生物医学アプリケーション向けの蛍光寿命マクロイメージャ

サマリー

この論文では、長い崩壊発光サンプルの巨視的なフォトルミネッセンスライフタイムイメージングのための新しい高速光学イメージャーの使用について説明します。統合、画像取得、および分析手順、およびイメージング用のセンサー材料の準備と特性評価、および生物学的サンプルの研究におけるイメージャーの適用について説明します。

要約

この論文では、固体のO 2感受性コーティングから可溶性O₂感受性プローブで染色された生きた動物組織サンプルまで、さまざまなリン光サンプル中の分子状酸素(O₂)濃度をマッピングするように設計された新しいフォトルミネッセンスライフタイムイメージャーを紹介します。特に、625nmの発光ダイオード(LED)で励起可能で760nmで発光するナノ粒子ベースの近赤外プローブNanO2-IRを用いた。イメージングシステムは、Timepix3カメラ(Tpx3Cam)と、イメージインテンシファイアも収容するオプトメカニカルアダプターに基づいています。O₂リン光寿命イメージング顕微鏡(PLIM)は、様々な研究に一般的に必要とされるが、現在のプラットフォームは、その精度、一般的な柔軟性、およびユーザビリティにおいて限界を有する。

ここで紹介するシステムは、統合された光学センサーと読み出しチップモジュールであるTpx3Cam上に構築された、高速で高感度のイメージャーです。表面染色された腸組織サンプルまたは大腸の管腔内染色断片から高強度のリン光シグナルおよび安定した寿命値を生成することが示され、約20秒以下で組織_O2 レベルの詳細なマッピングを可能にする。無意識の動物の移植腫瘍における低酸素症のイメージングに関する最初の実験も提示されています。また、励起用の390 nm LEDと発光用のバンドパス650 nmフィルターを使用して、Pt-ポルフィリン色素に基づく_O2感応材料で使用するためにイメージャを再構成する方法についても説明します。全体として、PLIMイメージャは、使用されたプローブの寿命値および_O2 濃度のそれぞれの2次元マップの正確な定量的測定値を生成することが見出された。また、 ex vivo 組織モデルや生きた動物の代謝イメージングにも有用です。

概要

O 2は生命システムにとって重要な環境パラメータの1つであり、O 2の分布とそのダイナミクスに関する知識は多くの生物学的研究にとって重要です_1,2,3。リン光プローブ4,5,6,7,8およびPLIM9,10,11,12,13による組織酸素化の評価は、生物学的および^{医学的研究}3,9,14,15,16において人気を集めている。 17、^18、19。これは、PLIMが蛍光や燐光強度の測定とは異なり、プローブ濃度、光退色、励起強度、光学アライメント、散乱、自家蛍光などの外的要因の影響を受けないためです。

しかしながら、現在の_O2 PLIMプラットフォームは、それらの感度、画像取得速度、精度、および一般的なユーザビリティによって制限される。ラスタースキャン手順と組み合わせた時間相関単一光子計数(TCSPC)は、PLIMおよび蛍光寿命イメージング顕微鏡(FLIM)デバイス^20、21、22で頻繁に使用されます。しかしながら、PLIMは長いピクセル滞留時間(ミリ秒の範囲)を必要とするので、画像取得の時間は、FLIMアプリケーション^20、22、23に必要とされる時間よりもはるかに長い。ゲート付きCCD / CMOSカメラなどの他の技術は、単一光子感度に欠け、フレームレートが低い^20,24,25,26です。さらに、既存のPLIMシステムは主に微視的フォーマットで使用されていますが、巨視的システムはあまり一般的ではありません²⁷。

