等温滴定熱量測定を用いたDNAアプタマーとテトラサイクリンの熱力学的および速度論的会合の決定(英語)

サマリー

本プロトコルは、等温滴定熱量測定(ITC)を使用して、DNAアプタマーとテトラサイクリンの間の結合の会合および解離速度論を分析し、サンプル調製、標準およびサンプルの実行、および結果のデータの解釈を含むことを説明しています。

要約

アプタマーとその標的との間の結合親和性と挙動の決定は、適用するアプタマーを選択して使用する上で最も重要なステップです。アプタマーと低分子の間には劇的な違いがあるため、科学者はそれらの結合特性の特性評価に多大な努力を払う必要があります。等温滴定熱量測定(ITC)は、この目的のための強力なアプローチです。ITCは、解離定数_(Kk)の決定を超えて、溶液相における2つの分子間の相互作用のエンタルピー変化と結合化学量論を提供することができます。このアプローチは、ラベルフリー分子を使用して連続滴定を行い、各滴定によって生成される結合イベントで時間の経過とともに放出された熱を記録するため、このプロセスでは高分子とその小さなターゲット間の結合を高感度に測定できます。ここでは、小さな標的であるテトラサイクリンを用いて選択されたアプタマーのITC測定の段階的な手順を紹介します。この例は、この手法の汎用性と他のアプリケーションへの可能性を証明しています。

概要

アプタマーは、^{所望の標的1,2}に対する高い結合親和性および特異性を有する進化過程を通じて選択されたssDNAまたはRNA断片であり、これは高度な認識要素または化学抗体として働き得る^3,4,5。したがって、アプタマーの標的への結合親和性と特異性は、アプタマーの選択と適用において重要な役割を果たし、等温滴定熱量測定(ITC)はこれらの特性評価の目的で広く使用されています。ITC、表面プラズモン共鳴(SPR)、比色滴定、マイクロスケール熱泳動(MST)、バイオレイヤー干渉法(BLI)など、アプタマーの親和性を決定するために多くのアプローチが使用されてきました。その中で、ITCは、溶液相における2つの分子の熱力学的および速度論的会合を決定するための最新の技術の1つです。このアプローチは、ラベルフリー分子を用いて連続滴定を行い、各滴定によって生じる結合事象に対して経時的に放出された熱を記録する^6,7。他の方法とは異なり、ITCは結合親和性、いくつかの結合部位、および熱力学的および速度論的会合を提供することができます(図1A)。これらの初期パラメータから、ギブズの自由エネルギー変化とエントロピー変化は、次の関係を使用して決定されます。

ΔG = ΔH-TΔS

つまり、ITCは分子間相互作用の完全な熱力学的プロファイルを提供し、結合メカニズムを解明します(図1B)。アプタマーと低分子の結合親和性の決定は、アプタマーとターゲットのサイズが大きく異なるため困難です。一方、ITCは分子を標識したり固定化したりすることなく高感度な測定が可能で、測定中にアプタマーやターゲットの自然な構造を保つことができます。上記の特性により、ITCは、アプタマーと小さなターゲットとの間の結合の特性評価のための標準的な方法として使用できます。

Guグループによる選択後、このアプタマーは、電気化学的アプタマーベースのバイオセンサー、競合する酵素結合アプタマーアッセイ、テトラサイクリン^8,9,10のハイスループット検出を達成できるマイクロタイタープレートなど、さまざまなプラットフォームと統合されました。しかしながら、その結合特性は、適切なプラットフォームを選択するのに十分なほど十分に解明されていない⁸;ITCを用いてアプタマーのテトラサイクリンへの結合を特徴付ける価値がある。

プロトコル

注: 図2 は、DNAアプタマーとテトラサイクリンの熱力学的および速度論的会合を決定するためのITC実験の主なステップを示しています。

1. サンプルの調製

注:ITCのサンプルは、サンプルセルとシリンジからの異なるバッファーの混合による熱放出を避けるために、アプタマーとリガンドの両方で同じバッファーで調製する必要があります。これは通常、すべての材料を同じバッファーに透析することによって達成されます。バッファーは、以下のようにいくつかの変更を加えた3 kDa分子量カットオフ(MWC)濃縮器のプロトコルに適合したプロトコルを使用して交換されます。

