方法論記事

全層皮膚熱傷と感染を研究するためのラット火傷モデル

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DOI：

10.3791/64345

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2022年8月23日

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1UNC Eshelman School of Pharmacy, University of North Carolina at Chapel Hill, 2Department of Biochemistry & Pharmacology, School of Biomedical Sciences, Faculty of Medicine, Dentistry and Health Sciences, The University of Melbourne, 3Department of Microbiology & Immunology, University of North Carolina School of Medicine, 4Department of Surgery, University of North Carolina at Chapel Hill, 5Curriculum in Toxicology and Environmental Medicine, University of North Carolina at Chapel Hill, 6Department of Microbiology, Monash Biomedicine Discovery Institute, Monash University

この記事について

サマリー

熱傷と感染症の臨床シナリオを模倣したモデルは、熱傷研究を促進するために必要です。本プロトコルは、ヒトにおけるそれに匹敵する単純で再現可能なラット熱傷感染モデルを実証する。これにより、新しい局所抗生物質治療を開発するための火傷および火傷後の感染症の研究が容易になります。

要約

熱傷誘発の方法論は、ラットモデルでは一貫して説明されていません。再現可能な熱傷研究を行うには、臨床シナリオを表す均一な熱傷モデルが必要です。本プロトコルは、ラットにおいて~20%の全体表面積(TBSA)全層熱傷を生じさせるための簡単で再現性のある方法を記載している。ここでは、水浴中で97°Cで加熱した22.89cm2(直径5.4cm)の銅棒をラット皮膚表面に塗布し、熱傷を誘発した。熱伝導率の高い銅棒は、皮膚組織の奥深くに熱を放散して、全層の火傷を引き起こすことができました。組織学的分析は、真皮および皮下組織の全層範囲への凝固損傷を伴う表皮の減弱を示す。さらに、このモデルは、免疫調節不全や細菌感染などの火傷後の入院熱傷患者で観察される臨床状況の代表です。このモデルは、グラム陽性菌とグラム陰性菌の両方による全身性細菌感染を再現できます。結論として、この論文は、免疫調節不全や細菌感染などの臨床状況を模倣した、習得が容易で堅牢なラット熱傷モデルを提示し、熱傷や感染症に対する新しい局所抗生物質薬の開発にかなりの有用性があります。

概要

火傷は最も壊滅的な形態の外傷の1つであり、専門の火傷センターでも死亡率は12%に達します1,2,3。最近発表された報告によると、米国では毎年~486,000人の熱傷患者が医療を必要としており、3,500人近くが死亡しています1,2,3,4,5,6。火傷は患者の免疫系に大きな課題を課し、治癒が遅い重大な開放創を作り出し、院内および日和見細菌による皮膚、肺、および全身のコロニー形成の影響を受けやすくなります。細菌感染と組み合わされた免疫調節不全は、火傷患者の罹患率と死亡率の増加に関連しています7。

動物の熱傷および感染モデルは、皮膚の損傷および熱傷外傷に関連する免疫抑制後の細菌感染の病因を研究するために不可欠です。このようなモデルは、熱傷患者の細菌感染症を治療するための新しい方法の設計と評価を可能にします。ラットとヒトは、以前に文書化されている同様の皮膚の生理学的および病理学的特徴を共有しています8。さらに、ラットはサイズが小さいため、大型の動物モデルよりも取り扱いが容易で、手頃な価格で、調達と保守が容易です。

これらの特性により、ラットは火傷や感染症を研究するのに理想的なモデル動物になります9。残念ながら、火傷誘発の技術は一貫性がなく、しばしば最小限に記述されています10、11、12、13、14。本プロトコルは、臨床シナリオをシミュレートし、免疫抑制および細菌感染を評価するために使用できるラットモデルで一貫した全層熱傷を作成するための簡単で費用効果が高く、再現可能な手順を開発するように設計されています。

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プロトコル

すべての手順は、ノースカロライナ大学の施設内動物管理使用委員会(IACUC)によって承認され、確立されたガイドラインに従って実施されました。7〜9週齢の雄および雌のSprague Dawleyラット(250〜300g)を実験に使用した。すべての動物は、12時間:12時間の明暗サイクルで飼育され、食物と水が 自由に自由にアクセスできました。研究を開始する前に、鎮痛計画について必ず施設の獣医師と協力してください。

