方法論記事

スケーラブルな3Dエンジニアリング筋肉組織における前臨床薬物検査

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DOI：

10.3791/64399

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2023年4月7日

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1Curi Bio Inc.

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この記事について

サマリー

このプロトコルは、3Dエンジニアリングされた心臓および骨格筋組織を生成するための方法を提供し、前臨床薬物スクリーニングモダリティにおけるそれらの使用について説明します。記載された方法は、磁気センシングシステムを利用して、24個の組織の同時評価を並行して容易にする。

要約

in vitroで健康状態と病状を正確にモデル化することは、新しい治療戦略と治療法の開発に不可欠です。心臓および骨格筋疾患の場合、収縮力と動力学は、筋肉機能を評価するための重要な指標を構成します。人工多能性幹細胞から人工筋肉組織(EMT)を生成するための新しく改良された方法により、収縮組織に対するin vitro疾患モデリングの信頼性が向上しました。しかし、浮遊細胞培養物から組織を再現性よく作製し、その収縮性を測定することは困難です。このような手法は、多くの場合、高い故障率に悩まされており、複雑な計測器とカスタマイズされたデータ分析ルーチンが必要です。3D EMTをラベルフリーで高度に並列化され、自動化しやすい収縮性アッセイと組み合わせて利用する新しいプラットフォームとデバイスは、これらの障害の多くを回避します。このプラットフォームは、事実上あらゆる細胞源を使用して、3D EMTの容易で再現性のある製造を可能にします。次に、複雑なソフトウェア分析ルーチンを必要とせずに、24の組織を同時に測定する機器を介して組織収縮性を測定します。この装置は、マイクロニュートンの力の変化を確実に測定できるため、用量依存的な化合物スクリーニングにより、収縮出力に対する薬物または治療の効果を測定することができます。この装置で作られた人工組織は完全に機能し、電気刺激を受けるとけいれんや破傷風の収縮を引き起こし、数週間または数ヶ月にわたって培養中で縦断的に分析することができます。ここでは、予期せぬ心毒性のために患者が死亡した後に臨床試験から引き出された薬物(BMS-986094)を含む、既知の毒物による急性および慢性投与下の心筋EMTからのデータを示します。ミオシン阻害剤による治療に応答して操作された組織における骨格筋機能の変化も提示される。このプラットフォームにより、研究者は、最小限の追加トレーニングやスキルで、複雑で情報が豊富なバイオエンジニアリングモデルシステムを創薬ワークフローに統合できます。

概要

人工多能性幹細胞(iPSC)モデルは、治療薬の発見と開発、ならびに基礎生物学的研究と疾患モデリングの前臨床パイプラインの主要なプレーヤーになりつつあります1,2,3,4,5。iPS細胞に由来する心筋や骨格筋などの収縮組織は、筋収縮力と動力学の直接評価が組織全体の機能を研究するための定量的指標であるため、ヒトのin vitro研究の予測力を向上させる大きな可能性を秘めています4,6,7,8。典型的には、収縮力の測定は、基質のたわみ9,10の光学的追跡によって間接的に、または力変換器4,11,12への細胞/組織の付着によって直接的に得られている。これらの方法は正確ですが、本質的にスループットが低く、通常、データを収集して分析するには高度なスキルを持つオペレーターが必要です。

以前の研究では、磁場センシングがこれらの障害を回避し、複数の組織構築物にわたって同時に操作された筋肉機能を評価するための代替方法を提供することが示されています13。Mantarray(eNgineered Tissue ARRAY用磁気測定分析装置)3D収縮性プラットフォームは、この技術に基づいて構築されており、操作された筋肉組織の収縮性を高度に並列的に測定できるデバイスを使用しており、3D細胞モデルの複雑さとハイスループットスクリーニングを活用しています14。このプラットフォームは、標準的な細胞培養インキュベーター内外の心臓および骨格筋組織の収縮機能をラベルフリーで定量的にリアルタイムでモニタリングできるため、光学ベースの収縮イメージングと分析が不要になります。この技術は、健康な細胞株と病気の細胞株の直接比較を容易にし、収縮組織に対する薬物の効果の測定を可能にし、新規および既存の治療化合物の定量化可能な in vitro、安全性、および有効性のデータを確立します。

操作された3D筋肉組織は、Mantarray消耗型24ウェル鋳造プレートを使用して、再現性の高い方法で2つの支柱間で製造できます(図1)。1つのポストは剛性があり、もう1つのポストは柔軟性があり、小さな磁石が含まれています。組織構築物が収縮すると、フレキシブルポストと埋め込まれた磁石が変位します。EMTプレートは機器内に配置され、後変位はプレートホルダーの下の回路基板上の磁気センサーのアレイ を介して 測定されます。磁場の測定された変化は、数学的アルゴリズムを使用して絶対収縮力に変換されます。この装置は、迅速なデータサンプリングレートを採用しており、収縮頻度、速度、崩壊時間など、アッセイ対象の細胞タイプの機能容量と成熟度に関する詳細情報の収集を可能にします。これらの機能測定は、磁気センシングプラットフォームと同時に24ウェルすべてにわたって取得することも、従来の光学的方法を使用して個別かつ順次取得することもできます。

この研究では、フィブリンベースのヒドロゲルで3D骨格筋と心臓微小組織を操作するための再現性の高い方法について説明します。短時間の80分間の反応中に、トロンビンはフィブリノーゲンのフィブリンへの変換を触媒し、浮遊培養で筋細胞が発達するための足場を提供します15。間質細胞はマトリックスのリモデリングを助け、筋肉細胞がヒドロゲル内に合胞体を形成するにつれて組織は収縮します。これらの組織の収縮性は、化合物曝露の前後に磁気センシングアプローチを使用して分析され、用量反応薬物研究で使用するためにこのモダリティを検証しました。健康なドナー生検からの初代ヒト筋芽細胞を商業的に入手し、ベンダーのプロトコルに従って2Dで培養しました。骨格筋成長培地を用いて細胞を3回の継代で増殖させ、3D組織を作製するのに十分な細胞数を生成した。間質細胞およびhiPSc由来心筋細胞をベンダーのプロトコルに従って3日間培養し、細胞を組織に鋳造する前に凍結保存からの回復を可能にしました。磁気センシングプラットフォームを使用して収集できるデータセットのタイプを示す代表的な結果が提供されています。これらの方法を使用した人工組織の生成に関連する一般的な落とし穴についても説明します。

