方法論記事

アレルギー性接触皮膚炎のマウスモデルとしての接触過敏症

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DOI：

10.3791/64329

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2022年9月26日

 ,  ,  , 
1Department of Clinical Immunology, Wroclaw Medical University, 2Department of Medical Physiology, Chair of Biomedical Sciences, Institute of Physiotherapy, Faculty of Health Sciences, Jagiellonian University Medical College, 3Chair of Biomedical Sciences, Faculty of Health Sciences, Jagiellonian University Medical College

この記事について

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サマリー

接触過敏症(CHS)は、アレルギー性接触皮膚炎(ACD)のマウス実験モデルである。CHSは、胸部および腹部の剃毛された皮膚を塗ることによって反応性ハプテンによる感作に基づいており、その後の耳の皮膚の課題を希釈ハプテンで、様々な方法で評価される腫脹反応を引き起こす。

要約

接触過敏症(CHS)は、マウスで研究することができるアレルギー性接触皮膚炎(ACD)の実験モデルである。この研究は、様々な試験によって測定および定量化することができるマウスにおけるCHS反応を研究するのに役立つかもしれない客観的な実験室法を提示することを目的としている。CHSを誘導するために、「0」日目に、マウスをアセトン - エタノール混合物中のハプテン2,4,6−トリニトロクロロベンゼン(TNCB)による腹部皮膚塗装によって予め剃毛したスポット上で感作し、一方、陰性対照マウスは、ビヒクル単独 - アセトン - エタノール混合物で偽感作した。「4」日目に、試験群および対照群の両方で希釈TNCBで両耳を塗ることによってCHSの惹起(チャレンジ)の前にベースライン耳厚をマイクロメーターで測定した。24時間後、耳の腫れをマイクロメーターで測定した。CHSは、炎症を起こした組織に腫脹を引き起こすT細胞媒介性免疫応答の一例であり、同じハプテンによる皮膚チャレンジの24時間後にピークに達する。耳水腫の増加は、耳の体重の増加、ミエロペルオキシダーゼ(MPO)活性、耳抽出物中の前炎症性サイトカイン濃度、組織学的検査における浮腫性真皮の肥厚の増加、および耳の血管透過性と相関した。対照マウスと比較した場合、試験群の血清中のTNP特異的IgG1抗体の濃度も増加した。さらに、CHSは、以前にTNCBで感作されたドナーから得られたCHSエフェクター細胞を用いて首尾よく転写することができる。CHSエフェクター細胞をナイーブレシピエントマウスに静脈内投与し、その後、同じ希釈ハプテンでチャレンジした。耳の腫れは、24時間後にマイクロメーターで測定した。

概要

アレルギー性接触皮膚炎(ACD)は、ハプテンと呼ばれる低分子量化学物質への曝露に起因するIV型過敏反応によって引き起こされる先進国における一般的な皮膚炎症性疾患である。ヒトにおける接触感作を引き起こす物質には、重金属イオン(クロム、ニッケル、鉄、コバルト)、テルペンチン、化粧品中に存在する香料、染料、および防腐剤(例えば、パラフェニレンジアミン)、いくつかの薬物(例えば、ネオマイシン、ベンゾカイン)、βラクタム系抗生物質(すなわち、ペニシリン)、植物によって産生される化学物質(ペンタデカカテコール、ポイズンツタに存在する物質)、ならびに写真産業で使用されるヒドロキノンが含まれる1,2.ACD病因薬は、産業だけで100,000以上の化学物質が使用され、毎年2,000の新しい化学物質が合成されているため、非常に高いです。現在までに、ハプテン/アレルゲンに接触している可能性のある3,700以上の分子が同定されています3。接触過敏反応(CHS)は、マウス、モルモット、ラットで研究することができ、有機溶媒に溶解した反応性化学ハプテンの局所皮膚適用によって誘発され得るACDの実験モデルである4,5,6。この研究は、様々な試験によって測定および定量化することができるマウスにおけるCHS反応を研究するのに役立つかもしれない客観的な実験室法を記述することを目的としている。

CHSは感作(誘導)相とエフェクター(チャレンジ)相からなる。動物モデルでは、ハプテンはまず体内のタンパク質に共有結合してネオ抗原を作り出します。感作期の間、活性化ケラチノサイトは、炎症誘発性サイトカイン腫瘍壊死因子α(TNF-α)およびインターロイキン1β(IL-1β)7を産生することにより、皮膚樹状細胞(sDC)の遊走および成熟を促進する7。表皮ランゲルハンス細胞(LC)は、CHS誘導およびエフェクター相8の間に抗原を提示する。感作中にハプテンに曝露されたLCは、調節細胞およびエフェクター細胞の両方の誘導を促進する9。いくつかの研究からの証拠の増加は、CHS応答が、CD4+ MHCクラスII制限性Th1細胞、特徴的な炎症性浸潤物を採用するためにインターフェロンγ(IFN-γ)を局所的に放出すること、IFN-γも放出することができるが、ほとんどがケラチノサイトへの細胞傷害性損傷を媒介するCD8+ MHCクラスI制限性Tc1リンパ球、および現在インターロイキン17(IL-17)産生Th17細胞10によって媒介され得ることを示唆している。11.

様々な種1 2、13、14およびハプテンを用いたいくつかの異なるCHSモデルが開発されている(異なるハプテン、溶媒、および適用時間の詳細な比較は表1に要約されている)。頻繁に使用される実験種であるマウスは、CHSの研究においていくつかの利点を提供する。マウスには他の種に比べて系統、ノックアウト(KO)、トランスジェニック動物が多く、非常に魅力的な動物となっています15。さらに、CHSモデルには多くの動物が必要であり、マウスはここでより経済的です。動物モデルは、すべての面でACDを模倣するわけではない。特に、彼らは人間には一般的ではない痂皮と落屑を示しています16,17。慢性疾患の特徴は、主に記載されたモデルが長期間にわたってハプテンの適用を想定していないため、再現が困難である。しかし、ACDの重要な側面の多くが再現されていることがここで確認されています。また、ヒトと同様に、これらの特徴は局所アレルギー反応と関連していることも示されている。このプロトコルで概説されているハプテン、その溶媒、およびその用途の選択は、結果が多数のインビトロ試験によって確認されており、現在のバージョンが確立されるまで長年にわたって実験室で試験および修正されたという事実によって決定された。マウスモデルは、ACDの発症に関与し、新しい治療法の前臨床評価に不可欠な細胞サブセットまたはサイトカインの分析を可能にする。