TCSPCベースのPLIMマクロイメージャ²⁸ は、これらの制限の多くを克服するためにセットアップされた。イメージャーの設計は、次の新しいオプトメカニカルアダプターCricketを使用することで大幅に容易になりました:i)背面のカメラモジュールと前面の対物レンズを簡単に結合できる2つのCマウントアダプター。ii)イメージインテンシファイア用の内部ハウジングと、クリケットの外側にある後者用の電源ソケット。iii)前面Cマウントアダプターの後ろの内部スペースで、標準の25mmエミッションフィルターをインテンシファイアの前に収納できます。iv)リングレギュレーターを備えた内蔵の光コリメート光学系により、レンズとカメラ間の光学的位置合わせ/焦点合わせが可能になり、カメラチップ上に鮮明な画像が生成されます。

組み立てられたイメージャーでは、カメラモジュールはクリケットアダプターの裏側に結合され、光電陰極とそれに続くマイクロチャネルプレート(MCP)、増幅器、および高速シンチレーターであるP47蛍光体で構成されるイメージインテンシファイアも収容されています。クリケットの内部には760nm±50nmの発光フィルターが取り付けられ、前面のCマウントアダプターには対物レンズNMV-50M11''が取り付けられています。最後に、レンズとカメラはリングレギュレーターと光学的に位置合わせされます。

インテンシファイアの役割は、入射する光子を検出し、それらをカメラチップ上で高速の光バーストに変換することであり、それらは登録され、発光減衰と生涯画像を生成するために使用されます。カメラモジュールは、高度なTCSPCベースの光学センサーアレイ(256ピクセルx 256ピクセル)と新世代の読み出しチップ29,30,31,32,33で構成されており、1.6nsの時間分解能と80Mpixel/sの読み出し速度で、イメージングチップの各ピクセルでのフォトンバーストの到着時間(TOA)と時間超過しきい値(TOT)の同時記録を可能にします。

この構成では、インテンシファイアを備えたカメラは単一光子感度を有する。これは、データ駆動型であり、高速ピクセル検出器読み出し(SPIDR)システム³⁴に基づいている。イメージャの空間分解能は、平面燐光_O2 センサおよび分解能プレートマスクを用いて予め特徴付けられた。機器の応答関数(IRF)は、他のすべての測定に使用したのと同じ設定で平面蛍光センサーのイメージングによって測定されました。約2.6nsの色素の寿命は、PLIMモードでのIRF測定に使用するのに十分短かった。イメージャは、最大18 mm x 18 mmのサイズのオブジェクトを、それぞれ39.4 μmおよび30.6 ns(半値で全幅)の空間分解能と時間分解能でイメージングできます²⁸。

以下のプロトコルは、マクロイメージャの組み立て、および以前に特徴付けられた近赤外_O2プローブ、NanO2−^IR35で染色された生物学的試料中の_O2濃度をマッピングするためのその後の使用について記載している。このプローブは、白金(II)ベンゾポルフィリン(PtBP)色素をベースにした、明るく光安定性のある細胞透過性のO₂センシングプローブです。それは625nmで励起性であり、760nmで放出し、生理学的範囲(0%〜21%または0〜210μMのO2)の_O2に対して堅牢な光学応答を提供する。イメージャーは、Pt(II)-ポルフィリン色素に基づくさまざまなセンサー材料の特性評価も実証されています。全体として、イメージャーはコンパクトで柔軟性があり、一般的な写真カメラに似ています。現在のセットアップでは、イメージャはさまざまな広視野PLIMアプリケーションに適しています。LEDを高速レーザー光源に置き換えると、イメージャの性能がさらに向上し、ナノ秒のFLIMアプリケーションが可能になる可能性があります。

プロトコル

動物を使ったすべての手順は、欧州共同体理事会指令(2010/63 / EU)に従って健康製品規制当局(HPRA、アイルランド)によって発行された承認の下で実行され、ユニバーシティカレッジコークの動物実験倫理委員会によって承認されました。