プロトコル

1. 細胞培養プロトコル

  1. 初代ヒト筋芽細胞培養
    1. 細胞外マトリックス(ECM)を氷上で8 mLのDMEM/F12培地で1:100の比率で希釈します。
    2. 8 mLのECM溶液を1つのT175フラスコに塗布し、細胞播種の前に少なくとも1時間、ただし24時間以内に37°Cでインキュベートします。ECMソリューションがフラスコの底部全体を覆っていることを確認します。
    3. 5 mLの骨格筋成長培地を15 mLのコニカルチューブに分注します。
    4. 凍結した細胞バイアル(5.0 x 105 筋芽細胞)を37°Cの水浴中で2分間、または氷が溶けるまで解凍します。バイアルに70%エタノールをスプレーし、バイオセーフティキャビネット(BSC)に移します。
    5. P1000を使用して細胞を分注培地に移します。粉砕しないでください。細胞を300 x g で3分間遠心分離します。
    6. 上清を吸引し、P1000ピペットを使用して1 mLの増殖培地に細胞を再懸濁して、単一の細胞懸濁液を達成します。
    7. ECMコーティングされたフラスコを15 mLのDPBSで洗浄します。DPBSを吸引し、30mLの成長培地をフラスコに加えます。
    8. 4 mLの増殖培地を細胞に加え、混合して、細胞懸濁液をT-175フラスコに分配します。総容量が35mLであることを確認してください。フラスコの表面に沿ってフラスコを左右に5〜6回静かにスライドさせ、続いて前後に5〜6回スライドさせて、フラスコ表面上の細胞が均一に分布するようにします。
    9. T-175フラスコを37°Cおよび5%CO2の細胞培養インキュベーターに入れます。細胞を3日間、またはコンフルエント度が70%以下になるまで培養し、次いで細胞を継代する。
  2. 初代ヒト筋芽細胞の継代
    1. 氷上で30 mLのDMEM/F12培地でECMを1:100の比率で希釈します。
    2. 10 mLのECM溶液を3つのT225フラスコに塗布し、細胞播種の前に少なくとも1時間、ただし24時間以内に37°Cでインキュベートします。ECMソリューションがフラスコの底部全体を覆っていることを確認します。
    3. 細胞を15 mLのDPBSで洗浄します。解離試薬を吸引し、ベンダーのプロトコルに従って追加します。
    4. 細胞が持ち上げられたら、ベンダーのプロトコルに従って反応を停止し、細胞を円錐形のチューブに集めます。細胞を300 x g で3分間遠心分離します。
    5. 上清を吸引し、P1000ピペットを使用して1 mLの増殖培地に細胞を再懸濁して、単一の細胞懸濁液を達成します。
    6. ECMコーティングされたフラスコを15 mLのDPBSで洗浄します。DPBSを吸引し、次いで40mLの増殖培地を各T225フラスコに加える。
    7. 14 mLの増殖培地を細胞懸濁液に加え、混合し、5 mLの細胞懸濁液を各T225フラスコに分配します。各フラスコの総容量が45mLであることを確認してください。フラスコを作業面に沿って左右に5〜6回静かにスライドさせ、続いて前後に5〜6回スライドさせて、均等に分散させます。
    8. フラスコを37°Cおよび5%CO2の細胞培養インキュベーターに入れる。
    9. 細胞を2〜3日間、またはコンフルエントが70%以下になるまで培養し、その後継代します。各継代でセルを1:3または1:4で分割し、3 x 103 と1 x 104 セル/ cm2の間にシードします。
  3. ヒプロップス由来心筋細胞培養
    1. 氷上で12 mLのDMEM/F12培地でECMを1:60の比率で希釈します。
    2. 1 mLのECM溶液を2つの6ウェルプレートの各ウェルに適用し、細胞播種の前に少なくとも1時間、ただし24時間以内に37°Cでインキュベートします。
    3. 心筋細胞の凍結バイアルを37°Cの水浴中で2分間、または氷が溶けるまで解凍します。
    4. バイアルに70%エタノールをスプレーし、BSCに移します。
    5. p1000ピペットを使用して、解凍した細胞を50 mLコニカルチューブに移します。
    6. 空のクライオバイアルを1 mLの室温(RT)メッキ培地ですすぎ、残りの細胞を回収します。
    7. 1 mLのリンス培地を90秒かけて細胞の円錐形のチューブに滴下(5秒ごとに1滴)ゆっくりと分注します。チューブを連続的に旋回させて、遅い培地添加中に細胞を混合します。
    8. 10 mLの血清学的ピペットを使用して、8 mLのプレーティング培地を50 mLのコニカルチューブにゆっくりと加えます。
    9. すべての培地を分注した後、細胞を完全に混合するために3回ゆっくりと上下にピペットします。血球計算盤とトリパンブルーを使用して細胞をカウントします。
    10. 50 mLコニカルチューブ内の細胞を300 x g で3分間遠心分離します。
    11. 細胞がペレット化された後、上清を吸引する。
    12. p1000ピペットを使用して1 mLのメッキ媒体をチューブに移し、ゆっくりと上下に3〜5回ピペッティングしてペレットを静かに分解します。追加のメッキ培地で細胞を再懸濁します。
    13. 2mLのプレーティング培地中の6ウェルプレートの1ウェルあたり2〜4 x 106 セルの間に播種する。
    14. ECMコーティングされた6ウェルプレートをDPBS(2 mL/ウェル)で洗浄します。
    15. 6ウェルプレートの1ウェルあたり2mLの細胞懸濁液をピペットで入れる。プレートを作業面に沿って左右に5〜6回ゆっくりと動かし、続いて前後に5〜6回動かして、プレート表面に細胞が均一に分布するようにします。
    16. プレートを37°Cおよび5%CO2の細胞培養インキュベーターに入れる。
    17. 解凍する細胞のすべてのバイアルに対して手順1.3.3〜1.3.16を繰り返します。
    18. プレーティングの翌日に3〜5 mLの維持培地(細胞株と密度に応じて)に変更し、その後1日おきに培地を交換します。細胞を3〜4日間培養してから、3D組織にキャストします。
  4. 間質細胞培養
    1. 30 mLのECM溶液をT175フラスコに塗布し、細胞播種前に37°Cで少なくとも1時間、ただし24時間以内にインキュベートします。
    2. 5 mLのストローマ細胞培地を15 mLのコニカルチューブに分注します。
    3. 間質細胞の凍結バイアルを37°Cの水浴中で2分間、または氷が溶けるまで解凍します。
    4. バイアルに70%エタノールをスプレーし、BSCに移します。
    5. p1000ピペットを使用して、1 mLのストローマ細胞培地をバイアル内の解凍した細胞にゆっくりと加えます。
    6. 細胞懸濁液をバイアルから円錐管内の残りの融解培地に移す。5 mLの血清学的ピペットを使用して細胞を混合します。ピペットを上下に3回行います。
    7. 血球計算盤とトリパンブルーを使用して細胞をカウントします。セルをスピンダウンしないでください。
    8. ECMコーティングされたT175フラスコを15mLのDPBSで洗浄します。
    9. 間質細胞を3-4 x 103 細胞/cm2の密度でフラスコに移します。フラスコの表面に沿ってフラスコを左右に5〜6回静かにスライドさせ、続いて前後に5〜6回スライドさせて、フラスコ表面上の細胞が均一に分布するようにします。
    10. 翌日、加温した間質細胞培地45 mLで培地を交換します。細胞を3〜4日間培養してから、3D組織にキャストします。

