方法論記事

がんエピジェネティクス研究のためのATAC-Seq最適化

DOI：

10.3791/64242

⸱

2022年6月30日

 ,  ,  ,  , 
1University of North Dakota School of Medicine and Health Sciences, 2Dana-Farber Cancer Institute

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ATAC-seqは、多動変異トランスポザーゼTn5を使用して、転写因子によって媒介されるクロマチンアクセシビリティの変化をマッピングするDNAシーケンシング法です。ATAC-seqは、がん細胞の表現型変化の根底にある分子メカニズムの発見を可能にします。このプロトコルは、がん細胞を含む上皮細胞タイプにおけるATAC-seqの最適化手順の概要を示しています。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ハイスループットシーケンシング(ATAC-seq)プローブを用いたトランスポザーゼアクセス可能なクロマチンのアッセイは、高活性Tn5トランスポザーゼを用いたデオキシリボ核酸(DNA)アクセシビリティです。Tn5は、アダプターを切断およびライゲーションして、アクセス可能なクロマチン領域内でのハイスループットシーケンシングを実現します。真核細胞では、ゲノムDNAは、DNA、ヒストン、およびその他のタンパク質の複合体であるクロマチンにパッケージ化されており、転写機構に対する物理的な障壁として機能します。外因性シグナルに応答して、転写因子はクロマチンリモデリング複合体を動員し、遺伝子活性化のための転写機構へのアクセスを可能にします。したがって、オープンクロマチン領域の同定は、癌の進行などの生物学的事象中のエンハンサーおよび遺伝子プロモーター活性をモニタリングする場合に有用である。このプロトコルは使いやすく、細胞投入要件が低いため、ATAC-seqは、がん細胞を含むさまざまな細胞タイプのオープンクロマチン領域を定義するために広く採用されています。データ集録を成功させるには、ATAC-seqライブラリを準備する際にいくつかのパラメータを考慮する必要があります。その中で、細胞溶解バッファーの選択、Tn5酵素の滴定、および細胞の開始量は、癌細胞におけるATAC-seqライブラリ調製にとって非常に重要です。高品質のデータを生成するには、最適化が不可欠です。ここでは、上皮細胞型に対するATAC-seq最適化法について詳細に説明する。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

クロマチンアクセシビリティは、ゲノムワイドスケールでの遺伝子発現調節の重要な要件です1。クロマチンアクセシビリティの変化は、癌を含むいくつかの病状と頻繁に関連しています2,3,4。長年にわたり、研究者がクロマチンアクセシビリティの領域をマッピングすることによってクロマチンランドスケープを調査できるようにするために、多くの技術が開発されてきました。その中には、DNase-seq(DNase I過敏性部位シーケンシング)5、FAIRE-seq(ホルムアルデヒドによる調節要素の単離)6、MAPit(個々のテンプレートに対するメチルトランスフェラーゼアクセシビリティプロトコル)7、および本論文の焦点であるATAC-seq(トランスポザーゼアクセス可能なクロマチンのアッセイ)8などがあります。DNase-seqは、DNaseの重要な特徴、すなわちヒストンや転写因子5などの他のタンパク質を含まない裸のDNAを優先的に消化することを利用して、アクセス可能な領域をマッピングします。FAIRE-seqは、ChIP-seqと同様に、免疫沈降が関与しないことを除いて、ホルムアルデヒド架橋および超音波処理を利用し、ヌクレオソームを含まない領域はフェノール-クロロホルム抽出によって単離されます6。MAPitメソッドは、GCメチルトランスフェラーゼを使用して、単一分子分解能でクロマチン構造をプローブします7。ATAC-seqは、活性亢進トランスポザーゼTn58に依存しています。Tn5トランスポザーゼは、開いたクロマチン領域に優先的に結合し、シーケンシングアダプターをアクセス可能な領域に挿入します。Tn5は、DNAを介した「カットアンドペースト」メカニズムを介して動作し、アダプターをプリロードしたトランスポザーゼが開いたクロマチン部位に結合し、DNAを切断し、アダプターをライゲーションします8。Tn5結合領域は、これらのアダプターにアニールするプライマーを用いたPCR増幅によって回収される。FAIRE-seqおよびDNase-seqは、大量の出発物質(~100,000細胞から225,000細胞)と、シーケンシング9の前に別のライブラリ調製ステップを必要とします。一方、ATAC-seqプロトコルは比較的単純で、必要な細胞数(<50,000セル)10です。FAIRE-seqおよびDNase-seq技術とは異なり、単離されたDNAサンプルはすでにTn5によってシーケンシングアダプターでタグ付けされているため、ATAC-seqのシーケンシングライブラリ調製は比較的簡単です。したがって、ライブラリ調製を完了するために適切なプライマーによるPCR増幅ステップのみが必要であり、エンドリペアおよびアダプターライゲーションなどの事前処理ステップを実行する必要はなく、したがって時間を節約する11。第二に、ATAC-seqは、MAPit7に必要な領域特異的プライマーによるバイサルファイト変換、クローニング、および増幅の必要性を回避します。これらの利点により、ATAC-seqはオープンクロマチン領域を定義するための非常に一般的な方法になりました。ATAC-seq法は単純ですが、高品質で再現性のあるデータを得るためには、複数のステップを最適化する必要があります。この原稿では、標準的なATAC-seqライブラリ調製の最適化手順について説明し、特に(1)溶解バッファー組成、(2)Tn5トランスポザーゼ濃度、および(3)細胞数の3つのパラメーターを強調しています。さらに、この論文では、癌性および非癌性の付着上皮細胞の両方を使用した最適化条件からのサンプルデータを提供します。

