気管におけるストレス緩和と障害応答の調査

肺疾患におけるその重要な役割にもかかわらず、最大の気道構造である気管は、その粘弾性特性を詳述する研究が限られている¹。気道特異的な材料特性を理解することは、米国における死因の第3位である肺疾患の傷害予防、診断、および臨床介入の科学を進歩させるのに役立つため、気管の時間依存性粘弾性挙動の深い理解は肺力学研究にとって重要である^2,3,4。

利用可能な組織特性評価研究は、気管の剛性特性を報告している⁵、^6、7、8。時間依存の機械的応答は、組織リモデリングにおけるそれらの重要性にもかかわらず、最小限に調査されており、これも病理学^9,10によって変化している。さらに、時間依存応答データの欠如は、現在一般的な構成法則の使用に頼っている肺力学計算モデルの予測能力も制限する。気管の生物物理学的研究に情報を提供するために必要な材料特性を提供できるストレス緩和研究を行うことによって、このギャップに対処する必要があります。現在の研究では、ブタ気管のストレス緩和行動を調査するための試験方法、データ取得、およびデータ分析の詳細を提供しています。

記載されているすべての方法は、ドレクセル大学の施設動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって承認されました。すべての死体動物は、米国ペンシルベニア州にある米国農務省(USDA)が承認した農場から取得されました。オスのヨークシャーブタ(生後3週齢)の死体を本研究に使用した。

1. ティッシュハーベスト

1. 承認された農場から豚の死体を入手し、安楽死から2時間以内に実験を行う。組織の収穫が完了するまで死体を氷の上に保ち、新鮮な組織の生体力学的特性が確実に保存されるようにします。
   注:公表された文献では、動物の新鮮な組織試験は、通常、安楽死後2時間以内に行われます。詳細については、参考文献¹¹、12、13、14、15、16、^17、18、19を参照された^い。
2. 死体を仰臥位に置き、首に沿って垂直正中線切開を行い、甲状腺軟骨、クリコイド軟骨、気管を舌骨から胸骨上ノッチに露出させる。
3. #10ブレードを使用して喉頭と全長気管を収穫します(図1A)。
4. 気管サンプルを喉頭から分離し、#10ブレードを使用して気管チューブを片側の全長に沿って縦方向に切断します(図1B)。
5. 取得した断面画像(ImageJ²⁰を用いて得られた、 材料表参照)を用いて気管の厚さを測定する(図1C)。測定された組織の厚さを使用して、データ解析中の断面積を計算します。
6. 気管を幅約5mm(近位)の2本の円周ストリップと幅約5mm(遠位)の2本の縦方向ストリップに切断し、これらのストリップの最小長は25mmです(図1D)。
7. 定規と一緒に4つのサンプル(すなわち、切断された気管ストリップ)の画像を取得する。これらの画像を使用して、画像J(図1E)を使用してサンプル幅のデジタル化された測定値を提供します。次に、この測定幅を使用して、データ分析中にサンプルの断面積を計算します。
8. すべての組織サンプルが、試験全体を通して滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)溶液を使用して水和状態に保たれるようにします。テストの準備ができるまで、PBSに浸したガーゼでサンプルを水和させてください。適切な水分補給をテストする直前に組織をPBSに浸します。

2. 生体力学的試験

1. 各サンプルをカスタム設計のクランプ(前のレポート11、¹²、13、14、15、16、^17、18、19を参照)に取り付けて^、サンプルがクランプの間に縦方向に保持されるようにします(図^1F)。
2. クランプを(伸びを誘発することなく)慎重に、上部アクチュエータに取り付けられた50Nロードセルを備えた材料試験機( 材料表を参照)に固定します(図1G)。
3. 定規を使用して、グリップ間の(つまり、クランプ)距離を測定します。この距離をひずみ計算の初期組織長として使用します。
4. 各サンプルを1%/sのひずみ速度で5回引張荷重して1%ひずみにプリコンディショニングを行います。
5. 各サンプルを0%または10%のピーク伸長で300秒間保持し、組織の粘弾性応力緩和応答を調べます。
6. 応力緩和試験の後、機械的故障が発生するまで直ちに組織を1%/sで伸ばします。
7. 故障部位を文書化し、試験後にクランプ内にサンプルが存在することを確認することによって、スリップが発生していないことを確認します(図1H)。