1. サンプル調製

1. 生体外での生体外組織サンプルのプローブによる染色
   1. ex vivoアプリケーションの場合は、4週齢の雌Balb/cマウスから新たに単離された組織サンプルを使用します。
   2. 実験当日、マウスを断頭で安楽死させ、大きさ約10mmの結腸(大腸)の断片を素早く解剖する。直ちにPBS緩衝液で洗浄し、10 mM Hepes緩衝液(pH 7.2)を添加したDMEM培地に入れ、37°Cでインキュベートします³⁶。
   3. 腸の漿膜側の表面染色では、生きた組織サンプルをミニディッシュに移し、1 mg/mL NanO2-IRプローブを含む2 mLの完全DMEMを塗布して組織サンプルを覆い、37°Cで30分間インキュベートします。
      注:死後組織の細胞は、培養中で何時間も生き続けます。NaNO2-IRは軽度の細胞毒性を示すため、すべての実験は組織単離後4時間以内に完了しました。
   4. 深部組織管腔 内ex vivo 染色の場合は、腸の小片を乾燥したペトリ皿に移し、余分なDMEMをろ紙で取り除きます。
   5. 1 mg/mL NanO2-IR 35を含むDMEMを1 μLハミルトンシリンジで内腔に注入し、サンプルを¹⁵ 分間または最大4時間インキュベートします。
      注:NaNO2-IRは、軽微な長期細胞毒性作用を示します。したがって、すべての実験は組織単離後4時間以内に完了する必要があります。
2. 生きた動物における染色腫瘍組織の調製
   1. in vivoアプリケーションでは、0.05 mg/mLのNaNO2-IRプローブを含む無血清培地でCT26細胞を18時間プレ染色します。
   2. マウスを取り、右脇腹の注射領域を剃毛し、NanO2-IRで予め染色された1 × 10 5個の非染色細胞と1 × 10⁵個の細胞の混合物をシリンジ200μLで注射する。
   3. マウス内で腫瘍を増殖させ、ノギスで腫瘍の大きさと動物の体重を定期的に監視します³⁷。移植された腫瘍を有する動物は、腫瘍増殖の7日目にイメージングの準備が整う。
      注:腫瘍体積は、式(1)を使用して計算されました。
      V = (L × W 2)/² (1)
      ここで、Lは腫瘍の直径であり、Wisは直径Lに垂直な直径である。
   4. イメージングの直前に頸部脱臼によって動物を犠牲にします。

2. PLIMイメージングのセットアップ

1. クリケットアダプターを取り、裏側のCマウントアダプターを取り外して、内部のインテンシファイアハウジングにアクセスできるようにします。MCP-125イメージインテンシファイアをこのコンパートメントに挿入し、Cマウントアダプターを元に戻します。
2. クリケットの前面Cマウントアダプターを取り外し、760nm±50nmの発光フィルターを挿入し、Cマウントを元に戻して固定します。
3. Tpx3CamカメラモジュールをCマウントアダプター を介して クリケットモジュールの背面に接続します
4. Cマウントアダプター を介して レンズをクリケットモジュールの前面に接続します。
5. カメラアセンブリ全体を光学ブラックボックスの上に取り付け、サンプルを画像化するステージに下を向かせます(図1)。
6. 624nmの超高輝度LEDを、ブラックボックス内のブレッドボードに接続されたポストに取り付けます。
7. LEDを電源とパルス発生器に接続します。LEDのスイッチを入れ、焦点を合わせて、画像化されたサンプルの効果的かつ均一な励起を確保します。
8. カメラを別のパルス発生器に接続し、カメラに送られるパルスと^LED38とを同期させる。
9. クリケットユニットの専用ケーブルとソケットを使用して、インテンシファイアを標準電源に接続し、 ゲイン を 2.7Vに設定します。
10. レンズとクリケットアダプターのフォーカシング機能を使用して、カメラの光学系をサンプルステージに集束させ、コントラストと明るさの良いサンプルの鮮明な画像を生成します。
11. Pt-ポルフィリン色素を使用したイメージャーの使用には、励起用の 625 nm LED を 390 nm LED に交換し、クリケットモジュールでは 760 nm ± 50 nm フィルターを 650 nm ± 50 nm フィルターに交換します。