1.火傷に対するラットの準備

  1. 火傷の24時間前に火傷に備えて動物を準備します。
  2. 呼吸が遅くなるまで、誘導チャンバー内の100%酸素中の5%イソフルランでラットを5分間麻酔します(流量:2 L / min)。
  3. ラットが深く麻酔されたら(すべての手足のつま先のつまみに反応しない)、ラットを腹臥位の加熱パッドに移動し、ノーズコーンを介して維持するためにイソフルランを酸素で1.5%に減らします。
  4. 麻酔後および処置中の角膜の乾燥を防ぐために、綿先端のアプリケーターを使用して両眼の角膜に眼脂を塗布します。
  5. 電気バリカンを使用してラットの背部を剃り( 材料の表を参照)、肩甲骨から尾の付け根まで大きな長方形でできるだけ多くの髪を取り除きます(図2A)。
  6. 生理食塩水に浸したティッシュで剃った部分をきれいにして、抜け毛を拭き取ります。先端がコットンのアプリケーターで剃毛部分に脱毛ローションを塗り、~3分間そのままにしておきます。
    注:参照されている脱毛ローションを3分以上塗布すると、皮膚に赤い発疹が誘発されます。
  7. 濡れたガーゼスポンジでその部分を2回拭いてローションを取り除き、皮膚の炎症を防ぎます。
  8. イソフルランをオフにし、ノーズコーンを取り外し、ラットを回復ケージに入れます。
    注意: 回復ケージに加熱パッドを入れます。
  9. 回収した動物を清潔な収容ケージに移し、翌日の火傷処置を行います(ラットが麻酔から回復するまでに~10〜15分かかる場合があります)。

2.ラットの火傷を誘発する

  1. 火傷の日に、水浴温度を97°Cに設定し、4本の銅棒すべて(各420 g; 図1)燃焼実験の1時間前に水浴中で、ロッドを均一に暖めさせた。
    注意: ロッドは水に浸す必要があります。実験前に温度計を使用してデジタル温度表示の精度を確認してください。
  2. セクション1で述べたようにラットを麻酔します。
  3. ラットがすべての手足のつま先をつまんで反応しなくなったら、維持のために酸素中の1.5%イソフルランを含む腹臥位の加熱パッドに置きます(図2A)。
  4. 疼痛管理のために腹腔内(i.p.)経路 を介して モルヒネ(体重20 mg / kg)を注射します 6.
  5. 水浴中の水の温度を確認してください。タイマーをセットし、耐熱手袋を着用してください。
  6. 加熱した銅棒を水浴から取り出し、ラットの背部に7秒間触れて火傷を誘発します。
    注意: 熱損失を最小限に抑えるために、水浴と動物の間に最小距離(10〜15 cm)を保ち、火傷を誘発している間はロッドに圧力をかけないでください(つまり、接触は重力によって維持する必要があります)。
  7. 火傷部位ごとに1本のロッドを使用して4回の火傷を4回適用し、直後に約20%のTBSAフルコンタクト火傷を引き起こします(図2B)。
  8. 火傷後、乳酸リンゲル溶液(0.1 mL / g体重)のi.p.注射によって動物を蘇生させます。.
    注:体温調整された乳酸リンガー溶液を使用して、ラットを蘇生させます。
  9. イソフルランをオフにし、ノーズコーンを取り外し、回復のためにラットをヒートマットの上に置きます。

3.細菌接種材料と感染の準備

  1. 緑 膿 菌PAO1および 黄色ブドウ球菌のATCC25923の凍結サンプルを、火傷実験の2日前にミュラーヒントン寒天培地(MHA)プレートにストリークします。
  2. 翌日、プレートから増殖した細菌の単一のコロニーを選択し、接種ループを使用して、プレートからわずかにこすり落とします。その後、それを培養チューブに入れて10 mLのミュラーヒントンブロス(MHB)を植菌し、インキュベーターシェーカーで37°Cで一晩培養した。
  3. 火傷と感染の日に、培養液を4,000 × g で5分間遠心分離します。ペレットを生理食塩水(0.9%NaCl溶液)で洗浄する。
  4. 細菌ペレットを生理食塩水に再懸濁し、0.1 OD600 nm(600 nm での光学密度)まで希釈します。この細菌懸濁液200μLを取り、それを生理食塩水800μLと混合して細菌接種材料を希釈し、2 ×10 7 CFU / mLの所望の細菌接種材料を得る。
  5. 前のステップで調製した 緑膿 菌または 黄色ブドウ球菌の接種源50 μL(感染用量1×106 CFU )を、火傷の15分後に麻酔をかけたラットに、29 Gの針を使用して熱傷のできるだけ近い皮下に注射します。
  6. 火傷の傷に感染した後、回復のためにラットを加熱パッドの上に置きます。動物が回復したら(~15〜20分)、清潔なケージに保管します。
    注:火傷の後、ケージごとに1匹のラットを飼ってください。噛みやすいように水ウェットフードペレットを使用し、手が届きやすいようにケージの床に置きます。
  7. 疼痛管理のために、ケージ内のウォーターボトルにモルヒネ添加水(0.4 mg / mL)を入れます。.
    注:経口モルヒネは、人間の火傷患者の臨床状況を反映しています。この研究では、経口モルヒネを利用して、獣医スタッフと何度も相談した後、これらの実験を人間の火傷患者に匹敵するようにしました。飲酒と体重のログは、実験を通して維持されました。すべての手順で同じ飲酒システムを使用してください。ブプレノルフィンなどの他の鎮痛薬は、施設の動物飼育ガイドラインに従って皮下/腹腔内に投与できます。.
  8. モニタリングチェックリストに記入し、実験期間中、動物の苦痛や病気を注意深く監視します。

