in vitroでのドラッグデリバリーシステムと細胞間の相互作用の実験的定量:前臨床ナノメディシン評価のためのガイド

Summary

フローサイトメトリーを使用して薬物キャリアと細胞間相互作用の絶対定量を行うためのワークフローが実証され、新しい薬物送達システムのより合理的な評価が可能になります。このワークフローは、あらゆるタイプの薬物キャリアに適用できます。

Abstract

ドラッグデリバリーシステムの設計の主要なコンポーネントは、特定の細胞タイプとの相互作用を増幅または減衰させる方法に関係しています。例えば、化学療法は、癌細胞への結合を増強するために抗体で機能化され(「ターゲティング」)、または免疫細胞の認識を回避するのを助けるためにポリエチレングリコールで機能化され得る(「ステルス」)。細胞レベルであっても、薬物キャリアの結合と取り込みを最適化することは、複雑な生物学的設計上の問題です。したがって、新しい運送業者がセルとどの程度強く相互作用するかを、そのセルに配送された運送業者の貨物の機能的有効性から分離することは価値があります。

化学療法の例を続けると、「がん細胞にどれだけうまく結合するか」は、「がん細胞をどれだけうまく殺すか」とは別の問題です。後者の定量的 in vitro アッセイは十分に確立されており、通常は生存率の測定に依存しています。ただし、細胞キャリア相互作用に関するほとんどの公開された研究は、定性的または半定量的です。一般に、これらの測定は担体の蛍光標識に依存しており、その結果、細胞との相互作用を相対的または任意の単位で報告します。ただし、この作業は標準化され、少数の特性評価実験で絶対的に定量化できます。このような絶対定量は、ナノ粒子、微粒子、ウイルス、抗体薬物複合体、操作された治療細胞、または細胞外小胞など、さまざまな薬物送達システムの合理的なクラス間およびクラス内の比較を容易にするため、価値があります。

さらに、定量化は、その後のメタアナリ シスまたはインシリコ モデリングアプローチの前提条件です。この記事では、キャリアサイズと標識モダリティの違いを考慮したビデオガイドと、キャリアドラッグデリバリーシステムの in vitro 定量を実現する方法の決定木を紹介します。さらに、高度なドラッグデリバリーシステムの定量的評価に関するさらなる考慮事項について説明します。これは、次世代の医療の合理的な評価と設計を改善するための貴重なリソースとして機能することを目的としています。

Introduction

遭遇する細胞タイプに応じて特異的に設計された挙動を示すドラッグデリバリーコンストラクトの設計は、大きな研究関心を集めています。潜在的な薬物送達構築物または「担体」には、脂質製剤、ナノ成長無機物、ポリマー集合体、細胞外小胞、機能化された細菌細胞、または修飾ウイルスが含まれる。これらはすべて、物理的特性、表面特性、または抗体付着などの操作された化学的機能化により、臓器、組織、または細胞の特異性を示す可能性があります^1,2。

in vitro担体評価におけるほぼユビキタスなステップは、前記薬物担持担体を含む懸濁液と共に細胞をインキュベートすることである。インキュベーション後、キャリア性能は、トランスフェクション効率や毒性などの薬剤貨物の性能の機能的読み出しによって測定されます。機能読み出しは、キャリアの有効性の下流の尺度であるため、有用です。しかし、より複雑な薬物送達構築物の場合、機能的な読み出しを超えて、目的の細胞とのキャリア相互作用の程度を個別に定量することがますます重要になっています。これにはいくつかの理由があります。

第一に、さまざまな貨物を運ぶことができる「プラットフォーム」キャリア技術の発見(および反復的な改善)への関心が高まっています。例えば、RNAをカプセル化....

Protocol

1.適切なストリームの選択

1. 図 1 で概説されている決定木に従って、使用する実験セットアップに最適なワークフロー (ストリーム) (図 2) を決定します。このストリームの選択に関するさらなるコメントについては、ディスカッションを参照してください。
2. サイトメーターストリームに従う場合は、手順2.1.1〜2.2.7に進みます。バルクストリームに従う場合は、手順 3.1.1.1-3.1.5.7 に進みます。

図 1: ワークストリームのデシジョン ツリー。 使用する Stream の決定は、主に対象のキャリアの種類によって異なります。より大きなキャリアや散乱特性の高いキャリアは、サイトメーターで個別に検出できるため、サイトメーターストリームを使用した定量に適していま....