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プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1.実験開始前の準備

  1. 溶解バッファーストックを調製します。
    注:最適な核分離バッファーは、細胞タイプごとに異なる場合があります。原著論文8で使用した低張バッファーとCSKバッファー12,13の両方を、トリパンブルー染色を使用して各細胞タイプについてテストすることをお勧めします。
    1. 低張緩衝液(グリーンリーフ緩衝液)を調製するには、10 mM トリス塩酸塩 pH 7.4、10 mM NaCl、3 mM MgCl2、および0.1% NP-40を混合します。
    2. CSKバッファーを調製するには、10 mM パイプpH 6.8、100 mM NaCl、300 mM スクロース、3 mM MgCl2、および0.1% Triton X-100を混合します。
  2. 細胞培養条件が最適であることを確認してください。光学顕微鏡で細胞を調べて、アポトーシスのレベルが上昇していないことを確認します。
  3. 遠心分離機の電源を入れて4°Cにします。

2.細胞収穫

  1. 細胞の培養物から培地を<80%のコンフルエントで吸引します。細胞は通常、必要な細胞数、処理などに基づいて、35mmまたは60mmのディッシュで増殖します。
  2. 細胞を1 mLまたは3 mLのPBSで洗浄します。
  3. 0.5 mLまたは1 mLのトリプシンを加え、2〜3分間インキュベートします(細胞の種類によって異なります)。1 mLピペットを慎重に使用してよく混ぜます。
  4. 1 mLまたは2 mLの培地をプレートに加え、よく混ぜます。15 mLのコニカルチューブに移します。細胞を15 mLチューブで300 x gで3分間遠心分離します 。
    注意: セルの損失を最小限に抑えるために、スイングバケットローターをお勧めします。
  5. 培地を吸引し、細胞を1 mLまたは2 mLの培地に再懸濁します。
    注:均質なシングルセル溶液を調製することが重要です。組織の場合、Dounceホモジナイザーを使用して組織を均質化し、大きな細胞の塊や凝集体を最小限に抑えることができます。一部の組織では、生細胞を単離して単一細胞溶液を得るために、ろ過(セルストレーナーなど)および/またはFACSセルソーティングが必要です。
  6. セルカウンターを使用してセルをカウントします。
    注:この研究では、自動セルカウンター(材料表)を使用しました。
  7. 必要な細胞量(例えば、細胞数に基づいて1 x 106 細胞を含む体積)を300 x g で室温(RT)で3分間遠心分離します。
  8. 1 x 106 細胞を含む細胞ペレットを1 mLのコールドPBSに再懸濁します。
    注:細胞数が1 x 10 6細胞未満の場合は、冷たいPBS容量を減らして、同じ濃度(1 x 106細胞/ mL)で細胞溶液を調製します。

3.細胞溶解

  1. 25 μL(= 2.5 x 104 細胞)を新しい1.7 mLマイクロ遠心チューブに移します。4°Cで500 x g で5分間遠心分離し、上清を注意深く廃棄します
    注意: セルの損失を最小限に抑えるために、スイングバケットローターをお勧めします。細胞が廃棄されないように、約3μLの上清を残します。
  2. 25 μLの溶解バッファーを加え、穏やかに上下にピペッティングして細胞を再懸濁します。氷上で5分間インキュベートする
  3. 4°Cで500 x g で5分間遠心分離し、上清を注意深く廃棄します。
    注意: セルの損失を最小限に抑えるために、スイングバケットローターをお勧めします。細胞が廃棄されないように、約3μLの上清を残します。

