アテローム硬化性プラーク線維組織の局所コラーゲン構造と機械的性質との相関を研究する方法

Summary

我々は、不均一な構造的および機械的アテローム硬化性プラーク特性を研究するためのメカノイメージングパイプラインを開発しました。このパイプラインにより、コラーゲン線維配向の局所的な優勢な角度と分散、破裂挙動、および線維性プラーク組織のひずみフィンガープリントの相関が可能になります。

Abstract

冠状動脈および頸動脈におけるアテローム硬化性プラークの破裂は、致命的な心血管イベントの主な原因である。しかし、不均一な高コラーゲンプラーク組織の破裂メカニズム、およびこれが組織の線維構造とどのように関連しているかはまだわかっていません。プラーク力学を研究するための既存のパイプラインは、組織の構造的均質性の仮定に基づいて、プラーク組織の肉眼的機械的特性のみを得ることに限定されている。しかしながら、線維性プラーク組織は構造的に不均一であり、おそらく主にコラーゲン線維構造の局所的な変動によるものである。

ここで説明するメカノイメージングパイプラインは、不均一な構造的および機械的プラーク特性を研究するために開発されました。このパイプラインでは、組織の局所コラーゲン構造は、第2高調波発生(SHG)を備えた多光子顕微鏡(MPM)を使用して特徴付けられ、組織の破壊挙動は、デジタル画像相関(DIC)分析を使用して一軸引張試験条件下で特徴付けられます。この実験パイプラインにより、コラーゲン線維配向の局所的な優勢な角度と分散、破裂挙動、および線維性プラーク組織のひずみフィンガープリントの相関が可能になります。得られた知識は、アテローム硬化性プラーク破裂イベントをよりよく理解、予測、および防止するための鍵となります。

Introduction

虚血性脳卒中は、頸動脈のアテローム硬化性プラーク破裂によって引き起こされることが多く、世界中の死亡率と罹患率の主要な原因の1つです¹。ただし、頸動脈アテローム性動脈硬化症関連の脳卒中を予防するための現在の外科的治療計画戦略には、プラーク破裂リスク評価は含まれていません²。これは主に、プラークキャップの厚さ³や脂質コアのサイズ⁴など、以前に示唆されたリスクバイオマーカーが、将来の臨床イベントに対して最適ではない予測値を有することが示されている^{ためです5,6}。プラークの破裂リスク評価を最適化し、アテローム硬化性プラークの新しいリスクマーカーを特定するには、プラークのメカニズムと破裂メカニズムをよりよく理解する必要があります。

プラーク破裂は、高線維性プラーク組織が血圧によって及ぼされる機械的負荷に耐えられず、その構造的完全性を失う局所的な機械的事象です⁷。それにもかかわらず、プラーク破裂イベントのメカニズムとその下にある微細構造との関連はよく理解されていません⁸。プラーク組織破壊の特徴を特徴付けるいくつかの実験的研究9,10,11,12,13は、組織の構造的均一性を仮定して導き出された、総機械的破断特性(すなわち、極限引張破壊ひずみおよび強度)^を報告した。しかしながら、線維性プラーク組織は構造的に不均一であり、おそらく主にコラーゲン線維構造¹⁴の局所的な変動に起因する。さらに、プラーク組織の機械的障害特性とコラーゲン構造との関連は、Johnstonらによる最近の研究でのみ調査されました。著者らは、優勢な繊維配向にインタープラークの違いを示し、主に円周方向の繊維配向を有する線維性プラークキャップサンプルについて、より高い極限応力とより低い極限ひずみを報告した¹⁵。しかし、この研究はまた、総機械的および構造的特性に限定されていました。

本研究では、線維性プラーク組織の局所的なコラーゲン構造と局所的な機械的特性に関する重要な情報を明らかにするために、メカノイメージングパイプラインを開発しました。この ex vivo パイプラインにより、局所コラーゲン繊維の方向と分散液、および局所破裂株の定量が可能になります。パイプラインには、プラーク組織のコラーゲン線維を画像化するためのSHGによるMPMイメージングと、組織の破裂特性を定量化するためのDICおよび一軸引張試験が含まれます。

多光子顕微鏡-秒高調波発生(MPM-SHG)は、生体組織中のコラーゲンを研究するための一般的な技術となっています¹⁶。この手法には、組織学¹⁷、拡散テンソルイメージング(DTI)14、小角光散乱(SALS)¹⁵などの他のコラーゲンイメージング技術と比較して多くの利点があります。まず、MPM-SHGイメージングは非破壊的であるため、機械的試験と組み合わせるのに理想的です¹⁸。第二に、SHGシグナルはコラーゲンに特異的であるため、組織の染色は必要ありません。励起波長が長い(近赤外)ため、侵入深さは他の顕微鏡技術よりも大きくなります¹⁶。SHGイメージングで達成される高解像度(μmレベル)により、個々のファイバーの視覚化も可能です。これは、コラーゲン線維の数の局所定量化、コラーゲン線維の配向、分布など、多くの可能性を提供します¹⁹。

機械的試験と組み合わせたデジタル画像相関(DIC)は、生体組織²⁰の局所的な機械的特性を得るために広く使用されている方法である。DICでは、機械的試験中に取得した高速カメラ画像を比較することにより、組織表面に塗布されたスペックルの変位を追跡します²⁰。この画像後処理方法は、標本²⁰ の全磁場表面ひずみを推定するために使用され、組織²¹の破断挙動を研究するためにも使用できます。

Protocol

この論文に記載されているすべての方法は、ロッテルダムのエラスムス医療センターの倫理研究委員会によって承認されました。プラーク検体採取前に患者からインフォームドコンセントを得た。プロトコルのワークフローチャートを 図1に示します。