3. データ取得

1. プレコンディショニング中はデータを集録しないでください。
2. ストレス緩和と故障テストのビデオを、デジタルカメラを使用して最低30フレーム/秒で録画します。
3. 応力緩和試験と故障試験の両方で、データ収集ソフトウェア( 材料表を参照)を使用して、250サンプル/秒のサンプリングレートで時間(複数)、荷重(N)、および変位(mm)データを取得します。
4. 集録したデータを.csvファイルとして保存し、手順4で詳述したデータ解析に使用します。
5. 応力緩和前、応力緩和後、および故障後のクランプ組織の静止画を取得します(図2)。

4. データ解析

1. データ入力
   1. 「最適化」および「画像処理」ツールボックスを含むMATLABデータ分析ソフトウェア( 材料表を参照)をダウンロードしてインストールします。
   2. MATLAB コードと、データ分析手順を説明するために使用されるサンプル データセットを含む zip フォルダー (補足コーディング ファイル 1) をダウンロードします。
   3. ダウンロードしたzipフォルダに移動し、その内容を抽出します。
   4. MATLAB を開き、解凍したフォルダを作業ディレクトリとして設定します。作業ディレクトリに、以下の注で説明するようにラベル付けされた次のフォルダとファイルがあることを確認します。この作業ディレクトリに追加のフォルダやファイルが存在しないことを確認します。これは、コードに干渉してエラーが発生する可能性があるためです。
      注: (1) 故障 (リラクゼーション後)、(2) 故障のみ、(3) リラクゼーション、(4) calc_relax_failure時、(5) main_relax_failure時、(6) テスト日付.xlsx。
   5. [ 失敗のみ] フォルダーに移動します。
      注:このフォルダ内に含まれるデータは、この研究の対照群、すなわち、0%の伸長後に機械的故障を受けた気管サンプルからの生体力学的データに由来するものである。
   6. 特定の日付にテストされたサンプルのデータを、次のファイル命名規則を使用して 1 つの Microsoft Excel ファイルに格納 します: mmddyy。たとえば、2022 年 4 月 30 日にテストされたすべての対照群気管サンプルからのデータは、 故障のみの|に保存する必要があります。043022.xlsx。
      注:現在の研究では、すべての生体力学的試験は1日に実施されたことに注意してください。ただし、データが複数のテスト日から派生した場合は、それらのテスト日ごとに、説明されている規則で名前が付けられた新しい Microsoft Excel ファイルを作成します。
   7. オープン 障害のみ|043022.xlsx および複数のワークシートタブがあり、それぞれがこの特定の日付、すなわち2022年4月30日に機械的故障を受けた各サンプルからの生データを含むことを認識します。
   8. サンプルに、[サンプル タイプ]_[サンプル番号]_[ストレッチ前ひずみレベルを挿入]%という規則を使用してラベル付けされていることを確認します。
      注:例えば、現在の研究では、対照群の気管サンプルは、事前の応力緩和なしに、軸方向または円周方向の荷重下で機械的故障試験を受けた。したがって、これらのサンプルには、それぞれ TA_1_0% と TC_1_0% という形式で名前が付けられます。0%はプレストレッチなしを示す。我々の実験群の気管サンプルは、まず10%の軸方向または円周荷重下で固定伸長で保持され、粘弾性応力緩和応答を評価し、次いで機械的破壊を受けた。したがって、これらのサンプルの名前は 、TA_1_10 % と TC_1_10% の形式で付けられます (それぞれ軸方向荷重条件と円周荷重条件を表すステップ 4.1.16 およびステップ 4.1.23 を参照してください)。
   9. ワークシート タブ TA_1_0% を選択します。生データヘッダー列に、以下の注で太字で入力されたとおりにラベル付けされていることを確認します。
      注:(1)時間(秒)、(2)荷重(N)、(3)位置(mm)、(4)直径(mm)(ステップ1.7)、(5)平均断面積(厚さ×幅、^mm2)(ステップ1.5およびステップ1.7で取得)、(6)初期長さ(mm)(ステップ2.3)。
   10. 現在の Microsoft Excel ファイルを閉じます 。失敗のみ|043022.xlsx。
   11. データ解析ソフトウェアの作業ディレクトリに戻ります。
   12. [ リラクゼーション] フォルダーに移動します。
       注:このフォルダ内に含まれるデータは、この研究の実験グループ、すなわち、300秒間10%の固定伸びでストレス緩和試験を受けた気管サンプルからの生体力学的データに由来する。
   13. 特定の日付にテストされた実験グループ サンプルのデータを、 mmddyy というラベル付け規則を使用して 1 つの Microsoft Excel ファイルに格納します。