4. Tn5 タグメンテーション

  1. 直ちにペレットを25 μLのTn5反応混合物に再懸濁します。Tn5反応混合物は以下の通りである:12.5 μLの2xタグメンテーションDNAバッファー(TDバッファー)、1.25-5 μLのTn5トランスポザーゼ、および11.25-7.5 μLのヌクレアーゼフリー水。
    注:Tn5の標準濃度は、2.5 x 104 細胞で2.5μLです。
  2. 37°Cで30分間インキュベートします。
    注意: 10分ごとに溶液を混合します。

5. DNA精製

注:増幅する前に精製が必要です。DNA精製は、MinElute PCR精製キット(材料表)を使用して行われます。

  1. 5 μLの3 M酢酸ナトリウム(pH 5.2)を加える。
  2. 直ちに125 μLのバッファーPBを加え、よく混合します。
  3. ステップ2から始まるPCR精製キットのプロトコルに従ってください。
    1. スピンカラムを2 mLの収集チューブに入れます。
    2. サンプルをスピンカラムに適用し、RTで17,900 x g で1分間遠心分離します。
    3. フロースルーを破棄し、スピンカラムを同じ収集チューブに戻します。
    4. 750 μLのバッファーPEをスピンカラムに加え、RTで17,900 x g で1分間遠心分離します。
    5. フロースルーを破棄し、スピンカラムを同じ収集チューブに戻します。
    6. スピンカラムを5分間遠心分離して、メンブレンを完全に乾燥させます。
    7. フロースルーを破棄し、スピンカラムを新しい1.7 mLマイクロ遠心チューブに入れます。
    8. 10 μLのバッファーEBでDNA断片を溶出します。
    9. カラムをRTで1分間放置します。
    10. RTで17,900 x g で1分間遠心分離し、DNAを溶出します。

6. PCR増幅

注:配列決定には、転置(タグ付き)DNAのPCR増幅が必要です。この例では、Nexteraキットアダプター(材料表)を使用しました。本研究で用いたプライマーを 表1に列挙する。

  1. 200 μL PCRチューブ(各サンプルにつき50 μL)で以下のPCR反応をセットアップします。PCR反応混合物は以下の通りである:溶出したDNA10 μL(ステップ5)、2.5 μLの25 mMアダプター1、2.5 μLの25 mMアダプター2、25 μLの2x PCRマスターミックス、および10 μLのヌクレアーゼフリー水
  2. PCR増幅プログラムパート1を実行します(表2)。
    注:初期増幅では、標準のサーマルサイクラーを使用するすべてのサンプルに同じ条件が使用されます。
  3. リアルタイム qPCR (サンプルあたり合計 14.5 μL)
    1. PCR増幅パート1からの5 μLの生成物(ステップ6.2)を使用して、今度はSYBR金を含む以下の反応を設定し、リアルタイムPCRマシンで検出します。
    2. ステップ6.2のPCR産物5 μL、SYBR金0.75 μL(希釈1000倍)、2倍PCRマスターミックス5 μL、ヌクレアーゼフリー水3.75 μLのPCR反応混合物を調製します。
      注:各サンプルの飽和に達する前のライブラリ増幅の正確なサイクル数は、PCR10のGCおよびサイズバイアスを低減するためにqPCR(表3)によって決定されます。SYBR金をヌクレアーゼフリー水で希釈した。希釈液を作るために、1 μLのSYBR Gold(ストック濃度10,000倍)を999 μLのヌクレアーゼフリー水に加えました。表3に記載されているRT-qPCRの実行時間は約60分です。
  4. ステップ 6.3 の実行パラメーターを使用して、必要な追加 PCR サイクル数を決定します。
    1. サイクル数 = 1/4 最大(飽和)蛍光強度(通常 3 または 4 PCR サイクル)
  5. PCR増幅プログラムパート2(容量= 45 μL; 表 4): サイクル番号を決定したら、手順 6.4.1 で計算された追加のサイクルを使用して PCR を設定します。たとえば、計算されたサイクル数が3の場合、以下のプログラムで3サイクルを設定します。合計サイクルは 8 (手順 6.2 では 5 回、手順 6.5 ではさらに 3 回) になります。