1.組織採取、マイクロコンピュータ断層撮影(μCT)イメージング、およびテストサンプルの準備

1. 組織の収集と保管
   1. 頸動脈内膜剥離手術を受けた同意患者から新鮮なヒト頸動脈アテローム硬化性プラーク標本を収集します。
      注:この手術から回収されたプラークサンプルは、脂肪の蓄積(脂質プール)と石灰化を含む頸動脈の罹患内膜層で構成されています²²。
   2. リン酸緩衝生理食塩水(1x PBS)を使用して血液の残留物を取り除き、ガーゼパッドで検体を乾燥させます。
   3. ピンセットを使用して検体を15 mLチューブに入れます。チューブを液体窒素に10分間入れて、組織を急速凍結します。
   4. 急速凍結後、μCT撮影当日まで-80°Cの冷凍庫に保存してください。
      注意: スナップフリーズは結晶形成を最小限に抑え、組織の微細構造損傷を引き起こします。ブタ大動脈組織に関する以前の研究では、-80°Cでの急速凍結および保存は組織の機械的特性に大きな影響を与えないことが示されています²³。
2. μCTイメージング
   1. μCT撮影当日、15 mLチューブからプラーク標本を取り出します。組織がチューブに付着している場合は、室温でチューブにPBSを充填します。サンプルをチューブから取り出すことができるまで、組織をPBSのままにします。
   2. プラーク標本をティッシュペーパーで完全に乾かします。
   3. 緑色のボタンを押してμCTシステムの電源を入れます。画面下部のCTソフトウェアでウォームアップを押して、15分待ちます。
   4. Cu 0.06 mm + Al 0.5 mmのX線フィルターをμCTシステムに手動で配置します。
   5. 画像を保存するフォルダーを選択します。
   6. 左側のパネルでパラメータを選択します。ドロップダウンリストを使用して、スキャン時間4分、分解能172μm、電圧90kV、アンペア数88mA、視野86mm、回転360°を選択します。
   7. デバイスのドアを開きます。プラットフォームを手動で引き出します。
   8. パラフィルムをプラットフォームに置き、サンプルをプラットフォーム上(プラットフォームのさらに極端に向かって)に置きます。
   9. プラットフォームを手動でデバイスに配置し、ドアを閉じます。
   10. ライブモード(目のアイコン)をアクティブにします。デバイスの矢印でプラットフォームを移動して、サンプルをFOVの中央に配置します。
   11. イメージングを開始します(中央下のアイコン)。イメージングが終了したら、下部(中止ボタンの下)にあるドアアイコンを押します。
   12. μCTスキャン後、ステップ1.1.3の説明に従って、プラーク標本を再度スナップフリーズします。多光子顕微鏡イメージングと機械的試験の日まで-80°Cで保存してください。
   13. 取得したμCTイメージングのDICOMファイルをオープンソースの3Dスライサソフトウェア²⁴で開く。
   14. セグメントエディターに移動します。マスターボリュームとして分析するボリュームの新規セグメンテーションの作成 | を選択します。
   15. [ 追加 ] をクリックしてセグメントを追加します。 名前 と 色 を押して、これらの パラメータを変更します。
   16. セグメントを定義するには、ウィンドウの下部にある effects | しきい値をクリックします。この閾値ツールを使用して、石灰化(>450 HU)組織領域と非石灰化(<450 HU)組織領域を区別します。しきい値を選択したら、下部にある[適用]を押します。
   17. [ 3D の表示 ] ( [追加] のすぐ右側) を押して、3D ビューでセグメンテーションを視覚化します。セグメンテーションの不要な領域がある場合は、 はさみ 効果でそれらを削除します。
   18. セグメンテーションモジュール内のセグメントの不透明度を変更するには、目的のセグメンテーションの名前をクリックします。
       注:可能であれば、μCTイメージングとμCT画像のレビューは、他のプロトコルと同じ日に実行できます。その場合は、手順 1.2.12 をスキップします。ただし、このプロトコルの後続の手順も時間がかかり、同じ日に実行する必要があることに注意してください。いくつかの練習の後、説明された設定と組織を使用すると、μCTイメージングには~45分、μCT画像のレビューは~15分、単一のテストサンプルのテストサンプルの準備は~1時間、顕微鏡検査は~4時間、一軸引張試験は~2時間かかります。
3. 試験サンプル調製
   1. コラーゲンイメージングと機械的テストの日に、室温のPBSに約10分間浸してプラークを解凍します。
   2. 手順 1.2.13-1.2.18 で作成したプラークの 3D 構築を 3D スライサー ソフトウェアで開きます。
   3. プラーク組織の自然のランドマークを使用して、3D再構成のどの部分が実際のプラークサンプルに対応するかを特定します。3D再構成のどの領域に石灰化が含まれていないかを特定し、実際のプラークでこの領域を視覚的に識別します。
   4. 外科用ハサミとピンセットを使用して、動脈の縦軸に沿ってプラークを切り開きます。手術による切り傷がすでに存在する場合は、組織を最適に使用するためにこの切り傷から始めます。サンプルの形状が管状ではなく、長手方向を定義するのが難しい場合は、サンプルをテストから除外します。
   5. プラーク標本から長方形の試験サンプルを切り取ります。涙や石灰化を含む組織領域を避けながら、テストサンプルができるだけ大きいことを確認してください。試験片の端に小さな裂け目や亀裂があると、引張試験中に既存の亀裂から亀裂が伝播する可能性があるため、この切断中は注意してください。
   6. テストサンプルの幅と長さ(WL)の比率が、引張試験機に取り付けられたゲージ長で<1であることを確認してください。サンプルがこの要件を満たしている場合、境界条件²⁵の観点から適切な引張試験に適しています。
      注: サンプル寸法の範囲は大きくなる可能性があります。著者らがテストしたサンプルのゲージ長は3.4〜12.9 mm、幅は1.6〜6.4 mmでした。