       注:たとえば、2022年4月30日にテストされたすべての実験群気管サンプルからのデータは、 リラクゼーション|に保存する必要があります043022.xlsx。詳細については、ステップ 4.1.6 の注を参照してください。
   14. オープン リラクゼーション|043022.xlsx および複数のワークシートタブがあり、それぞれがこの特定の日付、すなわち2022年4月30日に試験された実験グループの各サンプルからの生負荷緩和データを含むことを認識している。
   15. 一時停止して、この Microsoft Excel ファイルに含まれているワークシートのタブで示されているように、各サンプルは、その後、引張機械的荷重下で機械的破損を受けたことに注意してください。
       メモ: 存在する各サンプルに対応する故障データは、手順 4.1.20 でさらに説明する 「故障(緩和後)」 フォルダに保存する必要があります。
   16. サンプルに、ステップ 4.1.8 で説明した規則を使用してラベル付けされていることを確認します。
   17. 現在の Microsoft Excel ファイルにある各ワークシート タブを切り替え、手順 4.1.9 を参照して、特定のワークシート タブによって示される各サンプルの生の負荷緩和データが正しく書式設定されていることを確認します。
   18. 現在のMicrosoft Excelファイルを保存して閉じる、 リラクゼーション|043022.xlsx。
   19. データ解析ソフトウェアの作業ディレクトリに戻ります。
   20. フォルダの 失敗(緩和後)に移動します。
   21. [ 緩和] フォルダーに存在するものと同じ日付の Microsoft Excel ファイルがあることを確認します (各テスト日に対応する Microsoft Excel ファイルの命名の詳細については、手順 4.1.6 を参照してください)。
       注: 現在のフォルダ内に含まれるデータ Failure (Post-Relaxation)は、10% の固定伸びで 300 秒間、応力緩和試験を行った気管サンプルからの対応する生の機械的故障データです。
   22. オープン 障害(リラクゼーション後)|043022.xlsx および複数のワークシートタブを認識し、各タブには緩和タブに存在する同じサンプルからの生の機械的故障データが含まれ て|043022.xlsx。
   23. サンプルがステップ 4.1.8 で説明した規則を使用してラベル付けされていること、およびラベルが 「緩和」のラベルと一致していることを確認|043022.xlsx。
       注: たとえば、現在の Microsoft Excel ファイルの TA_1_10% のデータは、軸方向荷重下で気管試料 #1 の生の機械的故障データを表しており、以前に 10 % の固定伸びで 300 秒間応力緩和試験を受けました。
   24. 各ワークシートのタブを切り替え、手順 4.1.9 を参照して、各サンプルの生の機械的故障データのヘッダー列が正しく書式設定されていることを確認します。
   25. 現在の Microsoft Excel ファイルを閉じる 、失敗 (リラクゼーション後) |043022.xlsx。
   26. データ解析ソフトウェアの作業ディレクトリに戻ります。
   27. 手順 4.1.5 ~ 4.1.26 を繰り返して、追加のテスト日を確認します (該当する場合)。
   28. Microsoft Excel ファイル testingDates.xlsx を開きます。このファイルでは、ユーザーが指定したテスト日を分析するようにコードに指示します。
   29. 最初の列にテストの日付を mm/dd/yy という形式でリストします。
   30. 2 番目の列では、 Y (はいの場合) または N (いいえの場合) を使用して、この特定の試験日のサンプルが実験 (応力緩和の後に機械的破損が続く) グループからのものであるかどうかを示します。
   31. 3 番目の列では、 Y (はいの場合) または N (いいえの場合) を使用して、この特定の試験日のサンプルが対照 (直接機械的故障) グループからのものかどうかを示します。
   32. 手順 4.1.29-4.1.31 を繰り返して、追加のテスト日を確認します。
   33. 現在の Microsoft Excel ファイル testDates.xlsx を保存して閉じます。
   34. データ解析ソフトウェアの作業ディレクトリに戻ります。
   35. メインスクリプトファイル main_relax_failure開きます。
   36. ソフトウェア インターフェイスの 緑色の大きな矢印 を選択して、コードを実行します。または、コマンド ウィンドウ に「run main_calc_relax 」と入力します。
   37. プロンプトが表示されたら、さまざまな実験グループのコンマ区切りの固定伸びレベル(%単位)を入力し、 OKを押します。