Results

前述のように、異なる薬物キャリアタイプは、細胞キャリア会合の絶対定量のために異なる技術の使用を必要とする。例えば、633 nmのジスルフィド安定化ポリ(メタクリル酸)(PMA_SH)コアシェル粒子は、高感度フローサイトメーターを使用して検出するのに十分な大きさと密度です。そのため、これらの粒子を蛍光標識し、サイドアングル光散乱(SALS、SSCに類似)と適切な蛍光チャネルを使用してゲートしてカウントしました(図3)。両チャネルのイベント数の差は1.98%で、許容範囲内でした。

対照的に、100 nmの超常磁性酸化鉄ナノ粒子は小さすぎて個別に検出できないため、バルクストリームを使用して分析しました。これらのナノ粒子を計数し、ナノ粒子追跡分析を用いて特性評価した(図4)。136nmの平均ナノ粒子サイズは、水中のナノ粒子の流体力学的直径を反映しています。測定されたナノ粒子濃度(実行された希釈に対してまだ補正されていない)は、装置のダイナミックレンジ内.......

Discussion

薬物キャリアと細胞の間の相互作用を特徴づけることは、新しい薬物送達システムの開発においてますます重要になっています。具体的には、様々な担体構築物の合理的な評価および比較を可能にするために、標的細胞およびオフ標的細胞と相互作用する前記担体の性能の絶対定量化が重要である。このプロトコルは、薬物キャリアを扱う研究者が、細胞キャリアの会合に関する相対的な半定量的フローサイトメトリーデータを絶対定量結果に変換できるようにする2ストリーム方法論について説明しています。概説されたプロセスは、蛍光標識されていれば、小型、大型、有機、無機など、あらゆるタイプの担体に適用できます。ただし、キャリアが異なれば、セルあたりのキャリアを計算するために必要なアプローチも異なります。これは、必要な特性評価測定に使用されるさまざまな計測器の制限によるものです。

そのため、このプロトコルは、サイトメーターストリームとバルクストリームの2つのストリームに分割されます。1つ目のサイトメーターストリームは、フローサイトメーターのみを必要とするより簡単なアプローチですが、このサイトメーターは、使用する個々のキャリアを検出す.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
150 nm、235 nm、または 633 nm PMASH 担体の標識	Alexa Fluor 647 C2 Maleimide	Invitrogen	A20347
。Apogee A50 Microflow	Apogee		Sensitive Flow Cytometer can detecting small carriers for counting
CytoFLEX S Flow Cytometer	Beckman Coulter		小さなキャリアを検出してカウントし、最終的な細胞バリア実験のために読み出すことができる高感度フローサイトメーター
FCS Express	De Novoソフトウェア		フローサイトメトリーデータの解析、すなわちゲーティングを行い、選択した集団の蛍光強度中央値を導出するために使用されるソフトウェアです。代替手段には、FlowJo、OMIQ、Python
Infinite 200 PRO	Tecan Lifesciences		溶液中のキャリアのバルク蛍光測定に使用される標準マイクロプレートリーダー装置
LSRFortessa Cell Analyzer	BD Biosciences		感度の低いフローサイトメーターですが、研究者が一般的に利用できるものが1つあります。最終的な細胞キャリア実験の読み出しに使用可能
NanoSight NS300	マルバーン・パアナリティ		カル ナノ粒子追跡分析に使用される
装置 プリズム8	GraphPad		ソフトウェアは、標準曲線のグラフ化と計算に使用されます。代わりに、Microsoft Excel、Origin、Minitab、Pythonなど、多くの
Quantum MESFキット、Alexa Fluor 647	、Bangs Laboratories	647	フローサイトメーター用Absolute定量ビーズなどがあります。マイクロプレートリーダーでバルクで測定した蛍光強度を、MESF標準物質を用いたフローサイトメーターで測定した蛍光強度に変換するために使用します