2. 多光子顕微鏡イメージング

1. 準備
   1. コラーゲンイメージングと機械的テストの日の前に、40 gのシリコーンエラストマーベースを2つの50 mLチューブに分け、パスツールピペットを使用して各チューブに2 gの硬化剤を追加します(1:10の比率)。2つの成分をピペットで混ぜます。
   2. チューブを700 × g で1分間遠心分離して、できるだけ多くの気泡を取り除きます。
   3. ペトリ皿(直径10 cm)にシリコンの薄層(約0.5〜1 cm)を入れ、オーブンで65°Cで3時間インキュベートするか、室温で48時間置きます。
   4. プラークテストサンプルを採取し、組織に針を固定して、その両端をシリコンに固定します(図2A)。サンプルの管腔側が上を向いていることを確認してください。機械的試験中に引張試験装置のクランプ内にあるサンプルの領域に針を挿入します。
   5. 安全メガネをかけます。サイドカッターを使用して針を短くし、サンプル表面から数ミリメートル未満突き出るようにし、顕微鏡の対物レンズが損傷するのを防ぎます。サンプルが水没するまで、ペトリ皿にPBSを入れます。
2. 顕微鏡のセットアップ
   1. 多光子顕微鏡に適切な対物レンズが取り付けられていることを確認してください。倍率20倍の赤外光を透過するように最適化された対物レンズを使用してください。
   2. 顕微鏡システムを起動します。顕微鏡の操作ソフトウェアを開きます。
   3. イメージングテーブルの初期化を求められたら、顕微鏡コンデンサーアームが押し戻され、対物レンズが最も低い位置にあることを確認してください。
   4. 多光子レーザーをアクティブにします。
   5. 図3のように、テストサンプルを入れたペトリ皿を対物レンズの下に置きます。レーザー設定を最適化する必要があるため、まだサンプルの上に対物レンズを配置しないようにしてください。さもなければ、レーザー光の可能な高出力は組織への損傷につながるかもしれません。
   6. 対物レンズがPBSに少し浸っていることを確認してください。必要に応じて、ピペットを使用してPBSを追加します。
   7. 光の波長を880nmに設定します。
      注:この波長が選択されるのは、使用される2光子システムの中心波長が約440nmであるためです。他の顕微鏡では、別の波長がより適用可能かもしれません。
3. タイルスキャンと撮影場所の選択
   1. 多光子レーザーをオフにして、顕微鏡の 明視野 モードをアクティブにします。次に、 ライブスキャン モードをオンにします。
   2. 対物レンズがサンプルの上にくるようにステージを配置し、サンプル表面に焦点を合わせます。ライブスキャンモードをオフにします。
   3. [取得]タブの2番目のパネルで、目的のバーをスライドしてズーム倍率を1に変更します。
      注意: このズーム倍率は、対物レンズの拡大率(20倍)とともに、キャプチャされた画像のサイズ(739 μm x 739 μm)を決定します。
   4. [取得] タブの 2 番目のパネルで、ドロップダウン リストを使用して、スキャン速度を 400 Hz、ライン平均を 1 に、解像度を画像あたり 128 x 128 ピクセル (ピクセル サイズ ~5.8 μm x 5.8 μm) に変更します。
   5. [取得] タブの最初のパネルでラスター パターン シンボルをクリックし、タイル スキャン パネルが表示されるのを待ちます。
   6. ライブスキャンモードをオンにします。スマートパネルのノブを使用して対物レンズをサンプルの隅に移動し、タイルスキャンパネルのマーク位置記号をクリックします。サンプルの各コーナーでこれを繰り返します。正しく実行すると、イメージング用に選択されたすべてのタイルを含むグリッドがオレンジ色で表示されます。
   7. 自動ステッチ機能をオフに切り替えます。
   8. 画面の右下隅にある [ 開始 ] をクリックして、サンプル サーフェス全体のタイル スキャンを作成し、サンプル ジオメトリの概要を取得します。
      注:説明されている設定、組織、および顕微鏡システムに基づいて、サンプル表面全体のタイルスキャンを取得するには~10分かかります。
   9. タイルスキャン後、顕微鏡システムのソフトウェアによって自動的に表示されるタイルスキャンパネルの各タイルの左上隅のx座標とy座標を観察します。スプレッドシートでこれらの座標をメモします。
   10. 顕微鏡ソフトウェアのタイルスキャンパネルで、スキャンフィールドと呼ばれるボックスのx方向とy方向のタイルの数を観察します。スプレッドシートのタイル スキャンのサイズをメモします。タイルのサイズ(739μm)を加算/減算して、他のタイルの座標を計算します。
       注:これらの座標は、SHGイメージングでスキャンするタイルの正確な位置を特定するために必要です。合計イメージング時間が問題にならない場合は、タイルをスキップせずにすべてのタイルをイメージングできます。
   11. タイル スキャンから、SHG イメージングでイメージ化するタイルを選択します。この選択では、クランプ内に入るタイルを避け、 図2Bに示すように、選択した各タイルの間に縦方向と円周方向の両方で1つのタイルを残します。
4. コラーゲンの可視化:SHGイメージング
   1. 部屋の照明を消し、顕微鏡ステージを遮光布で覆い、部屋からの光が検出器に到達しないようにします。
      注意: 検出器に到達する光を最小限に抑えると、画像取得中のノイズが減少します。
   2. 多光子(MP)レーザーをオンにします。
   3. 430〜450nmのバンドパスフィルターを備えた非デススキャン検出(NDD)検出器を選択します。
   4. 手順 2.3.10 で取得した情報を使用して、画像化するタイルの位置を特定します。指定されたボックスに 座標 を入力して Enterキーを押すと、目標が右側のタイルに移動します。 ライブスキャンモードをオンにします。
      注意: 他の顕微鏡または新しいバージョンの操作ソフトウェアでは、タイルスキャン内の場所への移動を自動的に行うことができます。この場合、各タイルのx座標とy座標をメモし(ステップ2.3.10)、オペレーティングソフトウェアに座標を入力する(ステップ2.4.4)必要はありません。
   5. ビームパス設定の下の上部パネルのスライダーを使用してMPレーザー出力を増やし、大幅な漂白なしで可能な限り最高のレーザー出力を取得します。次に、スマートパネルのノブを使用するか、[ビームパス設定]| [追加チャンネル]で検出器の名前をクリックして、明るい画像を取得しますが、ピクセルは飽和していません。検出器ゲインの標準値は500〜800Vです。
   6. スマートパネルのZ位置ノブを使用して、フォーカスプレーンを調整します。
   7. サンプルの一番上に移動し、zスタックパネル([取得]タブ| 3^番目のパネルの下)の矢印をクリックして、zスタックの上部の位置を設定します。
   8. 次に、SHG信号が検出されなくなるまでサンプルに焦点を合わせます-これがスタックの終わりです。もう一度、zスタックパネルの矢印をクリックして、この位置を設定します。終了したら、ライブスキャンモードをオフにします。
      注意: 組織は完全に平らではない場合があります。したがって、組織内の異なる領域の試料表面は、z方向にわずかに異なる位置を有し得る。
   9. [取得] タブの 2 番目のパネルで、ドロップダウン リストを使用して、スキャン速度を 400 Hz に保ち、ライン平均を 2 に設定し、解像度を画像あたり 512 x 512 ピクセル (ピクセル サイズ ~1.4 μm x 1.4 μm) に設定します。双方向Xスキャンボタンをオンに切り替えます。
   10. zスタックパネルでzステップサイズをクリックし、ボックスに3μmのzステップサイズを入力します。画面の右下隅にある [開始] をクリックして、Z スタックを作成します。完了したら、タイルの座標をファイル名に保存するか、各タイルに独自の番号を付けます (図 2B を参照)。
       注:説明されている設定、組織、および顕微鏡システムに基づいて、単一のタイルのzスタックの取得には~10〜15分かかります。準備ステップ(ステップ2.4.4-2.4.10)は、この時間見積もりに含まれています。