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プロトコル

この記事で紹介したすべての実験は、クラクフの第1回動物実験に関する地方倫理委員会のガイドラインに従って実施されました。記載されているすべての手順は、特にケタミン/キシラジンを麻酔薬として使用すること、耳の両側を使用して物質/ハプテンを塗布すること、耳を切り落とすこと、および眼球除去による血液の採取に関して、地元の勧告に従って実施された。本研究には、生後6~12週のBALB/c(ハプロタイプH-2d)、CBA/J(H-2k)、およびC57BL/6(H-2b)雄および雌マウスが用いられた( 資料表参照)。統計的有意性のためには、マウスの各群が10〜12匹の動物からなる場合が最善である。

1. 動物用製剤

  1. すべての手順の前後に70%エタノール溶液で手術台を清掃してください。無菌条件を必要とするマウスを使用する場合は、すべての操作をバイオセーフティキャビネットで実行してください。

2. 識別のためのマーキングマウス

  1. #0 - マークなし、#2 - 右前足、#3 - 右前足、#4 - 右後足、#5 - 尾の付け根、#6 - 左後足、#7 - 左側、#8 - 左前足。
    注:誘導された反応のために、マウスは耳打ちまたはタグ付けによって古典的にマークすることができない。マウスを標識しながら麻酔をかけなかった。

3. CHSの誘導

メモ: この手順を 図 1 に示します。

  1. 以下の手順に従って感作(誘導)を行います。
    1. 「0」日目に、灰色の石鹸を水で塗り、カミソリの刃で剃ることによって、胸部と腹部(正方形2cm x 2cm)のマウスを剃る。
      注:ハプテンを塗布する前に、皮膚が刺激されないように6時間待ってください。
    2. 5%ハプテン:2,4,6-トリニトロクロロベンゼン(TNCB、 材料表を参照)をアセトン-エタノール混合物(比率1:3)またはビヒクル単独(アセトン-エタノール)で調製する。ガラスバイアルで使用する直前に溶液を調製し、バイアルをアルミニウム箔で覆って光から保護します。
    3. 同じ日に、以前に剃毛したスポットに5%ハプテンの150μLを塗布することによってマウスを感作させる。対照マウスの群において、非特異的炎症反応を評価するためにビヒクルを単独で適用する。動物をケージに戻す前に、30秒待ってハプテンを乾燥させます。
      警告: 手袋を使用してください。TNCBは、ほとんどの人に重度のアレルギー反応を引き起こす。
  2. 惹起(チャレンジ)と耳の腫れ測定を行います。
    1. 「4」日目に、アセトン - エタノール混合物(比1:1)中の0.4%ハプテン:TNCBを調製する。ガラスバイアルで使用する直前に溶液を調製し、バイアルをアルミニウム箔で覆って光から保護します。
    2. 深い麻酔のために、ケタミン(90〜120mg / kg)およびキシラジン(5〜10mg / kg)の混合物の腹腔内(すなわち)注射( 材料表を参照)でマウスを麻酔する。マウスがつま先のつまみで少なくとも5分間完全に麻酔をかけていることを確認します。
    3. 実験群を知らない観察者によってマイクロメーター( 材料表を参照)で耳の厚さ(0時間測定、ベースライン)を測定します。
    4. 両群の耳の両側に0.4%ハプテンを10μL塗布する(試験および対照)。動物をケージに戻す前に、30秒待ってからハプテンを乾燥させます。
    5. ハプテン塗布後24時間の「5」日目に、24時間の測定のためにステップ3.2.2-3.2.3を繰り返します。
    6. ハプテンによるチャレンジの前後の耳介の厚さの差を計算することによってCHS応答を評価する:24時間の耳の厚さ(μm)-0時間の耳の厚さ(μm)。各耳を別々の測定値として数えます。次に、耳の腫れをマイクロメートル(μm)±平均の標準誤差(SEM)で表した(表2、 図3)。

4. 耳生検

  1. 耳の厚さを24時間測定した直後(マウスがまだ深い麻酔下にある場合)に、はさみで頭蓋骨の近くにできるだけ耳を切り落とします。生検パンチを用いて直径6mmのパンチを作って、耳の遠位側から生検を採取する( 材料表参照)。
    1. 耳の重量を測定し(ステップ4.2)、さらに同じ耳生検で以下の試験のいずれかを実行します:ミエロペルオキシダーゼ(MPO)アッセイ(ステップ4.3)または耳抽出物中のサイトカイン濃度の インビトロ 測定(例えば、IFN-γ、IL-17A、TNF-α[ステップ4.4])。
      注:採血前に耳を切ってください。この手順の後、マウスを安楽死させなければならない(例えば、子宮頸部脱臼によって)。
  2. 分析天秤で各耳生検の重量を測定し、ミリグラム(mg)で表します(図4)。
  3. 以下のステップに従ってMPOアッセイを行う。
    1. 0.5%ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミドを50mmolのリン酸緩衝液KH2PO4/Na2HPO4に溶解し、pHを6.0に調整して均質化緩衝液を調製する(室温、RTで使用)。
    2. 直径5mmのステンレス製ビーズ(ビーズ/バイアルを2個追加)を備えたホモジナイザーを使用して、500 μLの調製バッファーを含む2 mLの微量遠心チューブで生検を10分間ホモジナイズします( 材料表を参照)。次に、サンプルを4°Cで15分間冷却し、さらに10分間均質化する。
      注:マイクロ遠心チューブは、ビーズが簡単に移動できるように丸い底部を備えています。
    3. ホモジネートを−20°Cで30分間凍結する。解凍と渦(サンプルが解凍されていることを確認してください)。この手順を 3 倍繰り返します。
    4. ホモジネートを3,000 x g で4°Cで30分間遠心分離する。 ピペットで上清を収穫する。MPO活性をタンパク質1mg当たりの単位(U)で表す。
      メモ: プロトコルはここで一時停止できます。サンプルは-20°Cで3ヶ月間安定しています。
    5. MPO活性を測定するには、上清20 μLとMPO基質200 μL(50 mmolのKH 2 PO 4/Na2HPO4バッファーに0.167 mg/mLのオルトジアニシン二塩酸塩を5 x 10-4%H20 2)を混合して酵素反応を行い、96ウェル平底プレートに添加します。プレートをRTで20分間インキュベートする。
    6. 200 μLのMPO基質中の0.008 Uから0.5 Uまでの濃度で20 μLのMPO標準物質を用いて標準曲線を作製する。MPO基板のみでブランクサンプルを作製する。
      警告: オルトジアニシン二塩酸塩を使用する際には、マスクを使用してください。
      注:プレートはポリプロピレン製でなければならず、タンパク質やDNAが結合しないように結合能力が低い。
    7. λ=460nmの波長における光学密度(OD)を測定する。酵素反応は10分間安定である。検量線から試験サンプル中のMPO活性を読み取ります。
    8. タンパク質濃度を測定するには、20 μLの上清を使用し、タンパク質測定用ビシンコニン酸キット( 材料表参照)で試験を行い、λ = 562 nmでODを測定します(図5)。
  4. 耳エキス中のサイトカインの インビトロ 測定を行う。
    1. 直径5 mmのステンレス製ビーズ(ビーズ/バイアルを2個追加)を備えたホモジナイザーを使用して、500 μLの組織タンパク質抽出試薬(T-PER)を含む2 mLの微量遠心チューブでRTで耳生検を10分間ホモジナイズします。次に、サンプルを4°Cで15分間冷却し、さらに10分間均質化する。
      注:マイクロ遠心チューブは、ビーズが簡単に移動できるように丸い底部を備えています。
    2. ホモジネートを3,000 x g で4°Cで30分間遠心分離する。
      メモ: プロトコルはここで一時停止できます。サンプルは−80°Cで6ヶ月間安定しています。
    3. 市販のELISAセット(例えば、IFN-γ)を用いてサイトカインレベルを評価し( 材料表を参照)、製造業者の指示に従って(図6)。