7.ビーズ精製

注:ここでは、AMPure XP(材料表)ビーズを使用しました。

  1. 前のステップで増幅したPCR産物に、RTで150 μLのビーズを加えます。
    注:このプロセスでは、自家製のAMPureビーズ14 を使用できます。
  2. RTで15分間インキュベートします。
  3. チューブを磁気スタンドに5分間置きます。
  4. 上清を慎重に取り除きます。
  5. ビーズを200μLの80%エタノールで洗浄します。
    注:80%エタノールは新鮮に調製する必要があります。
  6. 手順 7.4 を繰り返します。
  7. エタノールを完全に除去します。
  8. サンプルをRTで10分間風乾します。
  9. 50 μLの溶出バッファー(10 mM Tris-HCL pH 8.0)で再懸濁します。
  10. ビーズ精製(ステップ7.1.-7.9)を繰り返して、プライマーの汚染をさらに最小限に抑えます。

8. DNA濃度と品質チェック

  1. 核酸定量キット(材料表)を用いてDNA濃度を測定する。
  2. SYBR Gold(0.5x TBE、1.5%アガロースゲル)または自動電気泳動システム(TapeStation、バイオアナライザーなど)を使用したゲル電気泳動によって、増幅されたDNA断片を確認します。

9. シーケンシング

  1. 増幅されたDNAサンプル12、13を用いてハイスループットシーケンシングを行う。
    注:増幅されたDNAサンプルは、ハイスループットシーケンシングの準備ができています。ヌクレオソームDNAフラグメント情報を保持するには、シングルエンドシーケンシングよりもペアエンドシーケンシングが推奨されます。DNA断片の両端は、トランスポザーゼが結合する場所を示す。オープンクロマチン領域のマッピングには、通常、サンプルあたり3,000万リードで十分です。

10.データ分析

  1. 基本通話品質に基づくデータ フィルタリング: 最小平均基本品質スコアを 20 (99% の精度) に設定します。
  2. アダプターのトリミング: 適切なツールを使用してアダプターのシーケンスを削除します。
    注: Trim Galore ラッパー ツール (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/) を使用してアダプタ シーケンスを削除しました。イルミナTn5によって調製されたATAC-seqライブラリでは、次の配列がアダプタ配列として使用されます:CTGTCTCTTATACACATCT。アダプターの汚染を認識するための最小シーケンス長は 5 に設定されています。
  3. ゲノムマッピング:以下のパラメータ「-I 0 -X 2000 -m 1」15を使用して、Bowtieでリードを適切なゲノムにマッピングします。MDA-MB-231基底乳がん細胞からのマッピング品質の例を以下に示します。
    少なくとも1つのアライメントが報告された読み取り:52.79%
    アライメントに失敗した読み取り数: 13.10%
    -m が原因でアライメントが抑制された読み取り: 34.11%
  4. 重複排除:ピカードツール16でPCRの重複をマークします。
  5. データ可視化用のゲノムカバレッジファイルの生成:重複排除されたペアエンドリードをシングルエンドリードフラグメントに変換します。ゲノムカバレッジトラックは、ベッドツール17からゲノムカバレッジベッドを使用して取得されます。

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結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ATAC-seqデータを高品質で得るためには、実験条件を最適化することが重要です。ATAC-seqライブラリの調製は、細胞溶解、タグメンテーション(Tn5によるフラグメンテーションとアダプター挿入)、ゲノムDNA精製、PCR増幅、データ解析の5つの主要ステップ(図1)に分けることができます。初期プロセスとして、細胞溶解(核分離)バッファーを最初に各細胞タイプに最適化する必要があります。元のATAC-seq論文8に記載されている低張緩衝液またはCSK緩衝液12,13のいずれかを使用して、乳癌細胞を溶解しました。トリパンブルー染色は、核単離の確認に使用できます18。MDA-MB-231、T47D、MCF7、およびA375細胞などのヒト癌細胞株におけるATAC-seqライブラリ調製のために、CSKバッファーは複数のグループによって使用されています

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ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ATAC-seqは、オープンクロマチン領域と活性クロマチン領域のマッピングに広く使用されています。がん細胞の進行は、遺伝子の変化やエピジェネティックなリプログラミングによって駆動されることが多く、その結果、クロマチンへのアクセス可能性と遺伝子発現が変化します。このリプログラミングの例は、腫瘍転移中の重要な細胞リプログラミングプロセスであることが知られている上皮間葉転換(EMT)およびその逆プロセスである間葉系から上皮への移行(MET)の間に見られる30。別の例は、ホルモン療法に対する薬剤耐性の獲得であり、管腔乳房腫瘍31においてしばしば観察される。ATAC-seqは、このような細胞表現型の変化をクロマチンレベルでモニターするのに有用であり、起源の細胞および癌サブタイプを予測するために使用することができる4。

ATAC-seqによるクロマチンリモデリングを正確に測定するには、再現性のある一貫したプロトコルの確立が必要です。この原稿では、ATA...