3.機械的試験

1. 一軸引張試験装置の準備
   1. 引張試験機の指示に従って、水平引張試験のセットアップ(図4)を使用できるようにします(ソフトウェアの電源を入れる、クランプを取り付ける、ロードセルを取り付けるなど)。
   2. 試験サンプルの滑りを最小限に抑えるために、引張試験機のクランプの内面に両面フォームテープ(図4A、B-2)を取り付け、フォームテープの内側にサンドペーパーを取り付けます。最終的に、サンドペーパーはテストサンプルと接触します。
   3. 加熱浴(図4A、B-3)を所定の位置に置きます。加熱浴にPBSをクランプの底面の高さまで満たして、サンドペーパーにまだ届かないようにします。
   4. 加熱槽の電源をONにし、温度を約37°Cに設定します。
   5. 高速度カメラを実験室台などを使用して引張試験装置(図4A-4)の上に取り付け、延長リングを介して焦点距離50mmのレンズをカメラに取り付けます。
   6. クランプに焦点が合っていること、および視野がストレッチ手順全体でサンプルを記録するのに十分な大きさであることを確認してください(FOV幅:サンプル幅±;FOVの長さ:サンプルの長さの±2倍)。
   7. 照明システム(図4A-5)を、たとえば実験室のスタンドを使用して、引張試験システムの上に取り付けます。照明システムをオンにし、カメラ画像で観察されるPBS表面に反射がないように光の強度と位置を調整します。
   8. カメラの露出時間とゲインを調整して、鮮明な画像を取得します。
   9. 画像取得ソフトウェアを、5.2 MPの解像度で30フレーム/秒でキャプチャするように設定します。
      注:この高いフレームレートは、後続のDIC解析を実行し、破断挙動を調べるために必要です。
   10. クランプの1つの変位速度を設定して、機械的試験中のグローバルエンジニアリングひずみ速度が組織の in vivo 生理学的ひずみ速度に類似するようにします
       (プラーク組織²⁶の場合は5%/秒)。
2. スペックルパターンの生成
   注:このスペックルパターンプロトコルは、Walshらによる以前の研究に基づいています²⁷。
   1. ティッシュペーパーで軽くたたいてサンプルを乾かします。
   2. 黒い組織染料をエアブラシの目的のバケツに入れます。
   3. エアブラシをコンプレッサーに接続します。 エアブラシコンプレッサー をオンにし、 圧力 を 25PSIに設定します。
   4. ティッシュにスプレーする前に、紙に最適なスペックルパターンを作成してみてください。白黒比50:50²⁸が満たされるまで数回スプレーします。エアブラシの針を前後に動かしてスペックルパターンの粗さを、スペックルのサイズが高速度カメラ²⁹の3〜5ピクセルのサイズに等しくなるまで調整する。
      注意: スペックルパターンは2つの異なる目的で使用されます。まず、これらのスペックルの変位は、機械的試験中に取得された高速度カメラ画像を比較することによって測定されます(DIC、ステップ4.2)。第2に、このスペックルパターンを使用して、サンプルの未変形状態の画像上の破裂位置を特定する(ステップ4.3.1)。
   5. エアブラシを試験サンプルから約30cm離して持ち、管腔表面にスプレーします。
   6. サンプルをPBSに沈める前に、室温で1分間色素をサンプルに結合させます。
3. 一軸引張試験
   1. サンプルを引張試験機のクランプに置き、サンプルの周方向を引張延伸方向に揃え、サンプルの管腔側を上向きにします。ストリップのWL比が<1になるように初期ゲージ長が設定されていることを確認してください。
   2. トルクドライバーを使用して20cNmのトルクを加えて、グリップのネジを締めます。最終的なトルクを適用する前に、各ネジに小さなトルクを適用して、これを徐々に行います。
   3. サンプルにテストに影響を与える可能性のある裂け目が含まれているかどうかを目視検査します。
   4. サンプルが水没するまでさらにPBSを加熱浴に導入し、PBSの温度が再び37°Cに達するまで待ちます。
   5. テストサンプルと定規が基準として含まれている高速度カメラでキャリブレーション画像を取得します。定規がカメラ対物レンズからサンプルの管腔面と同じ距離にあることを確認してください。
   6. ロードセルを風袋引きし、ロードセルと引張試験機のアクチュエータからのグローバルな力と変位の測定値の記録を開始します。
   7. サンプルのたるみを取り除くために、0.05 Nのプレストレッチを適用してサンプルをまっすぐにします。プレストレッチの適用後のアクチュエータによるゲージ長測定に基づいて、最大10%のひずみのプレコンディショニングを10サイクル実行します。
   8. 高速度カメラでサンプルの変形のビデオを記録しながら、サンプルが完全に破損するまで一軸引張試験を開始します。組織破壊後、グローバルな力と変位の測定値の記録を停止します。
      注意: 一部の市販の引張試験機は、手順3.3.6〜3.3.9を自動的に実行できます。現在のプロトコルでは、この自動オプションが使用されている引張試験機に含まれていない場合に実行する手動手順について説明しています。
   9. 引張試験装置から試験サンプルを取り出し、適切に廃棄します。
   10. 次のサンプルをテストするときは、クランプのサンドペーパーとフォームテープを交換してください。