1. 以下の手順を使用して、メーカーから購入した1x PBS、pH 7.4で透析カラムのメンブレン(3 kDa MWC)を活性化します:1xバッファー(PBS)で充填し、RTで10分間平衡化し、5,000 x g で15分間遠心分離します。
2. バッファーを除去し、500 μLのアプタマーサンプルをカラムにロードし、5,000 x gで遠心分離し、4回繰り返して元のバッファーを1x PBSに交換します。バッファーが膜を通過すると、質量が3 kDa未満のすべての分子が膜を通過し、アプタマーは膜の上側に残ります。
3. 透析したDNAアプタマーをピペットで回収し、新しい1.5 mLチューブに移します。
4. 最後のフロースルーバッファーを収集して、テトラサイクリンを溶解します。テトラサイクリン粉末は純粋で小さいので、透析は必要ありません。ただし、シリンジ内の実験用のバッファーが参照セル内のバッファーと一致することを確認するために、ターゲットのDNA用に以前に透析されたバッファーを使用してください。
5. 紫外可視分光計を用いて再度アプタマー濃度を測定します。最後の交換バッファーを使用して、濃度を40 μMテトラサイクリンおよび2 μMアプタマーに調整します。
6. DNAアプタマーを90°Cで10分間加熱し、4°Cで10分間冷却した後、RTに20分間戻します。
7. 折り畳まれたアプタマーと透析テトラサイクリンを、脱気ステーションまたは600 mmHgに設定した真空ポンプで25°C、25分間脱気し、溶存ガスを除去します。

2.機器の洗浄とテストキットの実行

1. 溶媒ポートを洗浄して、サンプルパス全体が透明であることを確認します。廃液を廃棄し、純粋なメタノール、水、バッファーをロードして洗浄します。各ポートには250mL以上が含まれており、洗浄に十分な溶液を確保します。
   注意: クリーニングプロセスは、ユーザーがプログラム可能なITC制御ソフトウェアによって自動的に完了します。
2. バッファを使用してITCをバッファに(つまり、1x PBSを1x PBSに)実行して、マシンの清浄度をテストします。
   注:通常のノイズベースラインは、小さなバッファからバッファインジェクションピークの間に見られます。滴定シリンジとカニューレが適切に洗浄され、完全に乾燥すると、ベースラインは安定します。ベースラインの増減は、汚れた計装や装置内の気泡を反映しており、実際のサンプルを実行する前に修正する必要があります。
3. EDTAとCaCl₂ (図3)を含む標準キットを使用して、デフォルトのプログラムを使用し、製造元の指示に従って、機械の精度をテストします。

3.サンプルを実行して、アプタマーとテトラサイクリンの結合を決定します

1. 実行パラメータを設定します:200rpmの攪拌速度、25°Cでの実行、2μMアプタマーと40μMテトラサイクリン、それぞれ2.0μLの30回の注入、180秒の遅延時間。
2. 実行中のプログラム計算機を使用して、必要なボリュームを確認します。この実行パラメータを使用して、ITCシリンジ内の230 μLの40 μMテトラサイクリンとITCサンプルセル内の485 μLの2 μMアプタマーを使用してITC測定を実行します。
3. 透析したテトラサイクリンシリンジプレートと折り畳まれたアプタマーを、ピペットを使用して気泡を避けてサンプルセルにロードします。
4. ソフトウェアのスタートボタンをクリックして、ITC機器の実行を開始します。
   注:ITC装置の実行プロセスは、リファレンスセルと滴定サンプルプレートを手動で充填した後、完全に自動化されています。

4.ソフトウェアを使用したデータ分析

1. ダブルクリックしてデータ分析ソフトウェアを開き、データの分析を開始します。
2. 保存した生データのパスを開いて、バインドの傾向を確認します。
3. [モデリング] タブを開き、さまざまなバインド モデルを使用して、データ カーブに最適なものを見つけます。次に、ソフトウェアはITCサーモグラムと、エンタルピー(ΔH)、エントロピー(ΔS)、自由エネルギー(ΔG)、平衡結合定数(Ka)、化学量論などのさまざまな熱力学的パラメータを自動的に計算します。
4. データとフィットモデル情報から決定された熱力学的パラメータを収集します。
5. 図4と表1に示すように、ITCサーモグラムの写真とさまざまな熱力学的パラメータを含むレポートを作成します。

