音響流体マイクロデバイスに基づく細胞・核の圧縮率測定

サマリー

ここでは、音響流体マイクロデバイスに基づいて細胞または核の圧縮率を測定するための高速で非破壊的なシステムを構築するためのプロトコルが提示されます。上皮間葉転換または電離放射線照射後の腫瘍細胞の機械的特性の変化を調べ、科学的研究および臨床診療におけるこの方法の適用の見通しを実証した。

要約

細胞力学は、腫瘍の転移、細胞の悪性化、および放射線感受性において重要な役割を果たします。これらのプロセスの間、細胞の機械的特性を研究することはしばしば困難です。圧縮や延伸などの接触に基づく従来の測定方法は、細胞損傷を引き起こしやすく、測定精度とその後の細胞培養に影響を与えます。接着状態での測定は、電離放射線が細胞を平らにし、接着性を高めるため、特に照射後の精度にも影響を与える可能性があります。ここでは、音響流体法に基づく細胞力学測定システムが開発されている。細胞圧縮率は、音響力の作用下での細胞運動軌跡を記録することによって得ることができ、中断状態での高速かつ非破壊測定を実現することができる。このホワイトペーパーでは、チップ設計、サンプル調製、軌道記録、パラメータ抽出、および分析のプロトコルについて詳しく説明します。異なる種類の腫瘍細胞の圧縮率をこの方法に基づいて測定した。核の圧縮率の測定は、圧電セラミックの共振周波数とマイクロチャネルの幅を調整することによっても達成されました。免疫蛍光実験の分子レベルの検証と組み合わせて、薬物誘発上皮間葉転換(EMT)前後の細胞圧縮率を比較した。さらに、異なる線量でX線照射した後の細胞圧縮率の変化を明らかにした。本稿で提案する細胞力学測定法は普遍的かつ柔軟であり、科学研究や臨床現場での応用が見込まれる。

概要

細胞の機械的特性は、腫瘍の転移、細胞の悪性形質転換、および放射線感受性において重要な役割を果たします^1,2。上記のプロセスにおける細胞の機械的特性の役割を深く理解するには、細胞力学の正確な測定が重要であり、測定はその後の培養および分析のために細胞に損傷を与えてはなりません。測定プロセスは可能な限り速くなければなりません、さもなければ細胞が長期間培養環境から取り除かれるならば、細胞の生存率は影響を受けるかもしれません。

既存の細胞力学測定法にはいくつかの制限があります。磁気ツイストサイトメトリー、磁気ピンセット、粒子追跡マイクロレオロジーなどのいくつかの方法は、細胞への粒子の導入による細胞損傷を引き起こします^3,4,5。原子間力顕微鏡(AFM)、マイクロピペット吸引、マイクロ狭窄、平行平板法など、細胞との接触によって測定する方法も細胞損傷を起こしやすく、スループットを向上させることは困難です^6,7,8。さらに、電離放射線は細胞を平らにし、それらの接着を増加させます⁹;したがって、懸濁液中の全細胞力学を測定する必要があります。

以上の課題に応えて、音響流体法^{10,11,12,13,14}に基づく細胞力学計測システムが開発された。チャネル幅は音響半波長に一致しているため、マイクロチャネルの正中線に定在波ノードが作成されます。音響放射力の作用下で、セルまたは標準ビーズは音圧ノードに移動できます。標準ビーズの物理的特性(サイズ、密度、圧縮率)がわかっているため、音響エネルギー密度を決定することができます。そして、細胞圧縮率は、音場における細胞の運動軌跡を記録することによって得ることができる。懸濁状態の細胞の非破壊ハイスループット測定を達成することができる。本稿では、マイクロ流体チップの設計、システムの構築、測定手順について紹介する。本方法の正確性を検証するために、様々な種類の腫瘍細胞の測定が行われている。この方法は、圧電セラミックスの共鳴周波数とマイクロチャネルの幅を調整することにより、細胞内構造(核など)に適用範囲を拡大していました。さらに、異なる線量での薬物誘発EMTまたはX線照射後の細胞圧縮率の変化を調べた。結果は、生化学的変化と細胞の機械的特性との相関を研究するための強力なツールとしてのこの方法の幅広い適用性を示しています。

