P3HR1細胞株からのエプスタインバーウイルスの単離と定量

サマリー

このプロトコルは、ホルボール12-ミリステート13-アセテートでウイルス溶解サイクルを誘導する際に、ヒトP3HR1細胞株からエプスタインバーウイルス粒子を単離することを可能にします。続いて、ウイルス調製物からDNAを抽出し、リアルタイムPCRに供してウイルス粒子濃度を定量化する。

要約

正式に はヒトヘルペスウイルス4 (HHV-4)と指定されたエプスタインバーウイルス(EBV)は、最初に単離されたヒト腫瘍ウイルスです。世界の成人人口のほぼ90〜95%がEBVに感染しています。分子生物学と免疫学の最近の進歩に伴い、in vitro および in vivo の両方の実験モデルの適用により、多くの疾患におけるEBVの病因およびEBV関連の腫瘍形成に関する深く有意義な洞察が得られました。この視覚化された実験論文の目的は、P3HR1細胞株の細胞からのEBVウイルス粒子の単離の概要を提供し、続いてウイルス調製物を定量することです。もともとヒトバーキットリンパ腫から単離されたP3HR1細胞は、2型EBV株であるP3HR1ウイルスを産生することができる。EBV溶解サイクルは、ホルボール12-ミリステート13-アセテート(PMA)で処理することにより、これらのP3HR1細胞において誘導され、EBVウイルス粒子を生じる。

EBV粒子の単離にこのプロトコルを使用して、P3HR1細胞を35 ng/mL PMAを含む完全なRPMI-1640培地で37°Cおよび5%_CO2 で5日間培養します。続いて、培養液を120 x g の速度で8分間遠心分離し、細胞をペレット化します。次に、ウイルスを含む上清を収集し、16,000 x g の速度で90分間スピンダウンして、EBV粒子をペレット化します。次いで、ウイルスペレットを完全なRPMI-1640培地に再懸濁する。これに続いて、DNA抽出と定量的リアルタイムPCRを行い、調製物中のEBV粒子の濃度を評価します。

概要

エプスタインバーウイルス(EBV)は、単離された最初のヒト腫瘍ウイルスです¹。正式には ヒトヘルペスウイルス4 (HHV-4)²と呼ばれるEBVは、ヘルペスウイルスファミリーのガンマヘルペスウイルスサブファミリーの一部であり、 リンフォクリプトウイルス 属のプロトタイプです。世界の成人人口のほぼ90〜95%がウイルスに感染しています³。ほとんどの場合、最初の感染は生後3年以内に発生し、無症候性ですが、青年期に感染が後期に発生すると、感染性単核球症と呼ばれる病気を引き起こす可能性があります⁴。EBVは、休止中のB細胞に感染して増殖性Bリンパ芽球になり、ウイルスが潜伏感染状態を確立し維持することができます⁵。EBVはいつでも再活性化する可能性があるため、再発性感染症につながる可能性があります⁶。

過去50年間で、一部のウイルスとヒト悪性腫瘍の発症との関連がますます明らかになり、今日では、すべてのヒト癌の15%から20%がウイルス感染に関連していると推定されています⁷。EBVを含むヘルペスウイルスは、これらのタイプの....

プロトコル

注:EBVは潜在的にバイオハザード物質と見なされる必要があるため、バイオセーフティレベル2以上の封じ込めの下で取り扱う必要があります。白衣と手袋を着用する必要があります。水しぶきにさらされる可能性がある場合は、目の保護も考慮する必要があります。以下の手順は、生物学的安全キャビネットで実施する必要があります。

1. P3HR1細胞のカウント

1. 細胞の遠心分離と再懸濁
   1. 進行中のP3HR1細胞培養の100 mm培養プレート(またはT-25フラスコ)から80%コンフルエントで細胞懸濁液を15 mLコニカルチューブに移します。P3HR-1細胞の播種密度は1 x 10⁶ 細胞/mLです。完全なRPMI培養培地(79%RPMI培養培地、20%ウシ胎児血清、1%ペンストレプ系抗生物質)で37°Cおよび5%_CO2で維持し、3〜4日ごとに継代します。
   2. 120 x gで8分間遠心分離する。遠心分離後、上清を捨て、細胞ペレットを1 mLの完全RPMI培養培地に再懸濁し、よく混合します(この溶液を懸濁液Aと呼びます)。
2. 計数のための細胞懸濁液の準備
   1. 細胞懸濁液A2 μLと培養液8 μLを混合して、希釈した細胞懸濁液Bを調製します。懸濁液Bに0.4%トリパンブルー10 μLを加えて懸濁液Cを得る。 ....

