術中副甲状腺イメージングのための簡便かつ効果的なラットモデルの確立

サマリー

今日まで、副甲状腺(PG)同定法の開発は、前臨床研究における動物モデルの欠如によって制限されています。本研究では、術中のPGイメージングのための簡便かつ効果的なラットモデルを確立し、酸化鉄ナノ粒子を新規PG造影剤として用いることでその有効性を評価します。

要約

副甲状腺(PG)の同定は、甲状腺摘出術における重要なアンメットニーズです。PGの同定は、甲状腺と色が似ているため、甲状腺手術では困難です。前臨床研究における効果的な動物モデルの欠如は、PG同定技術の開発にとって深刻な制限です。このプロトコルは、PG同定のための簡単で効果的なラットモデルの確立を可能にする。このモデルでは、黒色酸化鉄ナノ粒子(IOMP)が甲状腺に局所的に注入され、甲状腺内で急速に拡散しますが、PGは拡散しません。陰性に染色されたPGと陽性に染色された甲状腺は、外部顕微鏡を必要とせずに肉眼で簡単に識別できます。PGの位置は、黒いIONPの色に基づいて、甲状腺とPGの間の色のコントラストを上げることによって識別できます。このラットモデルは低コストでPG同定に便利であり、IONPは新しいPG造影剤です。

概要

副甲状腺(PG)は、ヒトや他の脊椎動物の首にある小さな楕円形の内分泌腺であり、副甲状腺ホルモンを産生および分泌して、血液および骨中のカルシウムおよびリンレベルを調節およびバランスさせます¹。人間は通常、甲状腺葉の後ろのさまざまな場所に2対のPGを持っています。ヒトPGのサイズは通常6 mm x 4 mm x 2 mmで、重量は約35〜40 mg²です。PGの除去または損傷は、低カルシウム血症および低または検出不能レベルの副甲状腺ホルモンを特徴とする内分泌障害である副甲状腺機能低下症(HP)を引き起こし、けいれん様のけいれんから奇形の歯、慢性腎臓病まで幅広い症状を引き起こします。これらの合併症のいくつかは致命的です(例:.、心不全および発作)^3,4,5;したがって、PGは体の代謝を調節し、生命を維持するのに不可欠です。

HPは、前頸部手術後の最も一般的な合併症の1つであり、特に甲状腺摘出術において、世界で最も一般的な内分泌癌である甲状腺癌の確立された治癒的治療法です^6,7。甲状腺摘出術後のHPは、手術室でPGを甲状腺葉やその他の周辺組織(リンパ節や末梢脂肪粒子など)からリアルタイムで確実に識別する能力が著しく欠如しているため、手術におけるPGの直接的な外傷、虚血、または除去によって主に引き起こされます。2021年、Barriosらは、1,114人の甲状腺摘出症例の中で平均PGのミスセクション率が22.4%であり、最小エラー率が7.7%であった経験豊富な外科医でさえ^{報告しました8}。このような高いPG誤切開率は、他の同様の報告^9、10、11と一致している。したがって、誤った副甲状腺摘出術は、一過性および永続的な術後HPの独立した危険因子です。

効果的な術中PG同定法の開発は、この重要な満たされていない医療ニーズに対処するための鍵を握っています。しかし、前臨床研究における動物モデルの欠如によって、それは厳しく制限されてきました。これまで、術中のPG同定調査のほとんどは、ヒト患者や大型動物(イヌなど)¹²に対して行われており、費用がかかり、倫理的承認を得るのが難しく、被験者数を拡大し、検査を繰り返すことが困難でした。一方、生物学研究で最も一般的に使用される脊椎動物モデルであるマウスは、PGが非常に小さく、サイズが^{1mm未満です13}。この制限により、マウスPGモデルは術中のPG同定研究にはほとんど使用されていません。

この論文は、術中のPG同定研究のためのシンプルで簡単で効果的なラットモデルの確立を報告します。甲状腺摘出手術におけるPGイメージング造影剤IONPをテストするための信頼できる動物モデルとして、外科的改変や遺伝子工学を伴わないネイティブSprague-Dawley(SD)ラットの使用を調査しました。このラットモデルは、PGとその周囲の微小環境の生理学的構造がヒトと非常に類似していることを示しており、ラットPGのサイズはマウスと比較して視覚的に検出できるほど大きい。ほとんどのラットは甲状腺の両側に1つのPGを持っています。このラットモデルの単純さと有効性は、甲状腺摘出術手術で術中のIONP増強PGイメージングを行うことによって実証されています。

プロトコル

すべての動物実験は、中国科学院の基礎医学および癌研究所の施設内動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されています。 これは非生存手術です。