プロトコル

1. 音響流体マイクロデバイスの作製と組立

1. マイクロ流体チップの作製。
   1. 図1に示すように、入口と出口が 1つだけのシングルチャネルチップを設計します。細胞を測定する場合は、マイクロチャネルの長方形の断面を幅740 μm、深さ100 μmに保ちます。細胞核を測定するには、マイクロチャネルの幅と深さをそれぞれ250 μmと100 μmに変更します。
   2. 反応性イオンエッチング により シリコンウェーハ上のマイクロチャネルを調製します。マイクロ流路の上部を陽極接合¹⁵により透明耐熱ガラス片で封止する。チップを超音波洗浄機で10分間洗浄します。後で使用するために、50°Cの乾燥オーブンで乾燥させます。
2. ポリジメチルシロキサン(PDMS)ブロックを作製します。
   1. 30 mLのプレポリマーを100 mm(直径)のガラス皿に加えます。シリンジでプレポリマーに3 mLの硬化剤を追加します。
      注:硬化剤とプレポリマーの体積比は1:10です。
   2. PDMSプレポリマーと硬化剤をガラス棒で約10分間激しく混合します。PDMSプレポリマーと硬化剤がよく混合されていることを示す、溶液中の小さくて均一に分離された気泡を探します。
   3. ガラス皿を真空デシケーターに入れ、15〜25秒間排気します。混合物に気泡がなくなるまでこのプロセスを繰り返します。
   4. ガラス皿を50°Cに設定された乾燥オーブンに1時間置き、混合物を硬化させます。インキュベーション後、メスを使用してPDMSを長さ約1.2 cm、幅1 cmの適切なサイズのブロックに切断します。
      注:PDMSブロックの長さはチップの幅と一致しており、幅は、2つのPDMSブロックがチップに接着されている場合に圧電セラミック用の中央に十分なスペースがあることを確認するために選択されます。
3. PDMSブロックをチップにバインドします。
   1. 直径1mmの中空針を備えた入口ポートと出口ポート用のPDMSブロックのパンチ穴。PDMSブロックとチップ(裏面を上にして)をプラズマクリーナーに1分間入れます。
   2. PDMSブロックの穴をチップの入口と出口に合わせます。PDMSブロックをチップに15秒間そっと押し付けます。これにより、PDMSブロックとチップの表面の間でボンディングが発生します。
4. ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)カテーテルをチップに接続します(図2B)。
   1. 内径0.8 mm、長さ10 cmのPTFEカテーテルを2枚切り取ります。内径0.7mm、長さ1.5cm×90°のステンレス製針をL字型に曲げます。カテーテルの一端に接続します。針でそのようなカテーテルを2つ用意してください。
   2. ステンレス鋼の針をPDMSブロックの穴に挿入します。注入口には、シリンジのコネクタとして19Gの分注針をカテーテルのもう一方の端に接続します。
   3. 上記の手順を完了した後、脱イオン水を注入して、チャネル全体の気密性をテストします。水を通さないということは、良いシールを意味します。
5. 圧電セラミックアセンブリ(図2C)
   1. ダイヤモンドワイヤーカッターを使用して、直径2cmの圧電セラミックシートを幅5mmの4つのストリップに切断します。
   2. 圧電セラミックの共振周波数がチップマイクロチャネルの幅と一致していることを確認してください。740 μmと250 μm幅のマイクロチャンネルには、それぞれ1 MHzと3 MHzの共振周波数を持つ圧電セラミックスを使用してください。
   3. 圧電セラミックの両側の一端にワイヤを溶接します。
   4. 圧電セラミックをシアノアクリレート接着剤でチップの背面の中央に接着します。
   5. 接着剤を均等に広げるには、圧電セラミックに接着剤を一滴置き、つまようじで接着剤を滑らかにし、余分な接着剤を取り除きます。次に、チップをすばやく押して、約1分間押し続けます。圧電セラミックとチップがしっかりと接着され、均等に接触していることを確認してください。
6. マイクロデバイスをマウントします(図2D)。
   1. PDMS(長さ約1.5cm、幅約1cm)をマイクロデバイスのベースとして切り取ります。両面テープを使用して、ベースの片側を入口と出口のPDMSブロックに貼り付け、反対側を透明なスライドガラスに貼り付けます。マイクロデバイス全体を顕微鏡ステージに固定して、チップを1つの焦点面に保ちます。