結果

この手順の目的は、既知のウイルス力価を有する懸濁液中のEBV粒子を単離することであり、その後EBV感染をモデル化するために使用することができる。したがって、手順から最高のEBV収率を得るために、さまざまな試薬の最適濃度を使用することが最も重要です。

最も多くのEBV粒子を生成するPMAおよびDMSOの濃度を決定するために、最適化試験が実施されました(図2)。DMSO濃度0.8%、PMA濃度35 ng/μLが最適であり、高いEBV濃度が得られました。最適化プロトコルから得られたウイルス粒子の濃度は917,471ウイルス粒子/μLでした。

図2

ディスカッション

EBV粒子の生産は、このウイルスの生物学とそれに関連する病気を理解するために必要です。ここでP3HR-1細胞株からのこれらの粒子の産生について記載した。この細胞株は唯一のEBV産生株ではありません。実際、EBV粒子は、B95-8細胞^21,22ならびにRaji細胞株^18,19からも単離されている。EBV溶解サイクルは、n-酪酸でこれらの細胞で誘導されています。あるいは、ホルボール12−ミリスチン酸−13−アセテート(PMA)としても知られる12−O−テトラデカノイルホルボール−13−アセテート(TPA)などのホルボールエステルを使用することができる。全体として、ここで詳述するプロトコルは、P3HR-1株の代わりにこれらの細胞を使用して使用することができる。しかし、B95-8系統は、現在絶滅危惧種の霊長類として分類されているコットントップタマリン(Saguinus oedipus)に由来して.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.2 mL薄肉PCRチューブ	Thermo Scientific	AB0620	使用前にオートクレーブ滅菌する必要があります
0.2-10 µLマイクロボリュームフィルターチップ	コーニング	4807	前にオートクレーブ滅菌する必要があります
0.5-10µLピペット	BrandTech	704770
10 mL使い捨て血清ピペット	Corning	4488
1000 µLフィルター付きピペットチップQSP		TF-112-1000-Q
100-1000 µL ピペット	エッペンドルフ	3123000063
100x20 mm Cuture Plates	Sarstedt	83.1802
10-100 µL ピペット	BrandTech	704774
15 mL コニカルチューブ	Corning	430791
200 µLフィルター付きピペットチップQSP		TF-108-200-Q
20-200 µL ピペット	エッペンドルフ	3123000055
50 mL コニカルチューブ	コーニング	430828
CFX96 リアルタイム C-1000 サーマルサイクラー	バイオ・ラッド	184-1000
DMSO	アムレスコ	0231
DNase/RNase フリーウォーター	ザイモリサーチ	W1001-1
EBER プライマー	マクロゲン	N/A	カスタムメイドプライマー
EBV DNA制御(標準)	Vircell	MBC065
エタノール(実験室試薬グレード)	Fischer Chemical	E/0600DF/17
Fetal Bovine Serum	Sigma	F9665
Fresco 21 MicroCentrifuge	Thermo Scientific	10651805
Glycogen Solution	Qiagen	158930
血球計算盤	BOECO	BOE 01
倒立型光学顕微鏡	ツァイス	アクシオーバート 25
iTaq ユニバーサル SYBR グリーン スーパーミックス	バイオ・ラッド	172-5121
微量遠心チューブ	Costar (Corning)	3621	使用前にオートクレーブ滅菌が必要
P3HR-1 細胞株	ATCC	HTB-62
ペニシリン-ストレプトマイシンソリューション	Biowest	L0022
Phenol	VWR	20599.297
ホルボール 12-ミリスチン酸 13-アセテート (PMA)	Sigma-Aldrich	P8139
ピペットフィラー	Thermo Scientific	9501
精密ワイプ	Kimtech	7552
RPMI-1640 培地	Sigma	R7388
SL 16R 遠心分離機	Thermo Scientific	75004030
酢酸ナトリウム	Riedel-de Haën (ハネウェル社)	25022
分光光度器	DeNovix	DS-11
Tris-HCl	Sigma	T-3253
トリパンブルーソリューション	Σ	T8154
ウォータージャケット付き CO2 インキュベーター	Thermo Scientific	4121

使用