2.材料の準備

  1. フィブリノーゲン
    注意: フィブリノーゲンを再構成するときは、フィブリノーゲン粉末が層状になっている表面積の量を最大化するように注意してください。このプロトコルでは、使用される希釈剤の量は、使用される容器のサイズに最適化されました、すなわち、皿の底を覆うのにちょうど十分な希釈剤が使用されました。例えば、50 mLの遠沈管ではなく、100 mmのディッシュに10 mLのPBSの上に0.5 gのフィブリノーゲンを層状にします。希釈液の表面積量を最大化すると、フィブリノーゲンの再構成に必要な時間が短縮され、タンパク質の潜在的な凝集が減少します。
    1. 再構成
      1. 10 mLのPBSを100 mm細胞培養皿に移し、細胞培養インキュベーター内で37°Cに温めます。
      2. 温かいPBSの表面全体にフィブリノーゲン粉末0.5 gを重ね、フィブリノーゲンが完全に溶解するまで37°Cに保ちます。これには2時間以内で完了します。溶解粉末は穏やかに渦巻くことができますが、皿を激しく振らないでください。
    2. 滅菌ろ過
      1. 粉末が完全に溶解したら、溶液を100 μmのフィルターに通し、50 mLのコニカルチューブに集めて、ゲル化したフィブリノーゲンの塊を取り除きます。
      2. ろ過した溶液を、0.2 μmフィルターでキャップした10 mLシリンジに注ぎます。溶液をフィルターに通し、新しい50 mLコニカルチューブに集めます。10 mLの溶液すべてを滅菌するには、フィルターを複数回交換する必要がある場合があります。
      3. 300 mLの滅菌フィブリノーゲンを1.5 mLの微量遠心チューブに分注し、-20°Cで保存します。 必要に応じて、氷上または4°Cでアリコートを解凍します。凍結/解凍の繰り返しは避けてください。
  2. トロンビン
    1. 6 mLのPBSと4 mLのdiH2Oを1つのバイアルのトロンビン(1 KU)に直接加え、100 U / mLのトロンビンストック溶液を作ります。
    2. フィルターは0.2 μmのフィルターで滅菌し、アリコートし、トロンビンがガラスに吸着するため、1.5 mLのプラスチックマイクロ遠心チューブに-20°Cで保存します。凍結/解凍の繰り返しは避けてください。
  3. ポリ(エチレンイミン)溶液(PEI)
    注意:PEIは有毒です。製造元が指定した適切なPPEを使用してください。
    注:PEIは50%W / Vソリューションとして提供されます。粘度が高く、ピペットが難しいです。50%w/v溶液から直接ではなく、10%ストック溶液から0.1%溶液を作ります。
    1. 50 mLのコニカルチューブで5 mLの50%w / v PEI溶液を測定します。
    2. 20 mLのdiH2Oを加えて混合し、10%ストック溶液を生成します。この高濃度のストック溶液は、滅菌ろ過できません。
    3. 細胞培養用の0.1%溶液を作るには、5 mLの10%ストックを495 mLのdiH2Oに加えます。 500 mLのフィルターフラスコを使用して滅菌フィルターを使用し、RTで1週間以内保管します。
  4. グルタルアルデヒド
    注意: グルタルアルデヒドは有毒です。製造元が指定した適切なPPEを使用してください。
    1. グルタルアルデヒドは25%溶液として供給されます。0.01%溶液を作るには、99.6 mLのdiH2Oに40 μLを加え、滅菌フィルターで4°Cで1週間以内保存します。
  5. 事後準備
    1. 消耗組織鋳造キットを滅菌培養フード内に置きます。キャスティングキットには、蓋、24対の支柱を保持する支柱格子(24ウェルプレートのウェルごとに1対の支柱)、および24個の鋳造ウェルを含む特殊な24ウェルプレート底部が含まれています。各キャスティングウェルの底部には、セル/ヒドロゲル成分を保持し、ヒドロゲルが重合するときにチューブ状の組織に成形するためのトレンチが含まれています(図1B)。
    2. 24ウェルプレートのウェルに1.5 mL/ウェルの0.1%PEI溶液を満たし、ポストの各ペアの先端が水没するようにポストをプレートに配置します。10分間放置します。 PEIはポストに正電荷を沈着させ、組織キャスティング中にヒドロゲル中のタンパク質がポストにしっかりと付着するようにします。
    3. 2番目の24ウェルプレートのウェルに2 mL/ウェルの滅菌diH2Oを満たし、ポストを移します。1分間放置します。
    4. 3番目の24ウェルプレートで、ウェルに0.01%グルタルアルデヒド(GA)の1.5 mL/ウェルを満たし、ポストを移します。30分間放置します。 GAはPEIからポストへの正電荷を修正します。
    5. ポストをグルタルアルデヒドに入れたまま、diH 2 Oウェルを吸引し、2 mL /ウェルの滅菌diH 2 Oで洗浄し、吸引し、2 mL /ウェルの滅菌diH2Oを補充します。すすぎの代わりに、新鮮な24ウェルプレートを使用できます。
    6. 30分が経過したら、ポストを滅菌diH 2 Oの2mL /ウェルに移します。1分間放置します。
    7. diH 2 Oを吸引し、滅菌diH 2 Oをさらに2mL /ウェル加えます。5分間放置します。
    8. ポストを24ウェルプレートに移して乾燥させます(約15分)。
    9. 乾いたら、キャスティングキットを組み立て直します。蓋とプレートを一緒に密封するために端をパラフィルム化し、細胞播種の前に4°Cで最大72時間保存します。より長い保管時間は可能かもしれませんが、テストされていません。