2. サンプル調製

1. ポリスチレン標準粒子溶液の調製。
   1. 0.05 mLのポリスチレン粒子(直径6 μm)溶液(2.1 x 10⁸ 粒子/mL)を10 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に加え、よく混合します。
      注:音響エネルギー密度の変化による測定誤差を減らすために、キャリブレーションとして各実験でポリスチレン粒子溶液をサンプル溶液と混合しました。
2. 細胞懸濁液の調製
   1. 接着細胞(MCF7、MDA-MB-231、HCT116など)を90%コンフルエント(~5 x 10⁵ 細胞)でPBSで洗浄します。500 μL 0.25%トリプシン(1x)を室温(25°C)で1〜2分間加えます。トリプシンを除去し、1 mLの完全培地を加え、ピペッティングにより細胞懸濁液を形成します。
   2. 細胞懸濁液を100 x g で5分間遠心分離します。上清を除去し、細胞懸濁液を得るために0.5〜1mLのPBSに再懸濁する。細胞を血球計算盤でカウントし、濃度は約3〜5 x 10⁵ 細胞/ mLでした。
3. 細胞核懸濁液の調製
   1. 手順 2.2 を実行します。その後、上清を除去し、細胞ペレット20 μL(約500万細胞)あたり200 μLの細胞質タンパク質抽出試薬A(1%PMSFを添加した)を添加し、よく混合します。
   2. 上記の混合物を220 x g で5秒間ボルテックスし、次に氷浴に10分間置きます。インキュベーション後、10 μLの細胞質タンパク質抽出試薬Bを溶液に加えます。
   3. 220 x g で5秒間渦。氷浴に1分間置き、220 x g で再び5秒間ボルテックスします。その後、最後に1,000 x g で4°Cで5分間遠心分離します。
      注:細胞質タンパク質抽出試薬AとBの容量比は20:1です。
   4. 上清を除去し、ペレットを1 mLのPBSに再懸濁します。その後、1,000 x g で4°Cで4分間遠心分離します。上清を除去し、細胞核懸濁液として100 μLのPBSに再懸濁します。
   5. 上記の細胞核懸濁液にトリパンブルーを加え、室温(25°C)で4分間染色します。核懸濁液に対するトリパンブルー溶液の体積比は1:1である。倒立顕微鏡下の核の数を10倍の対物レンズで数えます。
      注:顕微鏡下で細胞核を明確に識別するには、トリパンブルー染色が必要です。トリパンブルー溶液は、効果的な染色のために、使用前に37°Cの水浴中に10分間入れる必要があります。
   6. 上記の細胞核懸濁液をPBSバッファーで2〜3 x 10⁵ 核/ mLの濃度に希釈します。細胞核懸濁液を70μmのふるいを通してろ過します。

