量と結合蛍光色素の情報は 表1に示す)に加え、氷上で30分間インキュベートし、光から保護します。
3. 1 mLのPBSを添加し、室温で300 × g で5分間遠心分離することにより、細胞を2 x洗浄します。細胞を1.5 mLマイクロ遠心チューブ内の500 μLのPBSに再懸濁します。フローセルソーターサイトメーターでデータを取得する前に、細胞懸濁液を穏やかにボルテックスします。

4. フローサイトメトリーのパラメータ設定

1. 必要に応じて1.5 mLマイクロ遠心チューブに100 μLの細胞懸濁液(セクション1を参照)を取り、ネガティブコントロールサンプル、CD3単一染色サンプル、CD4単一染色サンプル、CD8単一染色サンプル、CD19単一染色サンプル、およびCD56/CD16染色サンプルをセットアップします。
2. 細胞懸濁液およびボルテックス100 μLあたり2 μLの対応する蛍光標識抗体を追加します。暗闇の中で30分間氷上でインキュベートします。300 × g で5分間遠心分離し、上清を吸引します。ペレットを500 μLのPBSとボルテックスで再懸濁します。
3. ソーティングストリームをコミッショニングし、蛍光ビーズを使用して液滴を次のように遅延させます。
   1. セルソーティングシステムを開き、 電源オンプログラムを実行し、 85μmノズルを取り付けて、 ソーティングストリームを開きます。 ソート電圧 を 4,500V、 周波数 を 47に設定します。
   2. 主にメーカーの指示に従ってメインフロー液滴ブレークポイントと液滴遅延を調整することにより、パラメータを調整します¹²。[ブレークオフ]ウィンドウで、最初のドロップレットブレークポイント位置(Drop1)を275に設定し、ギャップを8に設定します。スイートスポット自動ソーティングモードをオンにすると、サイトメトリーが液滴振幅値を自動的に決定して流れを安定させます。
   3. 蛍光ビーズをロードして、サイドストリームウィンドウで 液滴遅延 を 30.31 に調整し、ビーズが初期モードまたは微調整モードで>99%の サイド フローたわみを達成するようにします。
4. 図 1 に示すゲーティング戦略を参照して、次のようにゲーティングを実行します。
   1. 前方散乱面積(FSC-A)/側方散乱面積(SSC-A)ドットプロットを使用して、 ポリゴンゲート(P1) を描画し、 無傷のリンパ球 集団を特定します。
   2. FSC-A/FSC-高さ(FSC-H)ドットプロットを使用して、ポリゴンゲート(P2)を描画し、 単一セル を識別し、ダブレットを除外します(図1A)。
   3. CD19 FITC-A/CD3 PerCP-Cy5.5-Aドットプロットを使用して、長方形のゲート(P3)を描画し、CD3+ T細胞とCD19⁺ B細胞を選択します(図1A、B)。
   4. CD4 APC-Cy7-A/CD8 PE-Aドットプロットを使用して、長方形のゲートを描画し、CD4+ T細胞とCD8+ T細胞(それぞれこれらのマーカーに対して蛍光が高い細胞)を選択します。
   5. CD56/CD16 APC-A/SSC-Aドットプロットを使用して、長方形のゲートを描画してCD56+/CD16⁺ NK細胞を選択します(図1C)。
5. ネガティブコントロールサンプルを使用して機器パラメータを調整します。
   1. ネガティブコントロールチューブをローディングポートに取り付け、取得ダッシュボードで[ロード]をクリックします。ソフトウェアでサイトメーター設定を選択します。
   2. インスペクターウィンドウで、[パラメーター]タブをクリックし、FSC、SSC、およびさまざまな蛍光色素の電圧を調整します。FSC: 231, SSC: 512, PE: 549, APC: 615, APC-シアニン 7: 824, FITC: 555, PerCP-シアニン 5.5: 663.
6. 単一染色サンプル¹³を用いて補正を調整する。
   1. 単一染色チューブをサイトメトリーに順次ロードし、ソフトウェアで サイトメーター設定 を選択します。[ 報酬 ] タブをクリックして、報酬を調整します。
      注:フローサイトメトリーの補正リファレンスを 表2に示します。

5. フローサイトメトリーによる 細胞の選別とデータ収集

1. 細胞懸濁液(セクション1〜3に従って分離されたPBMC)を短時間ボルテックスして細胞を再懸濁してから、チューブをサイトメーターにロードします。残りのチューブを氷の上に置いてください。
2. 200 μLのFBSを4本の収集フローチューブに加え、選別した細胞がチューブ壁に付着しないようにし、サイトメーターの収集チャンバーに入れます。
3. 4つのフローチューブ内のIM患者のサンプルとは別に、CD3 + CD4 + T細胞、CD3 + CD8 + T細胞、CD3⁻CD19 + B細胞、およびCD3⁻CD56 + / CD16 ⁺ NK細胞を収集します(図2A)。
4. 分離した細胞を300 × g で5分間遠心分離し、上清を除去します。トランスクリプトームシーケンシングのために、200 μLのRNA単離試薬を細胞に追加します。
5. 上記の手順に従って、健康なEBVキャリアおよびEBVに感染していない子供からサンプルの免疫細胞亜集団を分離します(図2B、C)。