4.データ分析

1. コラーゲン組織分析
   1. ImageJ で SHG を使用した MPM 中に取得した Z スタックを開き、各 Z スタックの最大強度投影 (MIP) を作成します。
   2. オープンソースのMATLABベースのFOA(繊維配向解析)ツール³⁰を用いて各MIPを分析し、タイル中に存在する個々のコラーゲン繊維の配向角を測定する。次のパラメータを使用します:スケール:容器の直径に応じて[3 4 5]または[2 4 6]、およびSHG信号の強度に応じて血管性のしきい値:0.999、0.9995、または0.9999。
      注意: このツールの使用方法の詳細については、ソフトウェアのマニュアル³¹を参照してください。
   3. 別のオープンソースの MATLAB ベースのツールである FibLab³² を使用して、ガウス分布を角度分布ヒストグラムに適合させます。
      注意: このツールの使用方法の詳細については、ソフトウェアのマニュアル³²を参照してください。
   4. FibLabを使用して得られたガウス分布プロットから、MATLABのワークスペースから次の構造パラメータを抽出します:分布のモードである優勢な繊維角(μ p)、繊維角分布の標準偏差(σ_p)、および異方性分率(P_ani = 1 − P_iso)。
      注:等方性分率はガウス分布のベースラインの下の面積であり、異方性分率にはそのベースライン³³の上にあるピークの面積が含まれます。_{σ p} とP_ani はどちらも、タイル領域における繊維の配向の分散に関する情報を提供します。
   5. 目視検査では、方向線を使用して_{μ p}をプロットし、カラーマップを使用して_pと_Paniσします。
2. デジタル画像解析と破断解析
   1. カメラ画像の目視検査を実行して、破裂開始が発生したフレームを特定します。このフレームで、破裂位置を視覚的に識別します。
   2. カメラ画像の目視検査を実行して、機械的テストの開始時に破裂した場所で最終的な亀裂や裂け目を特定します。そのような裂け目が存在する場合は、サンプルを分析から除外します。
   3. オープンソースのMATLABベースのソフトウェアNcorr(v1.2)³⁴を使用してDIC分析を実行します。Ncorrマニュアル³⁵の手順に従ってください。
      1. 引張試験時に記録したカメラ映像をDIC用高速度カメラで使用します。最終延伸前の最終フレームを失敗まで(プリコンディショニング後)参照 画像として選択します。現在の画像では、最後のストレッチの開始から、破断開始が発生したフレームの前の最後のフレームまでのすべての 画像を選択します。
      2. 関心領域(ROI)としてサンプル表面を選択します。クランプに近い領域(約1 mm)は、グリップの影響を強く受けるため、これらの領域を除外します。
      3. 次のパラメータを使用して DIC 解析を実行します。 サブセット半径: 30 ピクセル;サブセット間隔:3ピクセル。イテレーションカットオフ:50;差分ベクトルカットオフのノルム:10-5;ひずみ半径:5;自動伝播、ステップ #: 5.
      4. Ncorrを使用したDIC分析から、ROIのグリーン-ラグランジュ(またはオイラーひずみ)分布を取得します。これらのひずみ分布を使用して、破断前の最後のフレームにおけるプラークサンプル表面全体の平均グリーン-ラグランジュひずみを計算します。破断位置でのグリーン-ラグランジュひずみを計算します。
3. 破裂位置における構造データと機械データの相関
   1. テストサンプルの自然のランドマークとテストサンプルに適用されたスペックルを使用して、参照画像上の破裂場所(ステップ4.2.1で特定)を特定します(ステップ4.2.3.1)。
   2. テストサンプルの自然のランドマークを使用して、参照画像とタイルスキャンのオーバーレイを作成し(ステップ2.3)、タイルスキャンの破裂位置を特定します。破裂が発生した MPM-SHG タイルを特定します。MPM-SHGでスキャンしたタイルに破裂がない場合は、破裂位置に最も近いタイルを特定します。破断が発生したタイルで見つかった構造パラメータを取得します。