1.動物

1. 術中のPGイメージングには、体重250 gの6〜8週齢の雌SDラットを使用します。

2.麻酔

1. 麻酔器の電源を入れます。
2. 始める前に、麻酔気化器のイソフルランレベルがいっぱいであることを確認してください。次に、酸素をオンにして、流量を0.4〜0.8 L / minに設定します。3〜5%イソフルランで麻酔を誘発し、2%イソフルラン(流量:0.4〜0.8 L / min)に維持します。.
3. SDラットを麻酔器の箱に入れ、 チャンネル モデルを選択して動物の麻酔を開始します。
4. 箱の中のラットの活動を観察してください。ラットが昏睡状態に陥ったら、麻酔を維持するためにノーズコーンに移動します(痛み反射と角膜反射のない無意識の仰臥位)。
5. 麻酔マスクを使用してラットの鼻を覆い、麻酔器を マスク モードに切り替えて、手術中に動物を麻酔下に置きます。

3.姿勢と固定

1. 麻酔をかけたラットを手術手術台の外科用ドレープに移します。手術中に動物の体温を維持するために、動物の下に予熱した加熱パッドを置きます。
2. 輪ゴムを使用して、ラットの手足を手術台に固定します。ドレープで作られた円筒形の枕をラットの肩の下に置き、頭を後ろに傾け、首の部分を完全に露出させます。
3. 麻酔中の乾燥を防ぐために、ラットの両目に人工涙液軟膏を塗布します。

4.脱毛

1. 脱毛クリームを首の部分に塗ります:顎下腔まで、剣状突起まで、そして胸鎖乳突筋の外側まで両側に。
2. 3分後、髪と脱毛クリームをティッシュでやさしく拭きます。

5.滅菌

1. ヨードフォア綿球を使用して、首の中央から周囲まで手術部位を3回消毒します。脱毛した部分のみを消毒してください。

6.外科用ドレープ敷設

1. ラットの首の手術領域を覆うために外科用ドレープを使用してください。外科用ドレープの穴を動物の消毒エリアに合わせてください。

7.切開

1. 切開を行う前に、つま先のつまみ反射の欠如を介して麻酔の手術面を確認します。次に、刃をメスにはめ込み、メスを使用してラットの首の前正中線を縦方向に切開します。切開の長さが約5 cmで、真皮のみであることを確認してください。

8.前頸部筋からの皮下組織の解剖

1. 切開の両側に沿って皮膚を持ち上げます。
2. はさみを使用して、 リネアアルバセルビカリスに沿って縦方向に切断します。
3. 鉗子を使用して、胸骨舌骨筋と胸骨甲状腺筋を分離します。

9.前頸部の筋肉を両側に固定します

1. 血管鉗子を使用して、分離した胸骨舌骨筋と胸骨甲状腺筋を首の前に固定し、固定された組織を外側に引き出します。
2. リトラクターまたは針を使用して、縫合糸(3-0#)をクランプされた組織に通し、結び目を作り、縫合糸を手術台の外科用ドレープに固定します。

10.甲状腺の局在

1. 甲状腺軟骨と輪状軟骨を手術領域の上部境界として配置します。盾の形状に基づいて甲状軟骨を特定し、輪状軟骨をリングの形状に基づいて識別します。
2. 気管を手術領域の下側境界として配置します。管状の軟骨リングの形状に基づいて、首の前部と中央の気管を探します。
3. 上側と下側の境界の間に甲状腺を配置します-気管の反対側にある蝶の形をした赤い腺。

11.PGの視覚的識別

1. 甲状腺の上側と外側にあるPGを見つけます。長さ約1.2〜2 mm、幅1.0〜1.5 mmの紡錘形の2つのPGを探しますが、赤みがかっていますが、特定の境界を持つ周囲の甲状腺よりも明るいです。
2. PGを気管、甲状腺、喉頭で正面写真を撮り、注射前後のIONPの効果を定量的に比較します。
3. 食道の後ろを解剖し、リトラクターを使用してPGの右側を露出させます。甲状腺と気管を含むPGの右側の写真を撮ります。
4. リトラクターを交換してPGの反対側を露出させ、甲状腺と気管で左側の写真を撮ります。

12.IONPの甲状腺注射

1. インスリン注射器を使用して、10 μLのIONPs懸濁液(リン酸緩衝生理食塩水中20 mg / mL)を甲状腺の中心に局所的に注入します。注射部位をガーゼで5秒間静かに押します。

13.IONP注射後のPGの同定

1. 注射後、甲状腺内でのIONPの急速な拡散を観察しますが、PGはPGを否定的に染色し、周囲の甲状腺と区別するため、PGは拡散しません。
2. 陰性に染色されたPGの正面写真を、気管、甲状腺、喉頭と一緒に撮ります。
3. 上記と同じ手順を使用して、負に染色されたPGの左側と右側の写真を撮ります。