結果

ITCは、正確な解離定数(_Kd)、結合化学量論、および2分子相互作用の熱力学的パラメータを提供します⁶。この例では、Kimら^9,11によって選択されたアプタマーは、_Kd 1 = 13 μM_{、K d} 2 = 53 nMの結合親和性でテトラサイクリンに結合します。興味深いことに、この結合は平衡ろ過法および63.3nMの報告された_Kdを用いて決定され、これは好ましい結合部位(部位2)と大差ない。ITCのフィッティングモデルと化学量論は、アプタマーがシーケンシャル結合モデルとの2:1の結合比でテトラサイクリンに結合することを反映しています(図4、表1)。

サイト2のITC測定に...

ディスカッション

ここで紹介する方法は、TA Instrumentsの指示に従って変更されており、当センターで選択された多くのアプタマーとターゲットの結合親和性と熱力学を決定するのに十分です。この手順の重要なステップには、リガンドに一致するターゲットを持つようにバッファーを交換すること、適切なパラメータでサンプルを実行すること、およびデータを分析するための適切な結合フィッティングモデルを見つけることが含まれます。熱放出を継続的に記録するには、バッファーの不一致、細胞とシリンジの汚れ、サンプル内の気泡など、すべてのノイズ熱を排除する必要があります。バッファー交換工程では、低分子を直接交換することは高価であるため、リガンドを溶解するために透析膜またはスピンカラムで最後の透析バッファーまたはフロースルーバッファーを使用する方が良い。

他のほとんどの結合親和性決定法は、アプタマーとリガンドの間の1:1の結合比を想定しています。しかし、結合挙動と低分子とアプタマーのサイズが大きく異なるため、1:1結合モデルは必ずしも正確ではありません^14,15

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
5'-CGTACGGAATTCG CTAGCCCCCCGGCAGGCCACGG C TTGGGTTGGTCCCACTGCGCG TGGATCCGAGCTCCAC GTG-3'Integrated	DNA Technologies, Inc		この配列は、ITCを使用してKdを特定していないGuの研究から採用されています(参考文献8および9を参照)
Affinity ITC Auto Low Volume (190 µL)システムコンプリート–Gold Cells	TA Instruments	61000.901	等温滴定型熱量測定システム
CaCl2	Avantor (VWR)	E506-100ML	塩化カルシウム 1 M 水溶液中、バイオテクノロジーグレード、滅菌
遠心分離機	エッペンドルフ	5417R	エッペンドルフ5417Rは、安全性、信頼性、使いやすさにおいて卓越した製品です。最大16,400 RPMで回転し、最大RCFは最大25,000 x gのブラシレスモーターでメンテナンスが非常に簡単です。
コンプリートデガッシングステーション(110/230V)	TAインスツルメンツ	6326	このデガッサーは、自己完結型の攪拌プラットフォーム、真空チャンバー、真空ポート、温度制御、電子タイマーを備えており、適切なサンプル調製が可能です。
EDTA	TekNova	E0375	EDTA 500 mM, pH 7.5
NanoDrop One 微量紫外可視分光光度計	ThermoFisher	ND-ONE-W	UV-Vis 分光光度計
Nanosep, Nanosep MF and NAB 遠心装置	ポール研究所	OD030C34	3 kDa 分子量カットオフ濃縮器
PBS pH 7.4	IBI 科学	IB70165	リン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、リン酸カリウム、および塩化カリウムを含むバッファー 超高純度滅菌 0.2 µ を使用してろ過。mフィルター。121°Cでオートクレーブ滅菌済み。C で 20 分以上。
Posi-Click 1.7 mL 大型マイクロ遠心チューブ	labForce (Thomas Scientific Brand)	1149K01
テトラサイクリン、ヒドロチョライド	EMD ミリポアコーポレーション	CAS64-75-5