3.ティッシュキャスティングプロトコル

  1. 鋳造プレートの準備
    1. ティッシュキャスティングキットを4°Cでプレチルします。
    2. 氷の入ったバケツをBSCに移します。氷上で、キャストするウェルあたり50 μLのトロンビン溶液(3 μLのトロンビンストック+ 47 μLのEMT培地)を準備します。
      注意: EMTメディアの詳細については、手順3.2.1を参照してください。
    3. 冷やしたキャスティングキットを冷蔵庫から取り出し、細胞培養フード内のコールドブロックまたは氷の上に置きます。キャスティングプレートを氷の上に平らに置き、ポスト格子をキャスティングプレートから新しい滅菌24ウェルプレートに移動します。
    4. 50μLのトロンビン溶液をキャスティングプレートの各予備冷却ウェルにピペットで入れる。
    5. キットを組み立て直し、ティッシュキャスティングに必要になるまで冷蔵庫に戻します。ウェルに加えてトロンビンから3時間以内に組織をキャストします。
  2. 細胞調製
    1. EMTベース培地、滅菌フィルターを準備し、氷上に置いておきます。
      注:細胞特異的キャスト培地にFBSが含まれている場合は、フィブリノーゲンと相互作用して早期重合を引き起こす可能性があるため、熱不活性化FBSを使用してください。
      1. 心臓EMT培地の準備:500 mLのRPMI培地、10 mLのB27、および2.5 gのアミノカプロン酸を追加します。(オプション)10 mM ROCK阻害剤を追加します(500 mL容量全体ではなく、組織の鋳造に使用されるEMT培地にのみ追加します)。
      2. 骨格EMT培地の調製:一次EMTにはF10培地50 mL、アミノカプロン酸(ACA)0.25 g、iPS細胞由来EMTにはACA0.1 gを加えます。
    2. 細胞培養グレードの解離試薬を37°Cに温めます。 等量のEMT培地を温めて解離試薬を希釈します。
      注:使用するプロテアーゼが完全に不活性化されていることが重要です。活性プロテアーゼは、3D組織形成および接着後を妨害します。
    3. 細胞(図1A)をPBSで洗浄します。6ウェルプレートには2 mL/ウェルを使用してください。100 mmディッシュ、T175フラスコ、T225フラスコには、それぞれ6 mL、15 mL、15 mLを使用します。
    4. 加温した細胞培養グレードの解離試薬を加えて細胞を持ち上げ、37°Cで5分間、または細胞が持ち上がるまでインキュベートします。心臓培養には、10倍解離試薬を使用してください。間質細胞および骨格筋芽細胞には、1倍の解離試薬を使用してください。6ウェルプレートには1 mL/ウェル、100 mmディッシュには3 mL、T175フラスコには8 mL、T225フラスコには10 mLを使用します。
    5. プレートの側面をタップして、2〜3分ごとに培養を確認します。
    6. 細胞が持ち上げられたら、50 mLのコニカルチューブに移し、P1000ピペットで粉砕して単一細胞懸濁液を確保します。
    7. プレートまたはフラスコを追加のEMT培地で洗浄して残りの細胞を収集し、それらを円錐管に加える。6ウェルプレートには1 mL/ウェルのEMT培地、100 mmディッシュには2 mL、T175フラスコには5 mL、T225フラスコには5 mLを使用します。
    8. 細胞を粉砕して、単一の細胞懸濁液を確実にする。
    9. EMT培地を加えて解離プロセスを終了し、細胞数のために細胞懸濁液のサンプルを採取します。6ウェルプレートには1 mL/ウェル、100 mmディッシュには3 mL、T175フラスコには8 mL、T225フラスコには10 mLを使用します。
    10. 細胞を200 x g で4分間回転させます。懸濁液を遠心分離しながら、血球計算盤とトリパンブルーを使用して細胞カウントを実行します。
    11. 上清を吸引し、細胞を5 mLのEMTベース培地に再懸濁して、残留解離試薬を除去します。
    12. 細胞を200 x g で4分間遠心分離します。上清を吸引し、適切な密度で細胞懸濁液を調製します。
    13. EMT培地に10%〜20%のECMタンパク質を添加することにより、3D骨格筋EMTの寿命と機能を高めます14,16。
    14. 種子幹細胞由来心筋細胞およびそれらの間質細胞は、組織構築物あたりそれぞれ5 x 10 5細胞および7.5 x 104 細胞である。骨格筋筋芽細胞を組織構築物あたり7.5 x 105 細胞で播種します。
    15. 心臓組織
      1. 上清を吸引し、間質細胞をEMT培地に1mLあたり2.5 x 106 細胞の密度で再懸濁し、氷上に置きます。EMTあたり30μLのこの懸濁液を使用してください。
      2. 上清を吸引し、CMSをEMT培地に1mLあたり8.3 x 106 細胞の密度で再懸濁し、氷上に置きます。EMTあたり60μLのこの懸濁液を使用してください。
    16. 骨格筋組織
      1. 上清を吸引し、骨格筋細胞をEMT培地に1mLあたり8.3 x 106 細胞の密度で再懸濁し、氷上に置きます。EMTあたり90μLのこの懸濁液を使用してください。
    17. 必要な組織数を構成するために必要な各細胞溶液の量を計算します(たとえば、EMTあたり60 μLの調製されたCMと30 μLの準備された間質細胞または90 μLの骨格筋細胞)。
    18. 計算された細胞量を15 mLのコニカルチューブにピペットで入れます。
    19. EMTあたり10 μLのフィブリノーゲンを細胞懸濁液に加え、氷上に保ちます。
    20. EMTあたりの総試薬と細胞量:各EMTに90μLの細胞、10μLのフィブリノーゲン、および50μLのトロンビン溶液があることを確認してください。
  3. ティッシュキャスティング
    1. 組織キャスティングキットを細胞培養フードに移し、蓋を取り外します(柔軟で剛性のあるポストを含むポスト格子はキャスティングプレートに残しておく必要があります。 図1B)。ポスト格子でキャスティングプレートを氷の上に平らに置きます。
    2. 細胞/フィブリノーゲン混合物を混合し、P200ピペットで100 μLを吸引します。
    3. 50 μLのトロンビン溶液で調製したウェルに100 μLの混合物を添加し、5回粉砕してよく混合します。ピペットを最初のストップを超えて押したり、気泡が発生しないように粉砕後にチップを取り外したりしないでください。
    4. この段階で、ポスト格子をキャスティングプレートから持ち上げる準備ができるまで(ステップ3.3.10)、格子の動きは、ポストへの組織の長期的な付着を損なう可能性があります。格子の動きを避けるために、片方の手の人差し指と親指を使用して、格子と鋳造ウェルプレートの両方を同時に持ちます。
    5. すべての組織がキャストされるまで、各組織に新しいP200チップで繰り返します。細胞が迅速に沈降するので、各組織をキャストする前に、15 mLのコニカルチューブで細胞懸濁液を混合します。
    6. 播種したキットをインキュベーターに慎重に移し、格子を動かさないようにします。播種後の格子の移動は、キャスティングウェルからの組織移送の成功率を低下させる可能性がある。細胞の種類に関係なく、37°Cで80分間インキュベートします。これによりヒドロゲルの重合が開始され、タンパク質がポストに付着するようになります。
    7. その間、心臓組織用のEMT培地2 mL/ウェルを含む新しい24ウェルプレートを準備します。所望により、10mM ROCK阻害剤をEMT培地に添加してもよい。プレートを37°Cでインキュベートし、培地を温めます。
    8. 一次骨格筋組織には5 g/Lアミノカプロン酸(0.2 mm滅菌ろ過)を含む2 mL/ウェルの増殖培地を、iPS細胞由来のEMTには2 g/L ACAを調製します。プレートを37°Cでインキュベートし、培地を温めます。
    9. インキュベート後、1 mLのEMT培地をキャスティングウェルの端に穏やかに加え、細胞の種類に関係なく、37°Cでさらに10分間インキュベートします。これにより、ヒドロゲルがキャスティングウェルの端から外れ、組織を簡単に移動できるようになります。
    10. 10分後、ポスト格子を注意深く持ち上げ、組織をキャスティングプレートから培地で準備した24ウェルプレートに移します(図1C)。組織を入れたプレートを37°Cの細胞培養インキュベーターに戻します。
  4. メンテナンス
    1. 24時間後、キャスト組織を2 mL/ウェルのEMT培地(ROCK阻害剤が含まれている場合は含まず)を入れた新しい24ウェルプレートに移し、37°Cでインキュベートします。 骨格筋細胞の場合、増殖培地を分化培地に切り替えて筋芽細胞の融合を促進します。
    2. 心臓組織を2〜3日ごとに2 mL /ウェルのEMT培地を含む新しいウェルに移します。
    3. 骨格筋組織を、5 g / Lアミノカプロン酸(0.2 mm滅菌ろ過)を含む2 mL /ウェル分化培地を使用して、2〜3日ごとに新しいウェルに移します。iPS細胞由来の組織には2 g/L ACAを使用してください。
    4. 培地の交換を支援するには、3D組織の損傷を避けるために、同じプレート内の培地を交換するのではなく、ポスト格子を新しい24ウェルプレートに移します。EMT培地を含む2枚目の24ウェルプレートを準備し、組織を新鮮な培地に移します。プレートを古い培地と一緒に活性培養物と一緒に保管し、次の培地交換に使用します。培養期間を通して、ポスト格子を2つのプレート間で前後に移します。または、培地交換ごとに新しいプレートを使用します。
    5. EMTの収縮は、ポストたわみの光学的追跡(図1D)または磁気センシングハードウェア13,14のいずれかを介して測定します。心臓組織は、培養3〜4日後に自発的に拍動し始めます。骨格筋組織は通常、培養7日後に電界刺激で収縮します。