14.甲状腺とPGによる喉と気管の切除

1. ラットが過剰なイソフルラン(5%イソフルランを5分以上)吸入し、深部麻酔下に入ったら、0.5mLの飽和塩化カリウム溶液の心臓内注射によって安楽死させます。.
2. 死後、喉、気管、甲状腺、およびPGを取り除きます。
3. ヒュームフードの下で、除去した喉、気管、甲状腺、およびPG検体を4%パラホルムアルデヒド溶液に24時間入れます。

15.組織病理学研究

1. 組織を脱水し、パラフィンに埋め込みます。厚さ5μmの切片にスライスします。切片をオーブンで37°Cで一晩焼き、65°Cで1時間焼きます。
2. 切片をヘマトキシリンとエオジン(H&E)で75%、95%、100%グラジエントアルコールで3 x 5分間洗浄し、室温で水洗した後、染色片を染色します。
3. 病理学者に光学顕微鏡でH&E染色切片を検査してもらいます。

結果

この動物モデルでは、SDラットの首を外科的に切開し、気管、喉頭、および周辺組織を露出させました。次に、甲状腺は気管の両側に視覚的に位置していました。蝶の形をしており、大きさは約3mm×5mmです。PGは通常、甲状腺の上部にあり、その色は甲状腺葉の色と非常に似ているため、肉眼で区別することは非常に困難です(図1)。

注射後、造影剤(図1 および 図2)であるIONPは甲状腺内で容易に拡散し、黒色に染色されますが、組織密度が高いためPGに浸潤することはできません。PGと甲状腺の間のIONPの不均衡な分布は、顕著なコントラストをもたらし、外部機器を必要とせずに肉眼で容易に視覚化することができます。 図2 は、ラットの左甲状腺のIONPsで陰性染色されたPGの代表的な画像であり、PGと甲状腺のコントラストが顕著であり、ラットPGのサイズは約2mm×1mm...

ディスカッション

我々は、甲状腺の中心に局所的に注入され、甲状腺内で拡散されたがPGではなく、甲状腺内に拡散された黒色IONPを用いたラットPGのIONPs誘導陰性イメージング技術を実証する。顕微鏡を使用せずに肉眼でPGを明確に識別できます。緑色蛍光タンパク質をPGで選択的に発現させたトランスジェニックマウスが報告されている^が13、この論文に記載されているモデルはより簡単に実行できる。注射後、ラット1匹あたり~1分しかかからず、甲状腺とPGの明らかな違いは肉眼で観察できます。

さらに、このモデルの別の利点は、新しいPG同定方法を評価するために前臨床試験で現在使用されている大型動物モデル(例えば、イヌ¹²)よりも、このラットモデルの方がコストおよび操作上の困難さがかなり低いことである。SDラットの平均コストはBALB / Cマウスの平均コストに近く、犬の30倍以上安価です。ラットモデルのこの低コストの利点により、大型動物モデルでは困難な前臨床研究で被験者数を増やし、テストを繰り返すことができます。一方、SD...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アルコール	李風	9400820067
麻酔器	RWD会社	R520IE	機械番号
ブレード	ダオピアン	TB-JZ-10#
円筒形枕			は自分で作った
毛クリーム	ナイール	TMG-001
電子スケール	ホンシンダ	CN-HXD2
eosin	Thermo Fisher(ウォルサム、米国)。	C0105S-2
エリスロマイシン	翔吉(北京、中国)	200409
ガーゼ	Fulanns	YY0331-2006
加熱パッド	Johon(深セン、中国)	JH-36-2006
ヘマトキシリン	サーモフィッシャー(ウォルサム、米国)。	C0105S-1
インスリン注射針	江陰南泉高分子20170702
ヨードフォア綿球	HOYON	19-6007
酸化鉄ナノ粒子溶液	Zhongke Leiming Technology(北京、中国)	Mag9110-05
イソフルラン	Sigma Aldrich(米国セントルイス)。
ニードルホルダー	Meijun	MH0587
手術台	BioJane	BJ-P-M
パラホルムアルデヒド溶液	Biosharp	21269333
ゴム	G-CLONE	XT41050
スキャンマシン	Olympus	Slideview VS200
外科用鉗子	Suping	SPHC-0676
外科用ナイフハンドル	Aladdin	S3052-06-1EA
外科用リトラクター	TOCYTO	18-4010
手術用ハサミ	Suping	SPHC-0795
手術用タオル	技術に沿って	YCKJ-RJ-036205
縫合	Ethicon	SA84G
縫合糸針	金環(上海、中国)	F301
血管鉗子	技術に沿って	YCKJ-RJ-016218
ウォーターバススライドドライヤー	華須(金華、中国)	HS-1145