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者らは、この論文で説明されている研究に関連する関連または重要な金銭的利益がないことを宣言します。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

優れた技術支援を提供してくれたUNDゲノミクスコア施設に感謝します。

この研究は、国立衛生研究所[P20GM104360からM.T.、P20 GM104360からA.D.]によって資金提供され、ノースダコタ大学医学部および健康科学部、生物医科学部[M.T.へ]から提供されたスタートアップ資金によって資金提供されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1.5 mL 微量遠心チューブUSA Scientific1615-5500Natural
10 & micro;L XL TipOneチップUSA Scientific1120-3810フィルター付きおよび低保持
100 µL XL TipOne RPTチップUSA Scientific1182-1830フィルター付きおよび低保持
100 µL XL TipOneチップUSA Scientific1120-1840フィルター付きで低保持力。斜めの等級
15 mLの円錐形の遠心分離機の管Corning352096
20 µL TipOne RPTチップUSAサイエンティフィック1183-1810フィルターと低保持
200&マイクロ;L TipOne RPTチップUSA Scientific1180-8810ろ過および低保持
50 mL遠心分離チューブFisherbrand06-443-19
アガロース サーモフィッシャー サイエンティフィックYBP136010遺伝子解析グレード
この研究で使用したすべての細胞株は、ATCCATCC
Allegra X-30R CentrifugeBeckman Coulter364658SX2415
AMPure XP ビーズベックマン・コールターA63881ビーズ精製キット
CellDrop セルカウンターDeNovixCellDrop FLセルカウンター
EDTAMilliporeSigmaEDSBioUltra、無水、≥99% (滴定)
EGTAミリポアSigmaE3889
エタノール 100%サーモフィッシャー サイエンティフィAC615100020 無水;フィッシャーサイエンティフィック - デコンラボ滅菌製品
胎児ウシ血清 - TETテスト済みR&D SystemsS10350トリプル 0.1 & マイクロ;m フィルター
Gibco DMEM 1xThermoFisher Scientific11965092[+] 4.5 g/L D-グルコース;[+]L-グルタミン;[-]ピルビン酸ナトリウム
Gibco PBS 1xThermoFisher Scientific10010023pH 7.4
Gibco Trypsin-EDTA 1xThermoFisher Scientific25200056(0.25%)、フェノールレッド
グリセロールIBI Scientific56-81-5
グリシンミリポアSigmaG8898
HClMilliporeSigmaH1758
HEPESMilliporeSigmaH3375
Invitrogen Qubit 蛍光光度計ThermoFisher ScientificQ32857
MgCl2MilliporeSigmaM3634
MinElute PCR Purification kitQiagen28004DNA purification kit
NaClIBI Scientific7647-14-5
NaOHミリポアシグマS8045バイオエクストラ、≥98% (酸性)、ペレット (無水)
NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master MixNew England BiolabsM0541
Nextera DNA サンプル調製キットIlluminaFC-121-10302x TD and Tn5 Transposase
NP - 40 (IGEPAL CA-630)MilliporeSigmaI8896分子生物学
PCR 検出システムBioRad1855484CFX384リアルタイムシステム。C1000 タッチサーマルサイクラー
PIPESMilliporeSigmaP1851BioPerformance Certified, suitable for cell culture
Qubit dsDNA HS Assay kitThermoFisher ScientificQ32854Invitrogen;核酸定量キット
Quibit Assay TubesThermoFisher ScientificQ32856Invitrogen
SDSMilliporeSigmaL3771
Nadium AcetateHomemade-pH5.2
スクロースIBI Scientific57-50-1
SYBR GoldThermoFisher ScientificS11494
SYBR GreenSupermix, 1.25 mLBioRad1708882
T100 サーマルサイクラーBioRad1861096
TempAssure 0.2 mL PCR 8-Tube StripsUSA Scientific1402-4700Flex-free, natural, polypropylene
TempPlate 384-WELL PCR PLATEUSA Scientific1438-4700シングルノッチ.天然ポリプロピレン
トリスベースミリポアシグマ648311ULTROLグレード
トリトン x-100IBI サイエンティフィック9002-93-1
TrueSeq デュアルインデックスシーケンシング プライマーキットイルミナPE-121-1003ペアエンド
トリパンブルーステインサーモフィッシャーサイエンティフィックQ32851
Tween-20ミリポアシグマP7949BioXtra、粘性液体
ウォーターミリポアSigmaW3500無菌ろ過、BioReagent、細胞培養に適しています
ック

参考文献

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