結果

細胞は、2ポスト消耗プレート内の操作された筋肉組織にキャストされました(図1)。成功したEMTは均一に見え、マトリックスはポスト間で均等に分散されます(図2A)。マトリックスはまた、両方の支柱を包み込み、組織の同等のアンカーポイントを生成する必要があります。この方法では鋳造の失敗はまれであり、通常は目視検査で明らかです。EMT製造の失敗は、ポストからの組織の剥離(図2B)などの壊滅的な障害から、気泡やポストへの取り付けの緩みなどのより微妙な構造上の欠陥(図2C、D)までさまざまです。軽微な欠陥のある組織はまだ実行可能である可能性がありますが、これらの組織からのデータは、妥協のないEMTに匹敵することを確認するために注意深く調べる必要があります。たとえば、EMT内の気泡は、組織が時間の経過とともに圧縮されるにつれて絞り出され、収縮不全のない完全に機能する構造になります。ただし、気泡の位置が機能回復に影響を与える可能性があるため、これらの組織はケースバイケースで評価する必要があります。たとえば、ポストで発生する気泡は、組織の付着に影響を与える可能性があり、ポストへの長期的な付着を妨げる可能性があります。

細胞がヒドロゲル内のマトリックスをリモデリングすると、組織は最初の24時間以内に圧縮を開始します(図3)。圧縮は段階的なプロセスであり、通常、培養の最初の2〜4週間にわたって進行します。全体として、組織圧縮は技術的複製と生物学的複製の間で一貫しています(図4)。一部の細胞株は、組織が時間の経過とともに成熟するにつれて、他の細胞株よりもマトリックスを圧縮するのが正常です。コンストラクト内の筋原性細胞の割合は、EMT圧縮の速度と全体的な程度に影響を与えます。心臓と骨格筋の両方の細胞株の総筋原性含有量は、操作された組織間の変動を最小限に抑えるために80%を超える必要があります。これは、細胞株間で収縮力と動態を比較する場合に特に重要です。