       注: 現在のスタディでは、応力緩和伸びは 1 つだけ、つまり「 10」と入力しました。対照群には0%を含めないでください。ただし、データが複数の伸び (10% や 20% など) から派生した場合は、「 10,20」と入力します。
   38. プロンプトが表示されたら、さまざまな実験グループの応力緩和試験期間(秒単位)をコンマで区切って入力し、 OKを押します。
       注:現在の研究では、気管サンプルは300秒間固定された伸びで保持され、したがって入力 300であった。ただし、データが複数の応力緩和期間 (90 秒と 300 秒など) から得られた場合は、「 90,300」と入力します。
2. 粘弾性応力緩和応答
   1. コード(main_relax_failure.m)を使用して、荷重時間データ(コードライン144)を公称応力時間データに変換し、σは応力(メガパスカル[MPa])、Fは円周方向または軸方向の荷重(ニュートン[N])、A0は初期断面積(ミリメートルの2乗[^mm2])を表します。
   2. コード(main_relax_failure.m)を使用して、300秒緩和試験の開始時にサンプルに10%固定伸びを適用したことに応じて、ピーク荷重および応力の大きさ(コード行138および146)を決定します。
      注: これらの値は、以下、それぞれ初期ピーク荷重および初期ピーク応力と呼ばれます。
   3. コード(main_relax_failure.m)を使用して、次の式を使用して、300秒(コードライン141および149)における応力(または荷重)の減少率を計算します。 ここで、 Rel%は緩和率を表し、σ(0⁺)は初期ピーク応力(または初期ピーク荷重)を表し、σ(300)は300秒にわたる緩和後に記録された応力(または荷重)レベルを表します。
   4. 2項のProny級数指数減衰モデルを使用して粘弾性応力緩和応答(コード行152-161)をモデル化するには、コード(main_relax_failure.m)を参照してください。このモデルは、様々な軟骨気道レベル(気管、大気管支、および小気管支)を含む様々な生体組織の粘弾性挙動を記述するために一般的に使用される^21,22。
      注: 計算された応力値 [σ(t)] は正規化され、次の低減緩和関数が生成されます: G(0) = 1。粘弾性応力緩和応答を比較するために、G(t)は非線形最小二乗回帰を使用してカーブフィットされ、tは応力緩和保持中の時間、gは緩和係数、_τ1および_τ2は、組織の短期(初期)および長期(平衡)挙動をそれぞれ記述する緩和時間(秒単位)を示す。
3. 機械的故障応答
   1. コード(main_relax_failure.m)を使用して、引張試験機によって記録された荷重-変位データ(コードライン143-144)を、以下の注に記載されている式を使用して公称応力-ひずみデータに変換します。
      注: ここで、σは公称応力(MPa)、F は円周方向または軸方向の荷重(N)、A 0 は初期断面積(^mm2)を表し、ここで、結果ひずみ、Δ L は変位を表し、L₀ はサンプルの初期長さを表します。応力緩和保持後の破壊引張試験を行ったサンプルについて、L0は組織の延伸前の長さを表す。例えば、サンプル3(初期長さ8mm)を10%に予め延伸し、したがって、_L0は、得られたひずみ値¹⁹を計算するために8.8mmと考えられた。
   2. 関数(calc_relax_failure.m)を使用して、最大荷重(すなわち、破損荷重)および対応する破損変位、ならびに最大応力(すなわち、破損応力)および対応する破損ひずみ(コード行33および61-63)を特定します。
   3. 関数(calc_relax_failure.m)を使用して、故障荷重(34行目)に続く荷重-変位データを破棄します。
   4. 関数(calc_relax_failure.m)を使用して荷重-変位曲線をプロットし、プロンプトが表示されたら、曲線の線形領域の2点を手動で選択して組織剛性(N/mm)を近似します(コードライン37-58)。
      注: 荷重-変位曲線はサンプルの断面積と初期長さによって正規化されて応力-ひずみ曲線が得られるため、このコードは荷重-変位曲線からユーザーが選択した x 座標と y 座標を使用して、次の式¹⁹ を使用して弾性率(MPa)を計算します。ここで、E は弾性率、x と y は荷重-変位曲線上の選択した座標を表し、 A0は断面積を表し、_L0は機械的破損の開始時のサンプルの長さを表し、ΔσおよびΔは、それぞれ、破損応答の線形領域にわたる応力およびひずみの変化を表す。
   5. すべてのサンプルについて手順 4.3.4 を繰り返します。
4. データ出力
   1. コードが正常に実行されたら、計算結果がデータ分析ソフトウェアの作業ディレクトリで Microsoft Excel ファイルとして次の命名規則で利用可能であることを確認します: relax_failure_results_mmddyy.xlsx、 mmddyy はコードが実行された日付に置き換えられます。

