モデル線虫の天然微生物叢の分離と特性評価

サマリー

Caenorhabditis elegans は生物学の主要なモデル種の1つですが、ほとんどすべての研究は、その自然に関連する微生物の不在下で行われています。ここで説明する方法は、将来の機能的 C.エレガンス 研究の基礎として、関連する微生物の多様性の理解を深めるのに役立ちます。

要約

線虫カ エノラブディティスエレガンスは 、自然界の多種多様な微生物と相互作用します。一般に、 C.エレガンスは 腐った植物、特にリンゴのような腐った果物や堆肥の山によく見られます。また、ナメクジやウッドスライスなどの特定の無脊椎動物の宿主にも関連しています。これらの生息地は微生物が豊富で、 C.エレガンスの 餌として機能し、線虫の腸に持続的にコロニーを形成することもできます。今日まで、生息地や地理的な場所を超えた在来の C.エレガンス 微生物叢の正確な多様性と一貫性は完全には理解されていません。ここでは、 C.エレガンスを 自然から分離し、ワームの微生物叢を特徴付けるための適切なアプローチについて説明します。線虫は、堆肥材料、腐ったリンゴ、ナメクジから簡単に分離したり、リンゴを堆肥の山に置くことによって引き付けることができます。北半球で C.エレガンス を見つけるのに最適な時期は9月から11月です。ワームは、基質を緩衝液に浸し、続いて線虫を捕集し、その後の分析のために線虫増殖培地またはPCR緩衝液に移すことによって、収集された基質材料から洗い流すことができます。さらに、サンプルを使用してワーム関連微生物を分離および精製し、微生物叢群集組成の16SリボソームRNA分析のためにワームを処理する方法を示します。全体として、記載された方法は、生息地および地理的位置にわたる C.エレガンス 微生物叢の特性評価に関する新しい研究を刺激し、それによって将来の機能研究の基礎として線虫の微生物叢の多様性と安定性の包括的な理解を得るのに役立つ可能性があります。

概要

自然界では、C.エレガンスは腐った植物、特にリンゴのような腐った果物や堆肥の山によく見られます¹。また、ナメクジやウッドスライスなどの特定の無脊椎動物の宿主にも関連しています^2,3。これらの生息地は微生物が豊富で、ワームの餌として役立つだけでなく、それと安定した関係を形成する可能性もあります。天然関連微生物の多様性に関する情報は、2016年にのみ公開されました^4,5,6。それ以来、これらおよびほんの数件の最近の研究により、C.エレガンスはさまざまな細菌および真菌と関連していることが明らかにされており、最も一般的にはシュードモナス属、エンテロバクター属、オクロバクトラム属、エルウィニア属、コマモナス属、グルコノバクター属、および他のいくつかの細菌が含まれます^6,7,8。^<....

プロトコル

1. バッファーと培地の調製

1. 5.85 gのNaCl、1.123 gの_K2HPO 4、5.926 gのKH2 PO₄、および1 Lの脱イオン化_H2Oをフラスコとオートクレーブに加え、121°Cで20分間、Sバッファーを調製します。
2. 1.2%(w/v)ヒドロキシメチルセルロース(培地の粘度の原因となる物質)、5 mg/mLコレステロール、1 mM MgSO₄、1 mM CaCl₂、および0.1%(v/v)アセトンを含むSバッファーを加えて粘性培地を調製します。オートクレーブし、粘性媒体が完全に均質になるまで撹拌する。
   注: これには数時間かかる場合があります。また、S-バッファーは、事前の滅菌なしで粘性媒体に直接調製して添加することができます。
3. 3 gのKH 2 PO 4、6 gのNA 2 HPO₄·2 H 2 O、5 gのNaCl、および1 Lの脱イオン化H₂Oを1 Lフラスコに加えることにより、M9バッファーを調製します。溶液をオートクレーブし、冷却後、1mLの1M MgSO 4(500mLの脱イオンH 2 O中に123.24g....

結果

線虫C.エレガンスは、リンゴなどの果物の分解や堆肥サンプルに頻繁に見られます。北ドイツでは、主に9月から11月²日まで、C. elegansと同属種(特にC. remaneiだけでなくC. briggsae)が見られます。線虫は、植物物質、特にリンゴやナシなどの腐った果物、および堆肥、特に高グレードの分解を示す材料に最も一般的に見られます。果物と堆肥のサンプルを実験室に持ち込み(図3A、B)、ペトリ皿に分配し(図3C、D)、その後、液体または粘性媒体に浸して、ワームを基質材料から離れて培地の表面に泳ぐように強制することができます(図3E、F)。その後、ワームを収集し、寒天プレートまたは微小遠心チューブに移し、診断PCRを使用して種の同一性を決.......

ディスカッション

線虫カエノラブディティスエレガンスは、生物学研究で最も集中的に研究されているモデル生物の1つです。これは、もともと神経系の発達と機能を理解するために、1960年代にシドニーブレナーによって導入されました²⁹。それ以来、C. elegansは、行動生物学、神経生物学、老化、進化生物学、細胞生物学、発生生物学、免疫学など、すべての生物学分野にわたる基本的なプロセスを研究するための強力なモデルになりました。その成功は、約3日間の短い世代時間、培養の容易さ、透明な体(効率的な表現型を可能にする)、凍結の生存、効率的な滅菌と発生同期、および突然変異誘発、CRISPR-Cas、またはRNAiによる遺伝子操作の効率的な方法。今日、C.エレガンスは世界中の約1,500の研究所で研究されています。シドニーブレナーが実験室でモデルシステムとしてC.エレガンスを最初に確立したとき、彼はグラム陰性菌エシェリヒアコリOP50で細菌性線虫を食料源として増殖させました。それ以来、C.エレガンスは世界中の研究所で<.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
COMSOL	COMSOL		マルチフィジックスシミュレーションソフトウェア