5. 耳組織の組織学

  1. 耳の厚さを24時間測定した直後に、マウスがまだ深く麻酔をかけられたら、はさみでできるだけ頭蓋骨の近くで耳を切り落とします(ステップ4.1)。
    注:この手順の後、マウスを安楽死させる必要があります(例えば、子宮頸部脱臼によって)。
  2. 以下の手順に従って組織ブロックのパラフィン包埋を行う。
    1. 除去直後に、耳を〜10mLの10%ホルマリンに入れ、24時間置く。
    2. 耳を組織処理カセットに入れます。脱水サイクル(RTでそれぞれ70%、90%、100%、30分)、クリアリングサイクル(キシレン3倍、RTで各30分)、およびワックス浸潤サイクル(パラフィン3倍、56°Cでそれぞれ30分)のために、カセットを自動プロセッサ( 材料表を参照)に入れます。
    3. 自動プロセッサーからカセットを取り外し、必要に応じて加温プレートをつかみます。ワックス型に暖かいワックス(ディスペンサーから)を充填します。
    4. 温めた鉗子でカセットからセクションを取り出し、金型に入れます。次に、カセットベースを金型の上部に置き、さらにワックスで塗ります。パラフィンが固化して試験片を含むブロックを形成するように、コールドプレート上の冷水に30分間置く。
    5. 回転ミクロトーム( 材料表を参照)を使用して、厚さ約5μmの切片を切断します。セクションを温かいお風呂に浮かべて平らにします。ガラス顕微鏡スライドに切片を拾います。RTで乾燥させて、セクションがスライドに付着していることを確認します。
      メモ:染色中の組織切片の損失を防ぐために、接着材料やタンパク質コーティングを塗布する必要がなくなるスライドを使用してください。
  3. ヘマトキシリンおよびエオジン(H&E)染色を行う。
    1. キシレン(4皿)、100%エタノール(無水アルコール)(4皿)、90%エタノール、80%エタノール、70%エタノール、50%エタノール、PBS(3皿)、ヘマトキシリン溶液、エオジン溶液で17の染色皿を準備する。以下の手順に従ってスライドを1つの皿から次の皿に移し、RTですべてを実行します。
      注:各皿の手順は約10倍繰り返すことができます(例えば、20スライドの皿を使用する場合、液体を変えずに200枚の汚れを作ることができます)。
    2. インキュベーター内で65°Cで30分間インキュベートすることにより切片を脱パラフィン化する。スライドをキシレンに30分間浸します。新しいキシレン中で1倍を30分間繰り返します。
    3. スライドを100%エタノールに5分間浸漬する。新しい100%エタノール中で1倍を5分間繰り返します。スライドをエタノール列に、90%、80%、70%、および50%、各希釈液に2分間浸漬する。
    4. スライドをリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に5分間浸漬する。ティッシュの周りやスライドの裏側から余分な液体を拭き取ります。
    5. 切片をヘマトキシリン溶液( 材料表を参照)で7〜8分間染色する。断面を傷つけないように、裏側から流水で30秒間洗ってください。手順 5.3.4 を繰り返します。
    6. エオジン溶液( 材料表を参照)でセクションを30秒間染色します。手順 5.3.5 で説明したように洗浄してから、手順 5.3.4 を繰り返します。
    7. スライドを100%エタノール(無水アルコール)に2分間浸漬する。新しい100%エタノール中で1倍を2分間繰り返します。
    8. スライドをキシレンに5分間浸します。新しいキシレンで1xを5分間繰り返します。
    9. RT でセクションを 15 分間空気乾燥させます。カバースリップに取り付け用媒体 ( 材料表を参照) を 1 滴加え、セクションの上部に置きます。
  4. 倍率20倍または40倍の光学顕微鏡で断面を調べ、画像を撮影します(図7)。