Results

組織採取と検査サンプル調製
組織収集により、プラーク線維組織標本が得られ、構造イメージングおよび一軸引張試験のために個々の試験サンプルに解剖することができます。理想的には、収集された線維組織サンプルには、裂傷がほとんどまたはまったくない領域(図5A)およびマクロ石灰化(図5B)が含まれています。これらの裂け目および石灰化が過剰になると(図5C)、前述のWL 1のサンプル寸法要件を満たさないプラークサンプルにつながる可能性があります。

多光子顕微鏡イメージング
SHGイメージングと画像後処理は、画像化された各タイルからのMIPを提供します(図6A、B)。繊維検出によるさらなる後処理(図6C)により、繊維配向ヒストグラム(図6D)が得られ、そこからコラーゲン構造パラメータを抽出できます(図6E)。さらに、プラークサンプル全体にわたる局所構造コラーゲンパラメータを示すカラーマップを視覚的分析のために得ることができる(図6F、G)。図6の代表的な試験サンプルでは、構造コラーゲンパラメータに大きなサンプル内変動が見られます(平均± SD μ p = -34°± 32°; σ_p = 21°± 4°;P_ani = 0.49 ± 0.14、円周方向が0°と定義されている場合)。このサンプル内変動は、均質性を仮定するのではなく、局所的な構造パラメータを取得することの重要性を強調しています。

機械的試験
破裂挙動
高速カメラは、機械的試験中のプラークサンプルの変形と破裂挙動の画像を提供します(図7)。これらの画像から、破断開始位置と破断伝播経路を特定することができます。破裂の識別結果は、カメラ画像に気泡または反射が存在する場合、または破裂の伝播が速すぎて選択したフレームレートでキャプチャできない場合に最適ではありません。

局所ひずみパターン
一軸引張試験中に取得したカメラ記録のデジタル画像相関分析により、 図8に示すGreen-Lagrangeひずみマップなどの局所組織変形マップが得られます。これらのマップには、破断開始前のフレームにおける3つのひずみ成分(ε_xx、ε_xy、およびε_yy)が表示されます。これらのひずみマップから、関心領域内の平均ひずみと、破断場所などのスポットにおける局所ひずみを抽出することができます。

図8の代表的なサンプルについては、局所ひずみデータは大きなサンプル内変動を示しています。図8の代表的な試験サンプルでは、局所株に大きなサンプル内変動が見られます(観察された菌株の範囲は次のとおりです:ε_xx = -0.30-0.17; ε_xy = -0.13-0,20; ε_yy = 0-0.40)。これは、組織の均質性を仮定して得られた総平均値ではなく、ローカルデータを取得することの重要性を強調しています。

機械的および構造的組織情報の相関
上記の結果は、組織の局所的な変形および破裂挙動をコラーゲン構造に関連付けることを可能にする。カメラ記録で破裂位置が特定されると(図9A)、参照カメラ画像(図9B)および顕微鏡タイルスキャン(図9C)にマッピングすることができます。これにより、破裂が発生したMPM-SHGタイルと、このタイルで見つかった構造パラメータが提供されます(図9D)。図9に示す代表的なサンプルで破裂が発生したタイルに見られる構造パラメータは、μ p = 28°、σ_p = 19°、およびP_ani = 0.6です。同じ手順を、破裂していない組織位置にも適用できます。ラプチャーフレームからの参照画像上のラプチャー位置のマッピングは、スペックルパターンが悪く、自然のランドマークが不明瞭な場合、困難な場合があることに注意することが重要です。さらに、組織の自然のランドマークが十分に明確でない場合、タイルスキャンオーバーレイと高速カメラ画像の同時登録が困難になる可能性があります。

図1:提示した実験プロトコルのワークフローチャート。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:タイルスキャンからのSHGイメージング用のタイルの選択 。 (A)シリコンにピン留めされたテストサンプル。(B)明視野顕微鏡で得られた被検試料のタイルスキャン。SHG イメージング用に選択されたタイルは、青い四角形でマークされます。(C)SHGを使用したMPMの最大強度投影。スケールバー= 140μm(C)。略語:SHG =第2高調波発生。MPM = 多光子顕微鏡。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:多光子顕微鏡の対物レンズの下に置かれたプラークサンプル。 プラークサンプルの位置は、リン酸緩衝生理食塩水で満たされたペトリ皿によって確保されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:さまざまなコンポーネントが示されているカスタム設計の一軸引張試験機 。 (A)システムの全体像。クランプのサンドペーパーインサートは、下部クランプのみが取り付けられているため、表示されることに注意してください。(B)試験片を試験の準備ができている引張試験機のクランプの拡大画像。略語:PVC =ポリ塩化ビニル;LED = 発光ダイオード。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図5:代表的なサンプルからの組織採取とサンプル調製の結果 。 (A)頸動脈内膜剥離手術を受けた同意患者から回収された新鮮で無傷のプラークサンプル。(B)μCTスキャンからの3D再構成。石灰化した組織は水色で示され、石灰化していない組織は赤で示されています。石灰化した組織のない最適なサンプルは、青い線の間の領域から得ることができました。(C)過剰の石灰化組織を伴う次善のプラークを示すμCTスキャンからの3D再構成。スケールバー= 3 mm。略語:μCT =マイクロコンピュータ断層撮影。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図6:代表的なサンプルからのMPM-SHGの結果 。 (A)タイルスキャンの概要。イメージング用に選択したタイルは青色で表示されます。(B)さまざまなタイルからのMIP。(C)選択したタイルからのFOAツールによるファイバー検出。(D) 選択したタイルからの繊維配向ヒストグラム。(E)繊維配向ヒストグラム+ガウスフィット、そこからコラーゲン構造パラメータを選択したタイルから抽出できます。(F)プラークサンプル全体にわたるμ_p (配向黒線)およびσ_p (背景色)の表現。(G)プラークサンプル全体にわたるμ_p (配向黒線)および_Pani (背景色)の表現。スケールバー= 140μm(B、C)。略語:MPM-SHG =多光子顕微鏡-第2高調波発生;MIPs = 最大強度投影。FOA = 繊維配向解析;μ_p =優勢な繊維角。P_ani =異方性分率;σ_{p =ファイバー} 角分布の標準偏差。P_iso =等方性分率。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図7:引張試験手順中のプラーク組織サンプルにおける破裂の開始と伝播.1) 伸張前の状態、無傷の組織。 2) 破裂開始-破裂が観察される最初のフレーム。破裂開始位置は赤い四角でマークされています。 3 )および 4) 破裂伝播。 5) プラークサンプルの完全な破裂。スケールバー= 1 mm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図8:DIC分析で得られた、破断前のフレームにおける代表サンプル(ε_xx、ε_xy、およびε_yy)の緑-ラグランジュひずみパターン。 プラーク全体の平均と標準偏差が、破裂位置のひずみとともに与えられます。略語:DIC =デジタル画像相関。ε_xx =縦ひずみ;ε_xy = せん断;ε_yy =引張ひずみ。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図9:画像上の破断箇所(赤四角)のオーバーレイ画像。 (A)破断が特定された高速度カメラ画像(破断フレーム)。(B)プリストレッチのみが適用された高速度カメラ画像(参照フレーム)。(C)顕微鏡 で 得られたタイルスキャン画像。(D)さまざまなタイルでの局所コラーゲン構造パラメータを示す色分けされたマップ。プラークサンプル全体のμ_p (配向黒線)と_Pani (背景色)が提示されます。略語:μ_p =優勢な繊維角。_Pani =異方性分率。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Discussion