3. 細胞・核の圧縮率測定

1. 測定システムのセットアップ(図3)
   1. 顕微鏡の光源をオンにして、カメラソフトウェアを開きます。4倍対物レンズを使用して、マイクロチャネルの中央位置、つまり圧電セラミックの位置を見つけます。
   2. ワイヤを接続し、圧電セラミックの信号発生器出力のプラス端子とマイナス端子にそれぞれ溶接します。
   3. シリンジをマイクロインジェクションポンプに置き、インレットカテーテルに接続します。出口カテーテルの端に小さな容器を置き、マイクロチャネルから流出する液体を保持します。
2. 測定パラメータの決定
   1. ポリスチレン粒子溶液をシリンジで吸引し、チップマイクロチャネルに注入します。チップマイクロチャネル内の気泡を避けて、正確な測定を保証します。粒子がチップマイクロチャネルに均等に分布していることを確認します。
      注:測定は、フローまたはシリンジポンプなしで行うことができます。必要に応じて、マイクロインジェクションポンプの流量を適切な値に設定する必要があります。ここで、流量の範囲は0〜20μL / hです。
   2. 信号発生器の出力を、周波数1MHz(細胞核測定の場合は3MHz)およびピークtoピーク電圧(Vpp)10Vの正弦信号に設定します。
   3. 粒子がマイクロチャネルの正中線に向かって移動し、正中線に到達した後も正中線に沿って前進し続けることが観察されるまで、信号の周波数を微調整します(図4)。
      注意: 正中線に向かって移動する粒子の速度は、5Vppから20Vppの間で調整できる電圧振幅によって決まります。
3. 細胞と核の測定
   1. 1 mLの細胞または核懸濁液を標準粒子溶液と1:1の比率で混合し、シリンジでマイクロチャネルに注入します。
   2. 細胞または核が視野に入ったら、CCDカメラで記録を開始します。次に、信号発生器をオンにします。細胞または核が正中線に達したら記録を停止します。
   3. マイクロチャネルを脱イオン水、75%アルコール、脱イオン水で順番にすすぎ、後で使用する。

4. データ処理

1. 粒子または細胞の軌跡をマッピングします。
   1. キャプチャしたビデオをImageJソフトウェアにインポートします: ファイル>開く>フォルダを選択します。ImageJソフトウェアのツールバーにある楕円形状をクリックして、目的のセルとその隣接する粒子を選択します(図5)。
   2. 図5に示すように、ImageJソフトウェアで測定パラメータを解析→測定→面積、重心、表示ラベル)としてプリセットします。
   3. ターゲットセルまたは粒子が縦方向の変位を受けるフレームを開始フレームとして取ります。マイクロチャネルの正中線に達するまで、各フレーム内のセルまたは粒子のピクセル位置とサイズを記録します。データをスプレッドシート ファイルとしてエクスポートし、目的のすべてのセルの軌跡が得られるまでこの手順を繰り返します。
2. 座標変換と修正。
   1. この視野内のマイクロチャネルの四隅のピクセル座標を(0,y1),(0,y2),(x3,y3),(x4,y4)として記録します。ここでx3 = x4です。
   2. 各測定点(xi、yi)について、次の式を使用して回転補正後の新しい座標(xi'、yi')を計算します。
      
      
      
   3. ピクセル座標を実寸の座標に変換します。実際の座標は、ピクセル座標に比率を掛けることによって取得できます。この比率は、マイクロチャネルの実際の幅をマイクロチャネルのピクセル幅(H)で割った値とした。
   4. ステップ4.1で得られた細胞及び粒子の画素座標を最終的な運動軌跡データに変換し補正する。すべての座標から左下隅の座標を引いたもの、つまり(0, y2)。ビデオのフレームレートは毎秒40フレームなので、各座標に対応するフレーム数に0.025秒を掛けて粒子の移動時間を求め、y方向の位置の経時変化を求めます。
3. 音響エネルギー密度を計算します(図6A、B)。
   1. Y方向のセルまたは粒子の運動は、音響力_Facおよび流体力FDによって駆動される。次の式を使用してモーション軌道を計算します。
      (1)
      (2)
      (3)
      ここで、 r と D はセルまたは粒子の半径と直径、 ρ と β は密度と圧縮率、νは速度ベクトルです。添え字cと f はそれぞれ細胞と体液を示します。 d は最も近い音圧ノードからの距離、 μ は流体の動粘度、 k は波数、 E は音響エネルギー密度です。
      注:MCF7、HCT116、A549および細胞核の密度は、それぞれ1068 kg / m 3、1077 kg / m³、1073 kg / m 3、および1155 kg / m ³であり、^12,16,17でした。
   2. ステップ4.3.1で説明されている式に従って、MATLABソフトウェアを使用して、有限差分法による音場下での標準粒子軌道の数値解を取得します。
   3. あらかじめ設定された音場の範囲内で、音響エネルギー密度を変更し、標準粒子の数値解(ステップ4.3.2で取得)と測定された運動軌道(ステップ4.2で取得)を適合させます。フィット平均二乗誤差に従って最適なフィット結果を選択します。ここで得られた音響エネルギー密度は、その後のセル圧縮率の計算のためのパラメータとして使用されます。
4. セルの圧縮率を計算します(図6C、D)。
   1. 音響エネルギー密度をステップ4.3.3で取得した値に設定します。
   2. ステップ4.3.1で説明されている式に従って、MATLABソフトウェアを使用して、有限差分法による音場下でのセル軌道の数値解を取得します。
   3. ステップ4.3.3と同様に、予め設定された圧縮率の範囲内で、圧縮率を変更し、セルの数値解(ステップ4.4.2で取得)と測定された運動軌跡(ステップ4.2で取得)を適合させる。最適なフィッティング結果に対応する圧縮率係数を、測定されたセル圧縮率として使用します。