6. 血管透過性試験

注:耳の厚さ測定と交互に、血管透過性試験を行うことができます。

  1. 「0」日目にマウスを感作し(ステップ3.1.1-3.1.3)、次いで「4」日目にマウスを麻酔し(ステップ3.2.2)、耳に直接ハプテンを塗布し(ステップ3.2.4)、0時間の耳測定を省略する。
  2. チャレンジ後23時間で、マウスを麻酔する(ステップ3.2.2)。
  3. 静脈内(すなわち)8.3 μL/g体重の1%エバンスブルー染料( 材料表を参照)をダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)に注入する。
  4. エバンスブルー注射後、マウスを再び深い麻酔(ステップ3.2.2)-1時間後に麻酔する。
  5. 耳生検を採取する(ステップ4.1)。
    注:この手順の後、マウスを安楽死させる必要があります(例えば、子宮頸部脱臼によって)。
  6. 組織から色素を抽出し、1mLのホルムアミドを含むチューブにイヤーパンチを入れ、5%CO2 の雰囲気中で37°Cで18時間インキュベートする。
  7. 生検を 3,000 x g で RT で 3 分間遠心分離します。上清をピペットで回収します。
  8. ホルムアミドを含むブランクに対して96ウェル平底プレートでλ=565nmの波長でODを測定する。色は24時間安定しています。標準曲線から試験サンプルの濃度を読み取ります(0.2~30 μgの色素/mLホルムアミドの範囲のエバンスブルーの濃度を使用)(図8)。
    注:プレートはポリプロピレン製でなければならず、タンパク質やDNAが結合しないように結合能力が低い。

血清採取および抗TNP免疫グロブリン(IgG1)抗体測定

  1. 耳生検を採取した後(ステップ4.1)、マウスがまだ深い麻酔下にあるときは、ピンセットで眼球を取り出し、マウスに穏やかな圧力をかけ、眼窩後洞からチューブに血液を採取する(血清を得るためのゲル付きバイアル、 材料表を参照)。血液を採取する別の方法は、注射器で心臓を穿刺し、血液を収集することである。
    注:耳を取り外した後、血液を採取する必要があります。血液パラメータの潜在的な違いのために、同じ出血方法が研究全体にわたって使用されなければならない18。この手順の後、マウスを安楽死させなければならない(例えば、子宮頸部脱臼によって)。
  2. 最低6倍に反転させ、血液が凝固するまで30分待ってから、RTで1,300-2,000 x g で10分間遠心分離します。
    メモ: プロトコルはここで一時停止できます。サンプルは−20°Cで6ヶ月間安定です。
  3. 96ウェル平底プレートを、10 μg/mLの協奏でDPBSに溶解した2,4,6-トリニトロフェニル(TNP-BSA)と結合させた50 μLのウシ血清アルブミンでコーティングします。次に、DPBS(バックグラウンド)に溶解したウシ血清アルブミン(BSA)のみを10μg/mLの濃度で2枚目のプレートをコーティングします。4°Cで一晩インキュベートする。
    注:マウス血清にはBSAに対する抗体(Abs)が含まれているため、サンプルを両方のプレートでテストする必要があり、次に計算を行う必要があります(OD TNP-BSA - OD BSA)。
  4. プレートを0.05%Tween 20を含む300μLのDPBSで洗浄します。3 倍繰り返します。
  5. アッセイ希釈剤(AD)を調製する:1%BSAを含むDPBS。RT で 1 時間 AD でウェルをブロックし、もう一度洗浄します (ステップ 7.4)。
  6. 内部標準物質(iSTD)を調製する:マウスをTNCBで感作し(ステップ3.1.1-3.1.3)、感作後10日目にすべてのドナーから血清を収集してポーリングする(ステップ7.1およびステップ7.2)。
  7. 標準曲線を作製するためにADで希釈した段階的な濃度のiSTDの50μLをプレートに加える( 表3に記載)。50 μLの血清サンプルをプレートに加える。両方のプレート(TNP−BSAおよびBSAコーティング)で各サンプルおよび標準曲線を試験する。RTで2時間インキュベートし、プレートを洗浄します(ステップ7.4)。
  8. ADで1:250に希釈したビオチン化抗マウスIgG1モノクローナル抗体(mAb、 材料表を参照)を50μL加え、RTで1時間インキュベートする(ステップ7.4)。
  9. ADで1:2000に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼストレプトアビジン(HRDストレプトアビジン、 材料表参照)50μLを加え、暗所でRTで30分間インキュベートする。プレートを洗う(ステップ7.4)。
  10. 50 μLのTMB基質( 材料表を参照)を加え、暗所でRTで30分間インキュベートします。
  11. 25 μLの1 MH2SO4を添加することによって酵素反応を停止させる;反応は30分間安定である。
  12. 波長λ = 450 nm、バックグラウンド570 nmでODを測定します(バックグラウンドは450 nmの測定ごとに差し引く必要があります)。結果を提示するときは、サンプルおよび標準曲線のTNP-BSAからBSA測定値を差し引く。そして、標準曲線に従って抗体の単位(U)を算出する(図9)。

8. CHSエフェクター細胞の養子移入

メモ: この手順を 図 2 に示します。

  1. ドナー(1人のドナー:1レシピエントの比率で):「0」日目にTNCBでマウスを感作する(ステップ3.1.1-3.1.3)。
  2. 「4」日目に、マウスの深い麻酔を麻酔する(ステップ3.2.2)。
  3. 腋窩および鼠径リンパ節(ALN)および脾臓(SPL)を鉗子で単離する。1 つのバイアルの ALN と別のバイアルの SPL を一緒にプールします。
    注:各腋窩の胸筋の後ろに1つの腋窩リンパ節があります。股関節領域の1つの鼠径リンパ節は、3つの血管の隣に位置している。脾臓は、腸と胃の後ろの体の左側に位置しています19.バイオセーフティキャビネット内の滅菌ツールを使用して、滅菌状態を維持します。この手順の後、マウスを安楽死させなければならない(例えば、子宮頸部脱臼によって)。
  4. 2つの顕微鏡スライドのつや消し端の間のマッシュ組織。細胞懸濁液を孔径70μmのセルストレーナーに通します( 材料表を参照)。
  5. 1%ウシ胎児血清(FBS)を添加したDPBSで細胞を洗浄する。遠心分離機を300 x g で4°Cで10分間遠心分離する。 上清をデカントし、残りの細胞ペレットを1〜5.0mLのDPBSに再懸濁する。
  6. 血球計数器20 を用いて生細胞をトリパンブルーで計数し、10 μLの細胞懸濁液を90〜990 μL(細胞数に応じて)のトリパンブルーと混合する。細胞数を計算する際には希釈率を考慮に入れてください(10x-100x)。
  7. ALNとSPLの混合物(比1:1):200μLのDPBS中で8.0 x106 〜7.0 x 107 /マウスを調製する。
  8. レシピエント(ナイーブ同系マウス):ナイーブレシピエントマウスを麻酔し(ステップ3.2.2)、CHSエフェクター細胞の調製混合物をi.v.に注射する(ステップ8.7)。対照群のマウスでは、細胞を注入しないでください。
  9. チャレンジの前(0時間)と後(24時間)に耳の厚さを測定します(ステップ3.2.1-3.2.6)(図10)。
  10. さらに、単離されたCHSエフェクター細胞について試験を実施する(例えば、細胞表現型決定またはフローサイトメトリーによるCHSエフェクター細胞による産生サイトカインの測定)。細胞培養物も確立することができ、抗原の存在下で増殖するCHSエフェクター細胞の能力、または培養上清中に分泌されたサイトカインの量を21、22 (データは提示されていない)評価することができる。
    注:追加のテストを実行するには、それに応じてより多くの細胞ドナーが必要です。