4.火傷の評価

  1. 火傷の直後の色とマージンの観点から皮膚熱傷を形態学的に評価します。
  2. 熱傷した皮膚をヘマトキシリンとエオジン(H&E)で染色して、熱傷の構造と上皮間隙15 を視覚化します(サンプル処理についてはステップ5.6を参照)。

5.ラットサンプルの後処理と細菌の列挙

  1. 火傷後24、48、および72時間でラットを過剰摂取の麻酔で安楽死させます。.
  2. 心臓穿刺 によって ラットから血液サンプルを採取し、ミニコレクトチューブに採取します。
    1. 血液サンプルからの完全な血球数を分析して、宿主の免疫系に対する火傷誘発の影響を判断します。
  3. 安楽死時に皮膚、皮下組織、筋肉、肺、脾臓を採取します。
    注:皮膚の一部(~1 cm × 1 cm、重さ~200-300 mg)はH&E染色用に、別の部分は細菌の計数用に保管してください。
  4. 10 mLの収集チューブに組織を採取し、氷上の通常の生理食塩水に入れて細菌を数えます。
  5. 通常の生理食塩水で組織重量を正規化し、組織ホモジナイザーを使用してサンプルを均質化します( 材料表を参照)。
    1. 組織ホモジネートを通常の生理食塩水で順次希釈する。
    2. 緑 膿菌に感染したラットから採取したサンプル用のセトリミド寒天プレート上の希釈ホモジネート100μLおよび各組織サンプルのすべての希釈液をプレート。
      注: 黄色ブドウ球菌に感染したラットから収集されたサンプルのメッキには、マンニトール寒天プレートを使用してください。.
    3. プレートをインキュベーター内で37°Cで16〜18時間インキュベートします。
    4. 翌日、プレート上の細菌コロニーをカウントし、希釈比を掛けてCFU / mLカウントを取得し、組織の重量で正規化してCFU / g組織を計算します。
    5. データ分析ソフトウェアを使用して、さまざまなサンプリング時点でのさまざまな臓器の細菌数をプロットします。
  6. 火傷した皮膚のH&E染色を行い、創傷構造と上皮間隙を視覚化します。
    1. はさみと歯付き鉗子を使用して、火傷領域から1 cm x 1 cmの皮膚パッチを切り取り、固定液(10%中性緩衝ホルマリン、NBF)に室温で48時間浸します。
      注意: 容器を回転させて、すべての組織が固定液に完全に浸され、固定液の体積が組織体積の30倍になるようにします。
    2. 皮膚組織を70%(v / v)エタノールで室温で72時間脱水します。
    3. 脱水したサンプルをパラフィンブロックで処理して切片を切断し、H&E15で染色します。
    4. 40倍の対物レンズを使用して、スライドスキャナー( 材料表を参照)で染色されたスライドをデジタル画像化します。
    5. ソフトウェアを使用してスキャンした画像を解析します(解析用画像の処理については 補足ファイル1 を参照、 資料表を参照)。
    6. 染色された皮膚セクションのすべてのフィールドを調べて、表皮、真皮、皮下組織、および骨格筋の状態を評価します。

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結果

ここに提示されたプロトコルは非常に再現性が高く、ラットに3度の全層熱傷をもたらしました。火傷の傷は、火傷誘発後にワックス状の白色に見えます(図2B)。火傷の色は、火傷後72時間の間に白から茶色に変化しました(図2B-E)。

組織学的分析により、全層熱傷(熱傷後24時間の深さ>2.61 mm; 図3B)。無傷の非火傷皮膚と比較して、火傷動物の皮膚サンプルは、火傷後24、48、および72時間ですべての層にわたって損傷の証拠を示しました(図3)。さらに、組織学的分析では、皮下脂肪と骨格筋の関与により、表皮層が完全に破壊され、真皮の厚さ全体が損傷することが示されました(図3B)。