結果

ゲーティング戦略の参照
4つのリンパ球亜集団を分類するために使用されるゲーティング戦略を図1に示します。簡単に説明すると、リンパ球は、顆粒度(SSC-A)対サイズ(FSC-A)を示すドットプロット上で選択(P1)されます。次に、サイズ(FSC-A)対前方散乱(FSC-H)を示すドットプロット上で単一セルが選択され(P2)、ダブレットセルは除外されます。CD3+ T細胞(P3)およびCD19⁺ B細胞(図1B)は、CD3 PerCP-Cy5.5-A対CD19 FITC-Aを示すドットプロット上で別々に選択される。CD8+ T細胞およびCD4⁺ T細胞は、P3からのCD8 PE−A対CD4 APC-Cy7−Aを示すドットプロット上で別々に選択される。CD16⁺/CD56⁺ NK細胞を、P4由来のCD56/CD16 APC-A対SSC-Aを示すドットプロッ...

ディスカッション

このプロトコルは、末梢血免疫細胞亜集団を分類する効率的な方法を表しています。この研究では、IM患者、健康なEBVキャリア、およびEBVに感染していない子供からの静脈血サンプルが研究目的として選択されました。IMの患者の末梢血を使用したこの作業は、主にマルチカラーフローサイトメトリーによるさまざまな細胞サブセットの比率の分析と決定に焦点を当てています。トランスクリプトームシーケンシングは、主にリンパ球の特定の亜集団の検出と分析に使用されますが、同じ病状のIMの小児における異なる免疫細胞亜集団の分子特性と機能の包括的かつ特異的な比較には不十分でした。したがって、末梢血から数種類の細胞を選別し、トランスクリプトームシーケンシングを実行して、これらの免疫細胞の発現遺伝子と機能の違いを比較することは、IMの病因の研究に重要なデータを提供する可能性があります。

FACSソーティングには、さらなるin vitroまたはin vivo実験のために生きた分画細胞を処理できるという追加の利点があります¹⁴。細胞の生存率...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
APC 抗ヒト CD16	バイオレジェンド	302012	蛍光抗体
APC anti-human CD56 (NCAM)	Biolegend	362504	蛍光抗体
APC/Cyanine7 抗ヒトCD4	Biolegend	344616	蛍光抗体
全自動セルカウンター	BIO RAD	TC20	Cell count
BD FACSAria fluorescence-activated フロー セル ソーターサイトメーター (BD FACSAria II)	Becton, Dickinson and Company	644832	Cell sort
CD14 MicroBeads, human	Miltenyi Biotec	130-050-201	microbeads
Cell ctng slides	BIO RAD	1450016	Cell count
Centrifuge tubes Falcon		35209715	15 mL Centrifuge tube
EDTA (≥99%, BioPremium)	Beyotime	ST1303	EDTA
エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) 抗凝固剤チューブ	Becton, Dickinson and Company	367862	EDTA抗凝固チューブ
FITC抗ヒトCD19	バイオレジェンド	302206	蛍光抗体
Gibco Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	16000-044	Fetal Bovine Serum
高速 遠心分離機	Sigma	15	mL遠心チューブの
高速 遠心分離機	Eppendorf	5424R	Cell centrifugation for 1.5 mL Eppendorf (EP) tube
Human lymphocyte separation medium	Dakewe	DKW-KLSH-0100	Ficoll-Paque
LS 分離 コラム	Miltenyi Biotec	130-042-401	分離 カラム
微量遠心チューブ	Axygen	MCT-150-C	1.5 mL 微量遠心チューブ
MidiMACS セパレーター	Miltenyi Biotec	130-042-302	磁気ビーズセパレーター
PE 抗ヒト CD8	Biolegend	344706	蛍光抗体
PerCP/Cyanine5.5 抗ヒト CD3	Biolegend	344808	蛍光抗体
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)	BI	02-024-1ACS	PBS
ポリスチレン丸底チューブ	ファルコン	352235	5 mLチューブ(FACSフローサイトメーター用
トリゾール試薬	アンビオン	15596024	RNA抽出用細胞を溶解
トリパンブルー染色細胞生存率アッセイキット	ベイオタイム	C0011	トリパンブルー染色