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結果

CHS誘導のために、動物を、150μLの5%TNCBまたは偽物を用いて、ビヒクル単独で感作した皮膚塗装(腹部) を介して 感作した。「4」日目に、TNCBで以前に接触感作したマウス(試験群)および対照群マウス(偽感作)の両マウスにおいて、0.4%TNCBの10 μLによる接触塗装(チャレンジ)により両耳の耳膨潤応答を誘導した。提示されたデータは、TNCBで感作し、4日後にチャレンジしたマウスが、同様にチャレンジされた偽感作マウスと比較して有意に増加した耳の腫れを発症したことを示している(図3、 表2、試験対対照群)。耳の腫れの結果は、さらなる研究において完全に検証され、マイクロメーターで決定された耳水腫の増加が、増加した耳の重量(図4)、MPO活性(図5)、耳抽出物中のIFN-γ濃度(図6)、組織学的検査における浮腫性真皮の肥厚の増加(

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ディスカッション

CHSは、皮膚中の自己タンパク質抗原に結合し、ネオ抗原を生成するハプテン を介して 誘導される。CHSは、循環抗原特異的CHSエフェクターT細胞の局所的な血管外動員によって媒介され、これは、チャレンジ組織において腫脹をもたらし、二次皮膚を同じハプテンに曝露してから24時間後にピークに達する6。組織の腫脹は、主に、白血球および白血球依存性フィブリン沈着24の浸潤によって引き起こされる。これらの変化は、ハプテン感作およびチャレンジドマウスと偽感作およびチャレンジドマウスの耳の腫れを測定するマイクロメーターで検出することができる。

CHSはまた、耳の重さの比較によって決定することができる。次いで、耳重量決定のために利用される耳パンチを、さらなる試験に使用することができる。炎症を起こした耳に浸潤する細胞は、サイトカイン産生Tリンパ球およびMPO陽性好中球からなる。耳組織ホモジネートにおいて、MPO活性または炎症誘発性サイトカイン(例えば、TNF−α、IFN−γ、IL−17A、ま...

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開示事項

著者らには開示するものは何もありません。

謝辞

この研究は、subvention SUBZによって支持された。ヴロツワフの医科大学のA020.22.060, ポーランド, 科学高等教育省からの助成金によって N N401 545940 MSとIP2012 0443 72 MMSに.