図1は、クランプ部位付近の破断組織とクランプ内の組織の存在を示しており、引張試験中に滑りがないことを確認しています。図2は、試験サンプル間の引張試験中に観察された、上部または下部のクランプ部位または組織の長さに沿った様々な損傷部位を示す。データ解析結果を図3-4及び表1-2にまとめた。10%ひずみへの軸方向または円周方向のプレストレッチに続く気管サンプルに対する応力緩和応答を図3に示す。初期ピーク荷重および応力、300sホールドにわたる応力の減少率、ならびに時定数t1およびt2を、2項プロニー級数緩和関数において、これらの緩和曲線から計算した。これらの粘弾性パラメータは表1に含まれる。プレストレッチなしまたは10%プレストレッチに続く軸方向または円周方向の荷重下での故障試験を行った気管サンプルの応力-ひずみ応答を図4に示す。これらの曲線から、破壊応力および対応する破壊ひずみ、ならびに弾性率を決定し、表2に列挙した。

予備試験は、気管組織のストレス緩和応答を首尾よく特徴付けた。これらの初期実験では、10%のストレッチ前の応力緩和応答により、初期ピーク応力は軸方向荷重方向で高く、応力の減少率は軸方向荷重方向と比較して円周方向荷重方向で高かったことが報告されました(表1)。緩和時間(組織の短期[初期]および長期[平衡]挙動を記述するτ1 およびτ2 )も、同じ10%プレストレッチ群の円周荷重方向と比較した場合、軸方向荷重方向において高かった。破損データを比較すると、0%と10%のストレッチ前のグループの両方で、周方向荷重方向で破損応力と E 値が高く、軸方向荷重方向に報告された破損ひずみは高かった(表2)。これらの予備的知見は、気管組織における応力緩和および破壊応答をさらに特徴付けて、軸方向または円周方向の両方の引張荷重条件における応力緩和応答をよりよく理解するための追加の実験を正当化する。このプロトコルで概説されている手順は、この目標を達成するのに役立ちます。

図 1: 組織採取と機械的試験の詳細。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:障害部位 黄色の矢印で示す障害部位の例。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:10%ひずみに予め延伸された気管サンプルの300秒保持における応力緩和応答(A)軸方向または(B)円周荷重(荷重条件ごとにn = 1)。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図 4: プレストレッチなしまたは 10% プレストレッチ (荷重条件ごとに n = 1 回)に続く軸方向または円周方向の荷重下での気管サンプルの故障試験の応力-ひずみ応答。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

表1:300秒間の応力緩和を受けるために10%ひずみのプレストレッチを施した気管サンプルについて、応力緩和パラメータ値を測定および計算した。

表2:様々な実験群における気管サンプルの障害応答。

補足コーディングファイル1:気管のストレス緩和行動を研究するためのカスタムコード。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

著者らには開示するものは何もありません。