3. 画像取得

1. サンプルをカメラレンズの前に置きます。
   注意: サンプルの位置を調整して焦点を合わせるために、サンプルホルダーとしてx-y-z調整可能なステージを使用してください。
2. 部屋のすべての照明を消します。
3. Sophyソフトウェアの電源を入れて、フォーカシングやサンプルアライメントなどの操作パラメータを調整します。
   注意: Sophyソフトウェアは、イメージングパラメータを設定し、データを記録するためのカメラと一緒に提供されます。カメラのコードを確認して、ソフトウェアがカメラに接続されていることを確認してください。ただし、データ収集には別のプログラムを使用しました。
4. [モジュール] で、無限フレームを選択し、ピクセル操作モードをしきい値を超える時間に設定します。
5. [モジュール] で [プレビュー] に移動し、[アクティブなモジュール] を選択します。これにより、Medpix/Timpixフレームウィンドウが開きます。
6. このウィンドウで、 カラースケールを変更し、イメージを目的の方向に 回転 します。
7. インテンシファイアのスイッチを入れて、録音を開始します。
   注意: Sophyソフトウェアの記録画面を使用して、サンプルの位置合わせと焦点を視覚的に確認し、記録用のLED励起パラメーターを最適化します。
8. 録音を停止し、Sophyソフトウェアを閉じます。
9. ターミナルに移動し、カスタム設計されたソフトウェアを使用して、バイナリ形式で生データを取得し、後処理(https://github.com/svihra/TimePix3)します。
   1. ターミナルで、次のコマンドを実行してデータを記録します。
      CD ドキュメント/スピドル/トランク/リリース/
       です。
      ./Tpx3daq - i 1 - b 50 - m - s {ファイルの名前} - t {取得時間}
      注: 「ls」と入力したら、現在のディレクトリ内のファイルの一覧を確認します。Tpx3daq が表示されていることを確認します。
   2. すべてのフレームが記録されるまで待ちます。
   3. データを処理するには、ターミナルで次のコマンドを実行します 。
      cd ドキュメント/データ処理/タイムピックス3/タイムピックス3/
      根
      .L データプロセス.cpp++
      .x DRGUI.C
   4. RRGui ウィンドウが開くのを待ちます。左側ですべての変数を選択し、右側で [すべてのデータ]、[単一ファイル]、および [重心] を選択します。
   5. 処理するファイルを選択し、データレデューサーを実行します。
      注:処理されたすべてのファイルは、RAWファイルと同じフォルダーに表示されます。

4.データ分析

1. C言語で記述された専用プログラムで後処理データを解析し、データを.ics画像ファイル(https://github.com/lmhirvonen/timepix3cam)に書き込みます。
2. 無料で入手できる時間分解イメージングソフトウェアを使用して、.ics画像ファイルを開きます( 材料表を参照)。 2指数関数 を使用して、燐光減衰に適合させます。
3. 利用可能な画像解析ソフトウェアでフィット.ics画像ファイルを開きます( 材料表を参照)。
4. ルックアップテーブルを使用して、燐光寿命画像を生成し、それらを疑似カラースケールでエンコードします(たとえば、短い寿命の場合は青色、長い寿命の場合は赤色)。測定機能を使用して、画像全体または特定の関心領域(ROI)の平均寿命値を計算します。
5. 寿命値をプローブ³⁶の_O2校正のフィッティングから得られた式を用いて酸素濃度に変換する。
   注:この作業には式(2)が使用されました。
   O 2 [μM] = −86.16 + 770.35 × e^{−0.049 × LT} (2)

結果

ex vivoイメージングアプリケーションの場合、腸組織の断片は、組織の漿膜側にNanO2-IRプローブの局所適用によって染色されました。より深い染色のために、1μLのプローブを内腔に注入した。後者の場合、厚さ0.2〜0.25 mmの腸壁がプローブをカメラから遮蔽しました。2つの染色プロセスを図2Aに示します。