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
70% エタノールMerck KGaA, Darmstadt, Germany65350-M表面消毒用
96ウェル平底プレート、ポリプロピレンGreiner Bio-One GmbH, Kremsmunster, Austria655101for MPO and Evans blue measurement - プレートはポリプロピレン製で、結合能力が低いため、タンパク質やDNAが
アセトン(ACS試薬、≥99.5%)Merck KGaA, Darmstadt, Germany179124
アルミ箔Merck KGaA, Darmstadt, GermanyZ185140
Analytical balanceSartorius Weighing Technology GmbH, Goettingen, GermanyPRACTUM224-1s, 29105177
Automated tissue processorMediMeas Instruments, Sarsehri, Haryana, IndiaMTP-E-212パラフィン
BD Vacutainer SST II Advance(血清を得るためのゲル付きチューブ)Becton Dickinson (BD)、Franklin Lakes、NJ、USABD
タンパク質測定用ビシンコニン酸キットMerck KGaA、ダルムシュタット、ドイツBCA1-1KT
ビオチンラット抗マウスIgG1Becton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, USA553441
BSA (ウシ血清アルブミン)Merck KGaA, Darmstadt, GermanyA9418protein assays & analysis, 2 mg/mL
Cell strainer, pore size 70 μmBIOLOGIX, 中国15-107050 mLチューブに適しています
CoverslipVWR, Radnor, Pennsylvania, United States631-158324 mm, しかし、異なるサイズを使用することが可能
使い捨てピペット容量: 5 mL, 10 mL, 25 mLMerck KGaA, Darmstadt, GermanyZ740301, Z740302, Z740303
DPBS (Dulbecco′リン酸緩衝生理食塩水)ThermoFisher Scientific, ウォルサム、マサチューセッツ州、米国14190144カルシウムなし、マグネシウムなし、哺乳類細胞培養
組織学のためのDPXマウンタントメルクKGaA、ダルムシュタット、ドイツH-Eのための6522マウンティングメディアは、他のいくつかの例えば、カナダのバルサム
デュモン5ピンセット - ストレートAnimalab、ポズナン、ポーランド11251-10FSTマウスの手順のための手術器具(滅菌する必要があります)
デュモン7ピンセット - 曲がったAnimalab、ポズナン、ポーランド11272-50FSTマウスの処置用手術器具 (滅菌する必要があります)
Eosin Y 溶液、アルコール性Merck KGaA、ダルムシュタット、ドイツHT110116
Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mLEppenforf、ドイツ3,01,20,086ポリプロピレン
Eppendorf Safe-Lock Tubes、2.0 mLEppenforf、ドイツ3,01,20,094ポリプロピレン、丸底(均質化ビーズは簡単に移動できます)
エタノール100%(絶対アルコール)Merck KGaA、ダルムシュタット、ドイツ1.07017
エタノール96%Merck KGaA、ダルムシュタット、ドイツ1.59010
Evans blueMerck KGaA、ダルムシュタット、ドイツE2129
FBS(ウシ胎児血清)ThermoFisher Scientific、ウォルサム、マサチューセッツ
ホルマリン溶液、中性緩衝液、10%Merck KGaA、ダルムシュタット、ドイツHT501128
ホルムアミド 99.5% (GC)Merck KGaA、ダルムシュタット、ドイツF7503
冷凍庫 -20 °Cボッシュ、ドイツGSN54AW30
冷蔵庫 +4 >C /冷凍庫-20°;CBosch, GermanyKGV36V10mammalian Cell Culture, qualified, Brazil, 10 x 50 mL
Glass microskope slides, SuperFrost PlusVWR, Radnor, Pennsylvania, United States631-0108, 631-0446, 631-0447, 631-0448, 631-0449接着材料やタンパク質コーティングを施す必要をなくし、染色中の組織切片の損失を防ぐスライドです。
グラフパッド プリズムグラフパッドソフトウェア株式会社v. 9.4.0
灰色の石鹸Pollena Ostrzeszów、Producent Chemii Gospodarczej Sp. Z.o.o.、Sp. K.、ポーランドBialyジェレンソープバーグレーソープバーナチュラル低アレルギー性。一般入手可能な製品
H2SO4 (硫酸) 1 mol/l (1 M)Merck KGaA, Darmstadt, Germany1.60313
Harris hematoxylin solutionMerck KGaA, Darmstadt, GermanyHHS16
HemocytometerVWR, Avantor, U.S.A612-5719手動計数室をお勧めします
。臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウムMerck KGaA, Darmstadt,Germany H5882
ホモジナイザーQIAGEN Hilden, GermanyTissue Lyser LT, SN 23.1001/05234ホモジナイザー ステンレス鋼ビーズ (直径 5 mm) 2 mL 遠心分離管用
西洋わさびペルオキシダーゼ ストレプトアビジン (HRP ストレプトアビジン)Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, USASA-5004-1
過酸化水素溶液 (H202)Merck KGaA, Darmstadt, GermanyH1009
Incubator Heracell 150iThermo Electron LED Gmbh, Germany4107106837 oC 5% CO2, 65 0C 組織学用切片
タミン 100 mg/mL, 注射用溶液Biowet Pulawy Sp. z o.o., Pulawy, Polandcat.# 利用不可
KH2PO4 (リン酸二水素カリウム) 99.995% 無水ベースMerck KGaA, ダルムシュタット, ドイツ1.05108
実験室用遠心分離機Heraeus Megafuge 1.0R, Thermo Scientific, ドイツB00013899速度 300 x g, 冷却 4 0C
実験室用遠心分離機ヘレウスフレスコ21、サーモサイエンティフィック、ドイツ750024253,000 x gまで、4 0C
マスク(FFP2)VWR、ラドナー、ペンシルベニア州、米国111-0917トジアニシン二塩酸塩マウスと協力するための生物
医学科学部、健康科学部、ヤギェウォ大学医科大学の育種ユニット、 クラクフ、ポーランドCBA/J、C57BL/6
マイクロメータ三ツ豊市、東京、日本193-111桁 外マイクロメータ、ラチェットストップ、0-25mm 範囲、0.001mm 目盛り、+/-0.002mm 精度、https://shop.mitutoyo.pl/web/mitutoyo/pl_PL/all/all/Mikrometr%20analogowy%20/PR/193-111/index.xhtml  
マイクロプレート、96ウェル、マイクロロン、高結合(ELISA試験用)Greiner Bio-One GmbH、クレムスミュンスター、オーストリア655061、maxi-sorp結合面により、比色アッセイで信頼性と再現性のある結果が得られます
顕微鏡と対物レンズLeica Microsystems CMS GmbH, GermanyDM1000, 294011-082007この論文で発表された組織型は、ThermoFisher Scientific EVOS M5000 イメージングシステムの下で実施され、目的:FL 20X LWDPH、0.40NA/3.1WD および FL 40X LWDPH 0.65NA/1.79WD
ヒト白血球由来のミエロペルオキシダーゼ(MPO 標準)Merck KGaA、ダルムシュタット、ドイツM6908
Na2HPO4 x 7 H2O (リン酸ナトリウム二塩基性七水和物)Merck KGaA、 ダルムシュタット、ドイツS9390
オリーブ油メルク KGaA、ダルムシュタット、ドイツ75343純粋で自然な
OptEIA マウス IFN-γELISA SetBecton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, USA555138
Ortho-dianisine dihydrochlorideMerck KGaA, Darmstadt, GermanyD3252
Paraffin waxMerck KGaA, Darmstadt, Germany76242beads, waxy solid
PBS (phosphate buffered saline)ThermoFisher Scientific, 米国マサチューセッツ州ウォルサム20012027pH 7.2、哺乳類細胞培養
pH メーターElmetron、ポーランドCP-401
ピペット、チップ付き可変容量Merck KGaA、ダルムシュタット、ドイツEP3123000900-1EA3パック、オプション 1、0.5-10 uL/10-100 uL/100-1000 uL、epT.I.P.S.
かみそりの刃VWR、ラドナー、ペンシルベニア州、アメリカ合衆国PERS94-0462スクレーパーとカッターの刃、片刃、アルミ背骨、100枚/箱、個包装
ロータリーミクロトームMRC Laboratory-Instruments、エセックス、CM20 2HU UKHIS-202A
はさみ - ストレート、シャープ/シャープAnimalab、ポズナン、ポーランド14060-10FSTマウスの処置用手術器具(滅菌する必要があります)
スクリューキャップ(オープントップ)Merck KGaA, Darmstadt, Germany27056黒色ポリプロピレン製穴キャップ, 22 20-400糸の分光
光度計BioTek Instruments、米国201446ユニバーサルマイクロプレート分光光度計:ラムダ;範囲:200 - 999 nm、吸光度測定範囲:0.000 - 4.000 ABS
皿を染色 ラック付きスライド20Merck KGaA、ダルムシュタット、ドイツS6141例:カバー、スライドラック、ハンドル付き20枚のスライド染色皿
滅菌使い捨て生検パンチ 6mmIntegra LifeSciences、プリンストン、ニュージャージー州、米国33-36
手術用ハサミAnimalab、ポズナン、ポーランド52138-46マウスの処置用手術器具 (滅菌する必要があります)
組織処理カセットMerck KGaA、ダルムシュタット、ドイツZ672122組織処理/蓋付きカセット
埋め込み TMB Substrate Reagent Setベクトン・ディキンソン (BD Biosciences)、ニュージャージー州フランクリンレイクス、米国555214
TNCB (2,4,6-トリニトロクロロベンゼン)東京化学工業株式会社C0307
TNP-BSA (ウシ血清アルブミンと2,4,6-トリニトロフェニルを結合)Biosearch Technologies LGC, Petaluma, CA, USAT-5050
T-PER (tissue protein extration reagent)ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA78510
Tubes 15 mL sterileMerck KGaA, Darmstadt, GermanyCLS430055 (Corning)polypropylene, 円錐底
Tubes 50 mL, 滅菌済みMerck KGaA, Darmstadt, GermanyCLS430290 (Corning)polypropylene, 円錐底
Tween 20Merck KGaA, Darmstadt, GermanyP1379
Vials, screw top, clear glass (vial only) 22 mLMerck KGaA, Darmstadt, Germany27173ハプテンの調製のために、それが蒸発しないようにねじ込まれる
ウォーターバスAJL Electronic, PolandLW102
Wax (paraffin) dispenserVWR, Radnor, Pennsylvania, United States114-8737
Xylazine (xylapan 20 mg/mL) solution for injectionVetoquinol Biowet Sp. z o.o., Gorzow Wielkopolski, Polandcat.# 利用できない
キシレン (組織学的グレード)Merck KGaA, ダルムシュタット, ドイツ534056
で組織サンプルを固定、脱水、透明化、浸潤することにより、組織サンプルを自動的に調製します 366882 州、米国A3160802 ケ速度オル を含む枚