現在の研究は、線維性アテローム硬化性プラーク組織の局所的なコラーゲン配向と分散、局所的な機械的特性、および破裂挙動の間の相関を研究するためのメカノイメージングパイプラインの開発に焦点を当てました。本明細書に記載されるプロトコルは、いくつかの理由で革新的である。まず、機械的負荷下での線維性プラーク組織の局所変形を測定するためにデジタル画像相関が適用されたのはこれが初めてです。第二に、このプロトコルは、局所変形パターンと線維性プラーク組織の局所コラーゲン構造との関連を分析するために必要な情報を提供する。局所評価の重要性は、組織の不均一な性質を示す結果セクションに提示された菌株データとコラーゲンデータの両方によって強調されています。したがって、このプロトコルで利用されているような局所評価を可能にする技術の使用は、線維性プラーク特性の将来の研究に推奨されます。

テストサンプルの準備は、このプロトコルの重要なステップの1つです。頸動脈プラークは主にコラーゲン組織です。しかしながら、それらは、全体的なプラーク機械的挙動に影響を及ぼすと考えられる石灰化を含み得る^36、37。この研究はプラークの線維組織成分に焦点を当てているため、μCTイメージングを使用することにより、テストサンプルの石灰化が回避されます³⁸。μCTが利用できない場合は、MRIやOCT³⁹ などの他のイメージング技術を使用して、プラークの石灰化領域を検出できます。石灰化がなく、機械的試験に機能する十分な大きさの線維組織試験サンプルを入手することは、重度に石灰化している、または分散した石灰化を含むプラークにとって困難な作業になる可能性があります。プロトコルのもう一つの課題は、デジタル画像相関のための最適なスペックルパターンを生成することです。最適なDICには、50:50²⁸ の白黒比が必要であり、適切な品質を確保するために3〜5ピクセル^{のサイズ29} の斑点があります。これらの要件を満たさないと、局所ひずみ測定が不正確になる可能性があります。最後に、組織の自然なランドマークが明確でない場合、破裂位置をSHG画像にマッピングすることは困難な場合があります。このようなサンプルでは、イメージング前に組織にいくつかの基準マーカーを適用すると役立ちます。

現在のプロトコルで使用されているMPM-SHG技術は、比較的大きな浸透深さを有する高解像度で非破壊的な技術であるため、他の多くのコラーゲンイメージング技術よりも優れています。しかし、MPM-SHGの浸透深さ(<400μm)は、0.5〜2mmの範囲の試験サンプルの厚さ全体をイメージングできないため、制限があります。拡散テンソル磁気共鳴画像法(DT-MRI)を用いた最近の研究では、プラーク組織のより深い部分における優勢な線維配向が、組織のより表在性の管腔部分におけるものとは異なる可能性があることを実証した¹⁴。したがって、厚い繊維状プラーク組織サンプルのより深い部分における局所コラーゲン構造と局所組織力学との関係を調査するために、さらなる研究が必要である。この目的のために、偏光空間周波数領域イメージング(pSFDI)を利用することができる。この最近開発された光学イメージング技術は、僧帽弁尖¹²の0.8mmの深さの繊維配向を測定する可能性があることが報告されています。また、pSFDIは高速アクイジションを提供し、現在のプロトコルのようにタイルの選択だけでなく、サンプル領域全体の視覚化を容易にすることもできます。現在のプロトコルのもう一つの制限は、表面変形のみを識別できることです。将来の研究では、ミラーアシストマルチ^{ビューDIC40} またはデジタル体積相関(DVC)⁴¹ をこのプロトコルに含めて、体積、地下ひずみに関する追加情報を得ることができます。