キャスティング後の最初の数日以内に、心筋細胞は培養中に自発的に鼓動し始め、筋肉が収縮するたびに柔軟なポストをリズミカルに曲げます。骨格筋構築物は、分化開始後7日目までに電気刺激に応答して収縮する。フィールド刺激は、カスタム24ウェル電極蓋に取り付けられた外部刺激装置 を介して 骨格筋組織に適用されました。各ウェルの1対のカーボン電極で作製された蓋は、組織の24ウェルプレートの上にあり、各EMTを同時に刺激して筋肉収縮を誘発します。組織は、機能測定中に1Hzで10msのパルス持続時間の間、10V刺激を使用してペーシングされました。収縮組織は、融合した骨格筋芽細胞を示し、機能的なサルコメアと収縮機構を備えた筋管を形成します。ミオシン重鎖(MyHC)およびジストロフィンに対して陽性の骨格EMTは筋管膜に局在しており、断面免疫組織化学的分析で古典的なリング形状を明らかにしています(図5)。EMTが機能すると、磁気センシング機器で収縮性を毎日測定し、構造が時間の経過とともに発達および成熟するにつれて力と動力学を追跡できます。心臓組織と骨格筋組織はどちらも、3D培養で数週間から数か月間収縮性を維持し(図6)、幅広い収縮性研究に使用できます。

磁気検出アプローチは、ドキソルビシン(図7)やBMS-986094(図8)などの構造的心毒性物質、および筋収縮性に影響を与える他の薬物の急性および慢性の影響を同時に測定するために使用できます。収縮検出の光学的追跡法も使用できますが、測定は順次行う必要があるため、急性薬物効果を研究する場合は注意が必要です。3D培養における心臓および骨格EMTの寿命が延びることにより、これらの組織での長期的な薬物研究が可能になります。これにより、ユーザーは、ドキソルビシンで発生するように、時間の経過とともに心毒性効果を示す可能性のある化合物への反復投与、および継続的な長期曝露の影響を調査できます。ドキソルビシン(dox)は抗癌化学療法薬です17。患者に投与される薬物の量は、癌の種類、患者の年齢、患者の身長および体重、ならびに他の要因によって異なります。このため、広範囲の濃度と送達スケジュールにわたってdoxの効果をテストすることが重要です。ここでは、心臓EMTを3つの別々の濃度(0.1 μM、1 μM、および10 μM)のdoxで27日間にわたって治療しました(図7)。グループは、ボーラス治療または72時間ごとの培地交換を伴う連続投与のいずれかで各濃度のEMTを治療することによってさらに層別化されました。ドックスのボーラス治療を受けたウェルは、3つの別々の時点で薬物にさらされ、投与間の回復を可能にしました。ボーラスと継続的曝露の2つの最高用量は、研究全体を通して収縮力の発生の即時かつ長期の停止を示しました。中濃度および最低濃度は、投与方法に応じて、組織に異なる影響を及ぼした。薬物の最低濃度では、ボーラス群は対照群と差を示さなかった。しかし、収縮力は2週間の連続曝露後に減少した。薬物のミッドレンジ濃度は興味深い効果をもたらしました。連続投与は治療の最初の数日間で力を低下させ、実験を通して続いたが、ボーラス群は、薬物が3日後に洗い流されたときに収縮力が対照レベルに戻ることを示した。しかし、薬物の2番目のボーラスは力の完全な停止を引き起こし、その後回復せず(図7)、この濃度で繰り返し投与すると、この薬物で治療された患者に心毒性効果がある可能性があることを示しています。この研究の広い範囲は、時間と実験条件の両方で、長期間にわたって収縮性を維持し、化学物質曝露に反応し、単一の筋肉組織セット内での長期薬物研究を可能にするため、毒性スクリーニングにおける3D操作組織の有用性を強調しています。これにより、慢性曝露で心毒性作用を及ぼす可能性のある化合物を特定するだけでなく、投与の潜在的な心毒性タイミングの検出も容易になります。

人工ヒト筋肉組織におけるin vitro毒性試験は、臨床試験においてヒト患者の安全を確保するのに役立つ1つの方法です。BMS-986094は、C型肝炎の治療に使用されるヌクレオチドポリメラーゼ(NS5B)阻害剤です。ブリストル・マイヤーズ スクイブが患者18,19の予期せぬ心不全のいくつかの症例のために開発を中止したとき、この薬は第II相臨床開発中でした。ここでは、BMS-986094を心臓EMTに適用して、3Dエンジニアリングされた筋肉組織が薬物に対して心毒性反応を起こすかどうかをテストしました(図8)。3つの異なる濃度の薬物を適用し、組織を13日間にわたってモニターした。収縮力は、用量依存的に薬物の添加により低下した(図8A)。心毒性化合物への継続的な曝露により、拍動速度が遅くなり、最終的に期待どおりに停止したため、けいれん頻度も有意に影響されました(p < 0.05、図8B)。これらの結果は、3Dエンジニアリングされたヒトの筋肉組織を使用して、新薬の市場投入を容易にし、心毒性のために最終的に失敗する化合物にフラグを立てる方法を示しています。さらに、この技術は、臨床試験で患者に投与される前に危険な薬物を暴露することにより、命を救う可能性があります。

ヒトの収縮組織に対する急性および慢性的に適用された薬物の効果を測定する能力は、安全性と有効性について治療法を研究する際の重要な第一歩です。ただし、適用される薬物の濃度は生理学的に関連性があり、 in vitro 試験に適していることを知っておくことが重要です。骨格筋組織を使用して、完全用量反応曲線における2,3-ブタンジオンモノオキシム(BDM)のIC50 値を確立しました。.この薬は骨格筋ミオシン-II20のよく特徴付けられたATPase阻害剤です。BDMは、サルコメア21のアクチンフィラメントによるミオシンクロスブリッジ形成を防止することにより、筋肉収縮を阻害します。ここに示す結果は、薬物が塗布されたときの絶対力の用量依存的な減少と、薬物が洗い流されると収縮力の完全な回復を明らかにし、一過性の効果が組織内の細胞を殺すだけでなく、筋肉の収縮を防ぐことを示しています(図9A)。さらに、調べた7つの濃度にわたって完全な用量反応曲線を測定し、これらのヒト微小組織において3.2mMのIC50 を確立した(図9B)。