参考文献

  1. Nosbaum, A., Vocanson, M., Rozieres, A., Hennino, A., Nicolas, J. F. Allergic and irritant contact dermatitis. European Journal of Dermatology. 19 (4), 325-332 (2009).
  2. Hertl, M., et al. Predominance of epidermal CD8+ T lymphocytes in bullous cutaneous reactions caused by beta-lactam antibiotics. The Journal of Investigative Dermatology. 101 (6), 794-799 (1993).
  3. Martin, S. F. T lymphocyte-mediated immune responses to chemical haptens and metal ions: implications for allergic and autoimmune disease. International Archives of Allergy and Immunology. 134 (3), 186-198 (2004).
  4. Takeyoshi, M., Iida, K., Suzuki, K., Yamazaki, S. Skin sensitization potency of isoeugenol and its dimers evaluated by a non-radioisotopic modification of the local lymph node assay and guinea pig maximization test. Journal of Applied Toxicology. 28 (4), 530-534 (2008).
  5. Nakamura, K., Aizawa, M. Studies on the genetic control of picryl chloride contact hypersensitivity reaction in inbred rats. Transplantation Proceedings. 13 (2), 1400-1403 (1981).
  6. Asherson, G. L., Ptak, W. Contact and delayed hypersensitivity in the mouse. I. Active sensitization and passive transfer. Immunology. 15 (3), 405-416 (1968).
  7. Honda, T., Egawa, G., Grabbe, S., Kabashima, K. Update of immune events in the murine contact hypersensitivity model: toward the understanding of allergic contact dermatitis. The Journal of Investigative Dermatology. 133 (2), 303-315 (2013).
  8. Kaplan, D. H., Jenison, M. C., Saeland, S., Shlomchik, W. D., Shlomchik, M. J. Epidermal langerhans cell-deficient mice develop enhanced contact hypersensitivity. Immunity. 23 (6), 611-620 (2005).
  9. Wang, L., et al. Langerin expressing cells promote skin immune responses under defined conditions. Journal of Immunology. 180 (7), 4722-4727 (2008).
  10. Wang, B., et al. CD4+ Th1 and CD8+ type 1 cytotoxic T cells both play a crucial role in the full development of contact hypersensitivity. Journal of Immunology. 165 (12), 6783-6790 (2000).
  11. Mori, T., et al. Cutaneous hypersensitivities to hapten are controlled by IFN-gamma-upregulated keratinocyte Th1 chemokines and IFN-gamma-downregulated langerhans cell Th2 chemokines. The Journal of Investigative Dermatology. 128 (7), 1719-1727 (2008).
  12. Peszkowski, M. J., Warfvinge, G., Larsson, A. Allergic and irritant contact responses to DNFB in BN and LEW rat strains with different TH1/TH2 profiles. Acta Dermato-Venereologica. 74 (5), 371-374 (1994).
  13. Henningsen, S. J., Mickell, J., Zachariae, H. Plasma kinins in dinitrochlorobenzene contact dermatitis of guinea-pigs. Acta Allergologica. 25 (5), 327-331 (1970).
  14. Maibach, H. I., Maguire, H. C. Elicitation of delayed hypersensitivity (DNCB contact dermatitis) in markedly panleukopenic guinea pigs. The Journal of Investigative Dermatology. 41, 123-127 (1963).
  15. Martel, B. C., Lovato, P., Bäumer, W., Olivry, T. Translational animal models of atopic dermatitis for preclinical studies. The Yale Journal of Biology and Medicine. 90 (3), 389-402 (2017).
  16. Jin, H., He, R., Oyoshi, M., Geha, R. S. Animal models of atopic dermatitis. The Journal of Investigative Dermatology. 129 (1), 31-40 (2009).
  17. Li, Y. Z., Lu, X. Y., Jiang, W., Li, L. F. Anti-inflammatory effect of qingpeng ointment in atopic dermatitis-like murine model. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2013, 907016(2013).
  18. Hoggatt, J., Hoggatt, A. F., Tate, T. A., Fortman, J., Pelus, L. M. Bleeding the laboratory mouse: Not all methods are equal. Experimental Hematology. 44 (2), 132-137 (2016).
  19. Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin, J. Isolation and th17 differentiation of naïve CD4 T lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. (79), e50765(2013).
  20. Vlab, A. Hemocytometer - Counting of Cells. Amrita University. , Available from: https://www.youtube.com/watch?v=MKS0KM3lr90 (2011).
  21. Majewska-Szczepanik, M., Strzepa, A., Marcińska, K., Wen, L., Szczepanik, M. Epicutaneous immunization with TNP-Ig and Zymosan induces TCRαβ+ CD4+ contrasuppressor cells that reverse skin-induced suppression via IL-17A. International Archives of Allergy and Immunology. 164 (2), 122-136 (2014).
  22. Majewska-Szczepanik, M., Zemelka-Wiącek, M., Ptak, W., Wen, L., Szczepanik, M. Epicutaneous immunization with DNP-BSA induces CD4+ CD25+ Treg cells that inhibit Tc1-mediated CS. Immunology and Cell Biology. 90 (8), 784-795 (2012).
  23. Directive 2010/63 / EU of the European Parliament and of the Council of 22 September 2010 on the protection of animals used for scientific purposes. Official Journal of the European Union. , Available from: https://eur-lex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=OJ:L:2010:276:0033:0079:En:PDF (2010).
  24. Colvin, R. B., Dvorak, H. F. Role of the clotting system in cell-mediated hypersensitivity. II. Kinetics of fibrinogen/fibrin accumulation and vascular permeability changes in tuberculin and cutaneous basophil hypersensitivity reactions. Journal of Immunology. 114, 377-387 (1975).
  25. Szczepanik, M., et al. Regulation of contact sensitivity in non-obese diabetic (NOD) mice by innate immunity. Contact Dermatitis. 79 (4), 197-207 (2018).
  26. Askenase, P. W., Majewska-Szczepanik, M., Kerfoot, S., Szczepanik, M. Participation of iNKT cells in the early and late components of Tc1-mediated DNFB contact sensitivity: Cooperative role of γδ-T cells. Scandinavian Journal of Immunology. 73 (5), 465-477 (2011).
  27. Zemelka-Wiącek, M., Majewska-Szczepanik, M., Ptak, W., Szczepanik, M. Epicutaneous immunization with protein antigen induces antigen-non-specific suppression of CD8 T cell mediated contact sensitivity. Pharmacological Reports. 64 (6), 1485-1496 (2012).
  28. Van Loveren, H., et al. Use of micrometers and calipers to measure various components of delayed-type hypersensitivity ear swelling reactions in mice. Journal of Immunological Methods. 67 (2), 311-319 (1984).
  29. Tsuji, R. F., et al. B cell-dependent T cell responses: IgM antibodies are required to elicit contact sensitivity. The Journal of Experimental Medicine. 196 (10), 1277-1290 (2002).
  30. Campos, R. A., et al. Cutaneous immunization rapidly activates liver invariant Valpha14 NKT cells stimulating B-1 B cells to initiate T cell recruitment for elicitation of contact sensitivity. The Journal of Experimental Medicine. 198 (12), 1785-1796 (2003).
  31. Rühl-Muth, A. C., Maler, M. D., Esser, P. R., Martin, S. F. Feeding of a fat-enriched diet causes the loss of resistance to contact hypersensitivity. Contact Dermatitis. 85 (4), 398-406 (2021).
  32. Bour, H., et al. histocompatibility complex class I-restricted CD8+ T cells and class II-restricted CD4+ T cells, respectively, mediate and regulate contact sensitivity to dinitrofluorobenzene. European Journal of Immunology. 25 (11), 3006-3010 (1995).
  33. Majewska-Szczepanik, M., et al. Obesity aggravates contact hypersensitivity reaction in mice. Contact Dermatitis. 87 (1), 28-39 (2022).
  34. Katagiri, K., Arakawa, S., Kurahashi, R., Hatano, Y. Impaired contact hypersensitivity in diet-induced obese mice. Journal of Dermatological Science. 46 (2), 117-126 (2007).
  35. Bouloc, A., Cavani, A., Katz, S. I. Contact hypersensitivity in MHC class II-deficient mice depends on CD8 T lymphocytes primed by immunostimulating Langerhans cells. The Journal of Investigative Dermatology. 111 (1), 44-49 (1998).
  36. Martin, S., et al. Peptide immunization indicates that CD8+ T cells are the dominant effector cells in trinitrophenyl-specific contact hypersensitivity. The Journal of Investigative Dermatology. 115 (2), 260-266 (2000).
  37. Vennegaard, M. T., et al. Epicutaneous exposure to nickel induces nickel allergy in mice via a MyD88-dependent and interleukin-1-dependent pathway. Contact Dermatitis. 71 (4), 224-232 (2014).