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ディスカッション

熱傷の病態生理学を研究するために、いくつかの熱傷モデルが提示されている8、12、16、17。本研究では、ラットモデルを使用して、患者の感染した熱傷をシミュレートするために、全層熱傷とそれに続く細菌感染を誘発するためのシンプルで再現性のあるプロトコルを開発しました。人間の状態を模倣する動物モデルとしてのラットの選択は、コスト、使いやすさ、再現性、およびデータの信頼性のバランスに基づいています。本明細書で使用されるラットモデルは、他のモデルに比べて多くの利点を有する:それは取り扱いが容易であり、最も一般的に使用される熱傷モデルであり、文献間の比較を可能にする。ラットは実験環境で広く使用されているにもかかわらず、ラットとヒトの外皮は組織学的に同一ではありません18,19。ラ...

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開示事項

著者は開示する利益相反を持っていません。

謝辞

著者らは、動物の提供と世話についてノースカロライナ大学の比較医学部門に感謝しています。病理サービスコアのローレンラルフとミアエヴァンジェリスタには、組織切片やイメージングを含む組織病理学/デジタルパソロジーに関する専門的な技術支援に感謝します。この研究は、国防総省(賞番号W81XWH-20-1-0500、GRおよびTV)からの研究助成金によって支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1 mLシリンジBD、米国309597鎮痛剤
1.7 mLマイクロチューブオリンパス、米国24-282運ぶために使用
、米国16004-115染色するための皮膚片を固定
302832乳酸リンガー溶液
70%エチルアルコールフィッシャーを注射するために使用されますサイエンティフィック、米国BP28184
Aperio AT2 デジタルパソロジー ImageScopeソフトウェアAperio、Technologies Inc.、Vista、CA、米国n / aのスキャンとスライドスキャナーH &Eスライドと分析
セトリマイド寒天プレートBD、米国285420Pseudomonas aeruginosa 成長のための選択的メディアプレート
銅棒n/an/a火傷を誘発するために使用される
綿先端アプリケーターオメガ外科用供給、米国4225-IMC目の軟膏を塗布するために使用される
電気シェーバーオスター、米国ゴールデンA5背側の側毛を取り除くために使用されます
アイルーブデクラ、英国n/a長持ちする快適さを提供し、目の乾燥を避けるための目濡れ剤
綿毛で満たされたアンダーパッドメドライン、米国MSC281225火傷手順で使用
鉗子FST11027-12スキンピースを保持するために使用されます
ゼスポンジオアシス、米国PK412背側から塗布されたナイアクリームをきれいにするために使用されます 
耐熱性手袋n/an/a加熱された銅棒を保持するために使用されます
血液学分析装置IDEXX研究所、米国ProCyte Dx
誘導室ケントサイエンティフィック、米国vetFlo-0730動物を麻酔するために使用されます
インスリン注射器BD、米国329461
イソフルランピベットタル、米国NDC46066-755-04意識の喪失を誘発するために麻酔をかけたラットに使用
イソフルラン気化器n/an/a
乳酸リンガーの溶液icumedical, USANDC0990-7953-09ラットの蘇生に使用
L字型スプレッダーFischer Scientific, USA14-665-230
Mannitol AgarBD, USA211407黄色ブドウ球菌成長
ミニコレクトチューブ(K2EDTA)greinerバイオワン、米国450480血液を収集するために使用
モルヒネMallinckrodt、英国NDC0406-8003-30この鎮痛剤は、火傷の痛みを感じることができないように誘導するために使用されました
Muller Hinton BrothBD, USA275730
MullerHinton II AgarBD, USA211438
Nair 脱毛ローションNair, USAn/a背側の残毛を除去するために使用
Needle 23 GBD, USA乳酸リンガー溶液の注入に使用
通常の生理食塩水n/a n/a
分光光度計ThermoScientific, USAGenesys 30
Sprague-Dawleyラット、オスとメスのCharles River Labs、7-9週齢、火傷誘発手術
用シザーF.S.T.14501-14所望の皮膚片を切断するために使用
組織収集チューブグローブサイエンティフィック 220101236
組織ホモジナイザーキネマティカ社、米国POLYTRON PT2100組織サンプルを均質化するために使用
ウォーターバスフィッシャーサイエンティフィック、米国n/a火傷を誘発するために使用
加重加熱パッドComfytemp、米国n/aラットの体を暖かく保つために手順中に使用
を注入するために使用されます モルヒネ10%NBF VWRを 30 mLシリンジBD、米国をするために使用されます ガー 305193

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