結果

本研究では、音響流体マイクロデバイスに基づく高速かつ非破壊的な細胞圧縮性測定システムを構築するためのプロトコルを提示し、さまざまな状況下で細胞と核を測定するためのその利点を実証しました。 図1 にマイクロ流体チャネルの概略を示す。音響流体マイクロデバイスのコンポーネントとアセンブリを 図2に示します。 図3 に測定システムのセットアップを示します。音場力の作用下で、細胞と粒子は、 図4Aに示すように、マイクロチャネルの正中線に向かって移動します。細胞または粒子のサイズおよび位置の測定を 図5に示す。フィッティングによるエネルギー密度とセル圧縮率の計算を 図6に示します。このデバイスの適用範囲を細胞小器官、特に核に拡大するために、高純度で無傷の核を細胞から単離しました(

ディスカッション

一般的に使用される細胞力学測定方法は、AFM、マイクロピペット吸引、マイクロ流体法、平行平板技術、光ピンセット、光学ストレッチャー、および音響法^である20。マイクロフルイディクス法は、マイクロくびれ、伸長流、せん断流の3つのアプローチで機能します。その中で、光学ストレッチャー、光ピンセット、音響法、伸長流、およびせん断流のアプローチは非接触測定です。接触測定とは対照的に、非接触測定は、接触または局所的な変形によって引き起こされる細胞損傷の問題を効果的に回避できます。光ピンセットは、測定環境²¹に非常に敏感である。光学条件での摂動は、測定結果に大きな違いを引き起こす可能性があり、測定中の高いレーザー出力も細胞の損傷を引き起こす可能性があります。その上、光学ストレッチャーと光ピンセットは一般的に低スループット^20,22を持っています。伸長流やせん断流などのマイクロ流体法では、腫瘍細胞のマイクロメカニクスを直接測定することはできませ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.25% トリプシン(1x)	GIBCO	15050-065
502 接着剤	Evo-bond		シアノアクリレート接着剤
A549	ATCC	CCL-185	肺腺癌
細胞核タンパク質および細胞質タンパク質抽出キット	Beyotime	P0027	細胞質タンパク質抽出試薬 A および B
ダルベッコ '修正イーグルミディアム(DMEM)	corning	10-013-CVRC
ウシ胎児血清(FBS)	AUSGENEX	FBS500-S
HCT116	ATCC	CCL247	結腸直腸癌
耐熱ガラス	パイレックス
・リーボビッツ's L-15 ミディアム	GIBCO	11415-064
MCF-7	ATCC	HTB-22	乳房腺癌
MDA-MB-231	ATCC	HTB-26	乳房腺癌
最小エッセンシャルメディウム(MEM)	corning	10-010-CV
ペニシリン-ストレプトマイシン	GIBCO	15140-122
リン酸緩衝液	corning	21-040-cvc
PMSF	Beyotime	ST506	100mM
ポリビーズポリスチレン 赤染めマイクロスフェア	polysciences	15714	microshpereの直径は6.00µです。m
ヨウ化プロピジウム(PI)	Sigma-Aldrich	P4170
SYLGARD 184シリコーンエラストマー	ダウ・コーニング	1673921	プレポリマーと硬化剤を含む
トリパンブルー	Beyotime	C0011