得られた強度とPLIM画像を図2B-Gに示します。色は、寿命値の違い、したがって、組織の漿膜側と粘膜側の酸素化の違いを明確に反映しています。図2Cおよび図2Dは、局所的(図2C)および管腔内(図2D)に染色された類似の組織セットを指す。

ディスカッション

上記のプロトコルは、新しいイメージャのアセンブリとマイクロ秒FLIM/PLIMモードでの動作の詳細な説明を提供します。TCSPCベースの新世代Tpx3Camカメラは、イメージインテンシファイア、発光フィルター、マクロレンズを備えたオプトメカニカルアダプターCricketによって組み合わされ、操作が容易な安定したコンパクトで柔軟な光学モジュールを生成します。イメージャーは、燐光発光材料の特性評価および生きた組織O₂ イメージングを含む、さまざまなサンプルおよび分析タスクで良好に機能することが示された。近赤外Pt(II)-ベンゾポルフィリンベースの細胞透過性可溶性プローブNanO2-IRと赤色発光Pt(II)-ポルフィリンベースの固体センサーをイメージング実験に使用しました。これらのセンサは、その大きなストークスシフト、長い発光寿命、高感度、高速応答、および良好な光化学的安定性により、O₂ の消光リン光検出に首尾よく使用されている。

これらの異なる_O2感受性プローブおよび固体コーティングを、マクロイメージャ上で試験した場...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
627nm LED	Parts Express		センサーの励起波長に応じて、異なるLEDに交換することができます。Pt-ポルフィリン色素に390nmのLEDを使用。
760 ± 50 nm 蛍光フィルター	エドモンド・オプティクス	84-788	センサーの発光波長に応じて、異なるフィルターに交換することができます。使用済み 650 ±Pt-ポルフィリン色素用の50 nmバンドパスフィルター。
Balb/c マウス	Envigo, UK	Balb/c
ブラックボックス	Thorlabs	XE25C9/M
Cricket Adapter	Photonis	Cricket-2
CT26 cells	ATCC	CT26です。WT	https://www.atcc.org/products/crl-2638
DMEM	Sigma-Aldrich	D0697	他のメディアも使用できます
ImageJ Software	ImageJ		Free 画像解析ソフトウェア。からダウンロードすることができます:
https://imagej.nih.gov/ij/index.html MCP-125 イメージインテンシファイア P47 蛍光体スクリーン	Photonis	PP0360EF
Mini ディッシュ	Sarstedt	83.3900.300	35 mm diameter
マイラープラスチックフィルム、75ミクロン	RSアイルランド	785-0795	Otheプラスチック基板も使用することができます
NanO2-IR	自家製	n / a	プローブは、公開された方法「Tsytsarev V、Arakawa H、Borisov S、Pumbo E、Erzurumlu RS、Papkovsky DB」に従って合成できます。燐光性酸素感受性プローブを用いた脳代謝活性のin vivoイメージング。J Neurosciメソッド。2013年6月15日;216(2):146-51.土井:10.1016 / j.jneumeth.2013.04.005。Epub 2013 4月25日。PMID:23624034;PMCID:PMC3719178.」または当研究室から提供。
NMV-50M11インチ 50mmレンズ	Navitar		Cマウントアデーターと互換性のある他のレンズは使用できます
光学ブレッドボード	Thorlabs	MB1836
シャーレ	Sarstedt	82.1472.001	92 mm径
電源	Tenma	72-10495
パルス発生器	Tenma	TGP110
Sophy	アムステルダム科学機器	n/z	ASIがTpx3Cam
Tpx3Cam	アムステルダム科学機器	TPXCAM
Tri2ソフトウェア	オックスフォード大学	n/a	フリータイム解決イメージングソフトウェアと一緒に提供し、以下からダウンロードできます: https://users.ox.ac.uk/~atdgroup/index.shtml
XYZ翻訳ステージ	Thorlabs	LT3