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図1:2ポストマンタレー消耗型24ウェルプレートでのEMTキャスティング 。 (A)筋原性細胞および間質細胞は、組織キャスティングの前に2D表面上で培養した。(B)細胞を2D表面から持ち上げ、細胞外マトリックスタンパク質と混合して、挿入図に示す個々のプレートキャスティングウェルでヒドロゲルを形成します。(C)すべてのウェルに操作された組織を含む24ウェルプレート。(D)弛緩および収縮した人工筋肉を示す代表的な組織、磁気ポストの変位を比較(緑色のバー)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図2:成功したEMTキャスティングと失敗したEMTキャスティング。 (A)理想的な人工筋肉組織は、組織全体に均一な細胞/マトリックス組成でポストの周りに均一に圧縮された24時間後のキャストです。(B)可撓性ポストからのヒドロゲルの剥離を示す失敗したEMT。 (C)組織全体に気泡を含むEMT。(D)両方の支柱の周りの不均等な組織沈着。組織は片側の柔軟な支柱に緩く固定されています。スケールバーは1mmです。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図3:時間の経過に伴う人工筋肉組織の圧縮。 (A)鋳造後1日目に示すEMT構築物。組織は分化培地に移され、細胞融合およびヒドロゲル圧縮の0日目に開始される。(B-E)7日目から21日目までの同じEMTは、時間の経過とともに2つのポスト間の全長がわずかに短く、EMTの中央セクションで測定すると幅が狭くなることを示しています。スケールバーは1mmです。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図4:時間の経過に伴うEMT直径。 組織の4枚のプレートを21日間にわたって追跡し、圧縮全体のEMT直径を比較しました。各組織は、光学顕微鏡を用いて毎週中央切片を通して測定した。時点は、プレート間で一貫したEMTサイズを示します。マトリックスのリモデリングが安定するため、21日目に最大圧縮に達します。この表は、組織の各プレート内の圧縮の標準偏差(全体に対する%)と、すべてのプレートの平均偏差を示しています。色付きのバーは個々のプレートです。エラーバーは、プレート内のEMTのSDです。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図5:操作された骨格筋組織の免疫組織化学。 EMTは培養10日目に固定され、パラフィンに包埋されました。薄い断面(7 μm)を、イメージング前にミオシン重鎖およびジストロフィンに対する抗体で染色しました。緑=MyHC、赤=ジストロフィン、青=DAPI。対物レンズ倍率は40倍です。スケールバーは50μmです。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図6:操作された筋肉組織の収縮力の経時変化 。 (A)培養7日目から63日目までの心臓EMTから測定された平均絶対けいれん力。グループあたりn = 3。(B)培養7日目から53日目までの初代細胞株に由来する骨格EMTの平均絶対けいれん力。n = 3です。エラーバーは両方のグラフのSDです。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図7:人工筋肉組織における急性および慢性のドキソルビシン治療。 0.1 μM、1 μM、および10 μMの3つの別々の用量濃度のdoxが、ボーラスで送達されるか、27日間にわたって操作された筋肉組織に継続的に投与されました。薬物のボーラス用量は、X軸の緑色の矢印で示されている、0、12、および24日目の培地変更時に追加されました。薬物は、X軸上の黒と緑の矢印で示され、連続投与のために培地が変化するたびに培地に添加された。ベースライン値(薬物前治療)からの力の変化率はY軸にあり、治療の日数単位の時間はX軸にあります。明るいオレンジ = DMSO 連続制御、濃いオレンジ = DMSO ボーラス制御、ライトグリーン = 0.1 μM ドックス連続、ダークグリーン = 0.1 μM ドックスボーラス、ライトブルー = 1 μM ドックス連続、ダークブルー = 1 μM ドックスボーラス、ライトイエロー = 10 μM ドックス連続、濃い黄色 = 10 μM ドックスボーラス。エラーバーはSDです。条件あたりn = 3。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図8:人工筋肉組織におけるBMS-986094による慢性治療。 EMTは、0.4 μM(緑)、2 μM(濃い青)、および10 μM(水色)のBMS-986094で13日間処理されました。(A)収縮性けいれん力(Y軸)は、最初の2日間ですべての薬物濃度で減少しますが、DMSOの対照組織は時間の経過とともに強くなり続けます(X軸)。(B)心拍速度、またはけいれん頻度は、グラフAに示す収縮力の停止と並行して用量依存的な方法で停止します。 DMSO(灰色)の対照組織は、実験全体を通して規則的な拍動率を維持します。エラーバーはSDです。条件あたりn = 3。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図9:人工骨格筋組織におけるBDMに対する用量反応 。 (A)初代細胞由来EMTが3D培養の16日目に2,3-ブタンジオンモノオキシム(BDM)にさらされると、絶対けいれん力は用量依存的に減少します。絶対けいれん力は、薬物が洗い流されるとベースライン値に近い値に戻ります。(B)ベースライン値に正規化された絶対けいれん力は、BDMに曝露されると用量依存的に減少し、完全な用量反応曲線とIC50 値が得られます。n = 4用量あたり。エラーバーはSDです。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

この研究では、24ウェル消耗型キャスティングキット内で3Dエンジニアリングされた心臓および骨格筋組織を生成する方法について説明します。これらの方法に従うことにより、その後の薬物スクリーニングのための鋳造失敗なしに、24の組織の完全な配列を一貫して達成することが可能です。このような結果を達成するための重要な考慮事項は、キャスティング中にすべてのステップを氷上で実行してヒドロゲルの早期重合を防止すること、組織キャスティング前の細胞解離試薬の除去、各組織の細胞とヒドロゲル懸濁液の徹底的な混合、組織間のピペットチップの交換、および熱不活性化FBSの使用(使用する場合)です。また、キャスティングが開始されるとポスト格子が移動せず、ヒドロゲルが形成されると穏やかに移送されるようにすることが重要です。