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Formal Correction: Erratum: Contact Hypersensitivity as a Murine Model of Allergic Contact Dermatitis
Posted by JoVE Editors on 1/19/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Contact Hypersensitivity as a Murine Model of Allergic Contact Dermatitis. The Protocol and Representative Results sections were updated.

Step 3.2.1 of the Protocol has been updated from:

On day "4", prepare 0.4% hapten: TNCB in an acetone-ethanol mixture (ratio 1:1). Prepare the solution just before use in a glass vial and protect it from light by covering the vial with aluminum foil.

to:

On day "4", prepare 0.4% hapten: TNCB in an acetone: olive oil mixture (ratio 1:1). Prepare the solution just before use in a glass vial and protect it from light by covering the vial with aluminum foil.

Figure 1 of the Representative Results has been updated from:

Mouse ear thickness measurement experiment diagram; TNCB-induced dermatitis comparison.
Figure 1: Induction of CHS. Sensitization, challenge, and ear measurement. Abbreviations: CHS = contact hypersensitivity reaction; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzene. Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Mice sensitization process; diagram of control/test groups, TNCB application, ear thickness measurement.
Figure 1: Induction of CHS. Sensitization, challenge, and ear measurement. Abbreviations: CHS = contact hypersensitivity reaction; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzene. Please click here to view a larger version of this figure.

Figure 2 of the Representative Results has been updated from:

CHS induction in mice using TNCB, diagram showing sensitization, i.v. cell transfer, ear measurement.
Figure 2: Adoptive transfer of the CHS-effector cells. Abbreviations: ALNs =axillary and inguinal lymph nodes; CHS = contact hypersensitivity reaction; i.v. = intravenously; SPLs = spleens; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzene. Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Mouse sensitization and TNCB application diagram; CHS study setup with control and test groups.
Figure 2: Adoptive transfer of the CHS-effector cells. Abbreviations: ALNs =axillary and inguinal lymph nodes; CHS = contact hypersensitivity reaction; i.v. = intravenously; SPLs = spleens; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzene. Please click here to view a larger version of this figure.

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