現在の実験プロトコルは、プラーク破裂のメカニズムおよびその基礎となる微細構造との関係に関する追加情報を得るために、いくつかの方法でさらに拡張または変更することができる。まず、現在のプロトコルには、円周方向の一軸引張試験が含まれています。このタイプの機械的試験は、プラークが主に in vivoで円周方向に引張り伸張を受けるために選択されました。より包括的な機械的特性評価のために、このプロトコルをさらに拡張して、インフレーション試験、二軸試験、または長手方向の一軸引張試験を組み込むことができます。第二に、現在のプロトコルは、DICを通じて局所株を取得することのみに焦点を当てています。ただし、プラークの機械的挙動のより完全なビューは、プロトコルに局所応力解析も含めることによって取得できますが、これには局所剛性の特性評価が必要です。現在挑戦的であるが、これは逆有限要素法^42、43 および仮想場法⁴⁴などの計算技術によって達成することができる。実験的な適応とは別に、いくつかの追加の後処理ステップを現在のプロトコルに追加することもできます。まず、破断箇所を特定するだけでなく、得られた高速カメラ画像 から 亀裂伝播経路を特定することができます。この伝搬経路は、局所的な構造的および機械的パラメータと相関させることができます。第2に、破断開始位置を、記載されたプロトコルにおいて視覚的に同定した。非生物学的組織に関する以前の研究では、DICひずみ測定の不連続性を使用して破裂^{を検出しました45}。このような自動破裂検出をプラーク組織に適用することで、破裂検出の精度が向上する可能性があります。最後に、他のコラーゲンイメージング技術と比較したMPM-SHGの大きな利点は、個々のコラーゲン線維を視覚化できることです。したがって、このプロトコル を介して 得られたデータは、コラーゲン含有量などの追加の局所コラーゲン特性を調査するためにも使用できます。

このプロトコルは、in vivoでプラーク破裂で機械的に失敗する成分である線維性プラーク組織の局所的特徴をよりよく理解するために使用できます。この情報は、患者のプラーク破裂を予測する新しい構造的および機能的イメージングマーカーを確立するために必要です。以前に示唆されたリスクバイオマーカーは、将来の臨床事象に対して最適ではない予測値を有することが示されているので、これらの新しいマーカーが必要である^5,6。将来、OCTおよびps−OCTは、動脈系における線維組織を同定し定量することができる^{可能性がある46、47、48}。また、菌株は局所プラーク組成物⁴⁹の代理マーカーとみなした。したがって、インビボひずみ測定⁴⁹は、患者におけるプラーク安定性の同定に役立つ可能性がある。ただし、得られた結果をin vivoプラーク破裂に直接変換する場合は注意が必要です。第一に、線維性プラーク組織は、このプロトコルで使用される一方向の引張荷重よりもin vivoでより複雑な負荷を経験します。第二に、アテローム硬化性プラークは多成分構造です。線維性プラーク組織におけるin vivoストレスおよびひずみ分布は、石灰化³⁷などの他のプラーク成分の存在および位置によって影響を受ける可能性がある。

このメカノイメージングパイプラインは、他のコラーゲン組織の研究にも利用できます。コラーゲンのグローバルな機械的試験と構造イメージングは、すでに生体組織に広く使用されています。ただし、不均一な繊維組織の正確な機械的特性評価には、コラーゲン構造だけでなく、破損前および破損特性の局所評価が重要です。この新しいプロトコルの構造は、いくつかの生物学的組織の微細構造と力学の間の相互作用へのさらなる洞察を提供すると期待しています。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10mm延長リング	Thorlabs Inc.	CML10
15 mL チューブ	VWR	525-0150
20x APO 水浸対物レンズ	ライカ	507701
3D スライサー ソフトウェア	N/A	バージョン 4.11
50 mL チューブ	VWR	525-0156
エアブラシ ピストル AB 430- ノズル径 0.3 mm	コンラッド	4.01614E+12
ブラックアウト、ナイロン生地ポリウレタンコーティング	Thorlabs
ブラックティッシュ染料	Polysciences inc	24113-2
カメラレンズ、焦点距離 50 mm	Thorlabs Inc.
カメラスタンド	VWR	241-0093, 241-7311
カメレオン ウルトラ多光子レーザー	コヒーレント
コンプレッサー+エアホース	JUN-AIR, Conrad	B07GB9HC62, 4016138577198
Excel	Microsoft	Version 2208
フォームテープ 両面, 1.9×150cm	パテックス
ヒーティングバス	N/A		オーダーメイド
ハイスピードカメラ+イメージングソフト	Pixelink-Navitar Inc.	PL-D725
ヒト頸動脈アテローム性動脈硬化性プラーク(頸動脈内膜切除術から)	該当なし
画像J	国立衛生研究所	該当なし
LAS-AF	ライカ	バージョン2.3	イメージングソフトウェア 多光子顕微鏡
ライカ TCS SP5 II	SHGイメージングに用いる	ライカ
照明システム	AMZ機器	LED-60TB	高速カメラで鮮明な画像を取得するために使用されます
MATLAB	MathWorks	バージョンR2021A
MATLABベースのFibLabソフトウェア	アイントホーフェン工科大学	N / A
MATLABベースのFOA(繊維配向解析)ツール	アイントホーフェン工科大学	N / A
MATLABベースのNcorrソフトウェア	ジョージアInstitute of Technology	Version 1.2
ニードル	エメラルド	BDAM302986
シャーレ (直径 10cm)	VWR	BRND452000
パラフィルム	VWR	291-1214
パスツールピペット	VWR	ELKA127-P511-000
Quantum GX2 マイクロコンピュータ断層撮影 (μCT)スキャナー+ Cu 0.06 mm + Al 0.5 mm	PerkinElmer	CLS149276
定規	ファインサイエンスツール	1800030
サンドペーパー(P180)	コンラッド	4.00932E + 12
サイドカッター	コンラッド	4.25084E + 12
シリコンエラストマーベースと硬化剤(シルガード184)	VWR	634165S
引張試験機+ソフトウェア+クランプ	N/A		円筒形リニアアクチュエーター(EACM2E10AZAK、オリエンタルモーター社製)、10Nロードセル(LCMFD-10N、オメガエンジニアリング社製)を使用して自社製
トルクドライバー	ギャラント、ホフマングループ	659906