主な変更には、心臓と骨格のEMTを達成するための異なる細胞型の使用、および細胞の成熟と組織の安定性を促進するためのさまざまな濃度の基底膜タンパク質を含むヒドロゲルのドーピングが含まれます。このようなドーピングの有益な効果はケースバイケースでテストする必要がありますが、特定の状況下で機能的転帰と組織寿命を改善することが示されています14、16、22。また、記載されている細胞密度はガイドであり、さまざまな細胞株に合わせて最適化する必要があるかもしれないことも注目に値します。代替のヒドロゲル組成物はまた、達成されたEMTの構造的および機能的特性を改変する手段として考えることもできる23、24、25。天然の筋肉微小環境には、血管新生、神経支配、および筋細胞を形態および機能的に支持するためのマトリックス沈着を促進するための支持細胞タイプも含まれる26,27。ここで説明するシステムは、現在、線維芽細胞を3D心臓組織に組み込んでいるが、追加の細胞型は、in vitroで治療化合物の安全性および有効性を研究するためのより生理学的関連モデルを作成する可能性がある。以前は、さまざまな支持細胞タイプが3Dエンジニアリング組織にうまく統合されており、磁気センシング収縮性プラットフォーム28,29,30を使用した将来の研究のためのエキサイティングなテンプレートを提示しています。

このプロトコルのトラブルシューティングは、鋳造プロセス中の信頼性の低い組織または一貫性のない組織の形成に集中しています。ヒドロゲルはキャストされるため、混合中の細胞の均一な分布を促進しながら、ヒドロゲルに気泡が形成されないように注意する必要があります。理想的な細胞密度、細胞比率、およびマトリックス組成を特定するために、新しい細胞タイプごとに最適化実験が必要になる可能性があります。

この技術の主な制限は、24個のEMTのフルプレートを確立するために必要なセルの数が多いことです。ここに示されているデータでは、プレートあたり1500万個の心筋細胞と1800万個の骨格筋芽細胞を使用しました。特定の研究者は、このような大きな細胞物質のプールにアクセスできない場合があり、このプラットフォームを最大限に活用する能力を阻害する可能性があります。エンドユーザーが磁気センシングハードウェアにアクセスできない場合、ポストたわみの測定を光学的に実行する必要があるため、スループットが大幅に低下し、複数のウェルにわたる筋肉収縮の同時記録が妨げられます。しかし、Mantarrayハードウェアはこれらの制限を克服し、複数の構造にわたって同時にEMT収縮の連続的かつ非侵襲的な分析が可能な最初の商用システムを提供します。

24の井戸にわたる磁気センシングは、EMT機能発達の縦断的研究をリアルタイムで容易にし、化学的、環境的、または遺伝的操作に対する急性反応の正確な測定を可能にします。磁気センシングには、複数の組織にわたる同時測定などのいくつかの利点があり、複雑なデータ分析は必要ありませんが、光学検出法はカルシウムフラックスや電圧マッピングなどの生理学的指標の同時測定を可能にします。ただし、結果のセクションに示されているようなデータセットは、このテクノロジーが医薬品開発分野で持つ幅広いアプリケーションを示しています。人工筋肉の収縮出力を直接評価する手段を提供するアッセイは市場に出回っていないため、これらの方法は前臨床開発パイプラインに革命を起こす可能性を秘めています。

開示事項

すべての著者は、Mantarrayハードウェアと関連ソフトウェアを商品化する会社であるCuri Bio Inc.の従業員および株主です。

謝辞

この研究は、食品医薬品局からの資金提供(U01 FD006676-01が保健環境科学研究所に授与)と国立衛生研究所からの資金提供(HL151094からガイセ博士に授与)によって部分的に支援されました。この原稿の作成にご協力いただいたアレック・S・T・スミス博士に感謝します。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
100 & マイクロ;mセルストレーナー CELLTREAT229485
100 mm 細胞培養ディッシュThermoFisher150466
50 mL Steriflip フィルターMilliporeSigma 
500 mLフィルターフラスコMilliporeSigma 
6-アミノカプロン酸SigmaA2504
B27Gibco17504044
Cardiosight メンテナンス培地NEXELCM-002A
Cardiosight プレーティング培地NEXELCM-020A
C-Pace EM刺激装置 アイオノプティクス 
Curi Bio Muscle Differentiation Media KitPrimary - DIFF
Curi Bio Muscle Maintenance Media KitCuri BioPrimary - MAINT
DAPIInvitrogenD1306
DMEM, high glucose, GlutaMAXGibco10566-016
DnaseSigma11284932001
DPBSGibco14190-250
ジストロフィン抗体 Abcamab154168
ウシ胎児血清 (FBS)Thermo Scientific10082147熱不活化
フィブリノーゲン (ウシ)SigmaE8630
グルタルアルデヒドSigma354400
Ham's F10Gibco11550043
血球計算計 シグマ 
HS-27A 線維芽細胞ATCCCRL-2496
ヒト骨格筋筋芽細胞 ロンザ CC-2580
ルアーロック 0.2 & マイクロ;m シリンジフィルターコーニング431219
ルアーロック 10 mL シリンジBH サプライBH10LL
マンタレー インスツルメントキュリ バイオMANTA-24-B1システム
マンタレー プレートキットキュリ バイオMA-24-SKM-55キットパック
マンタレー刺激蓋 Curi BioEM
Matrigel (ECM)Corning356231
Nexel Cardiosight-S, CardiomyocytesNEXELC-002
光学顕微鏡Nikon Ti2EMEA54000
Pan Myosin Heavy Chain 抗体 DSHBMF-20
ポリ(エチレンイミン)SigmaP3143
ROCK 阻害剤StemCell TechnologiesY-27632
RPMI Gibco11875-093
骨格筋成長培地 (SkGM-2)ロンザCC-3245
標準 24 ウェルプレートGreinerM8812 他のメーカーのプレートは収まりません
標準 6 ウェルプレートThermoFisher140675
Stromal medium (DMEM + 20% FBS)
T175 フィルターフラスコThermoFisher159910
T225 フィルターフラスコThermoFisher159934
ThrombinSigmaT4648
トリパンブルー溶液、0.4%ThermoFisher15250061
TrypLE Select Enzyme (10x)Thermo ScientificA1217702
TrypLE Select Enzyme (1x)Thermo Scientific12563011
SCGP00525S2GVU05REEMZ359629

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