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方法論記事

ライム病スピロヘータ・ボレリア・ブルグドルフェリのファージ媒介遺伝子操作

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DOI:

10.3791/64408

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2022年9月28日

1Department of Biomedical Sciences, Quinnipiac University

この記事について

サマリー

細菌細胞間でDNAを移動するバクテリオファージの能力は、それらを細菌宿主の遺伝子操作のための効果的なツールにします。ここで紹介するのは、 ボレリア・ブルグドルフェリのバクテリオファージであるφBB-1を誘導、回収、および使用して、ライム病スピロヘータの異なる株間で異種DNAを形質導入するための方法論です。

要約

スピロヘータ ボレリア・ブルグドルフェリ への外来DNAの導入は、エレクトロポレーションを用いた形質転換によってほぼ独占的に達成されてきた。このプロセスは、他のよりよく特徴付けられたグラム陰性菌と比較して 、ライム病スピロヘータの効率が著しく低い。形質転換の成功率は、特定のバックグラウンドからの高品質のDNAが濃縮されていることに大きく依存し、株ごとに大きなばらつきがあります。外来DNA(すなわち、シャトルベクター、蛍光レポーター、および抗生物質耐性マーカー)を B.ブルグドルフェリ に導入するための代替手段は、ライム病スピロヘータの遺伝子操作のための有用なツールの兵器庫への重要な追加となる可能性があります。バクテリオファージは、形質導入と呼ばれるプロセスにおける細菌間のDNAの移動の自然なメカニズムとしてよく認識されています。本研究では、ユビキタスボレリアファージφBB-1を用いて、同じ遺伝的背景と異なる遺伝的背景の両方を持つ B.ブルグドルフェリ 細胞間でDNAを形質導入する方法を開発しました。形質導入されたDNAには、ボレリアDNAと異種DNAの両方が小さなシャトルベクターの形で含まれています。この実証は、ライム病スピロヘータの遺伝子操作のためのエレクトロポレーションの補完としてのファージ媒介形質導入の潜在的な使用を示唆している。本報告では、 B. burgdorferi由来のファージφBB-1の誘導および精製方法、形質導入アッセイにおけるこのファージの使用、および潜在的な形質導入物質の選択およびスクリーニングについて述べる。

概要

スピロヘータ細菌ボレリア・ブルグドルフェリの遺伝子操作のためのツールの開発は、ライム病の性質の理解に計り知れない価値を追加しました1,2,3,4。B. burgdorferiは、小さな線状染色体と直鎖状および環状プラスミドの両方からなる異常に複雑なゲノムを持っています5,6。自発的なプラスミド喪失、遺伝子内再配列(同じ生物内のあるプラスミドから別のプラスミドへの遺伝子の移動)、および遺伝子の水平移動(HGT、2つの生物間のDNAの移動)は、B. burgdorferiの間で目まぐるしい量の遺伝的不均一性を引き起こしました(例として、Schutzerら7を参照)。結果として生じる遺伝子型(または「株」)はすべて同じ種のメンバーですが、異なる哺乳類宿主に伝達し感染する能力に影響を与える遺伝的差異があります8、9、10、11。このレポートでは、「株」という用語は、特定の自然由来の遺伝的背景を持つB.ブルグドルフェリを指すために使用されます。用語「クローン」は、特定の目的のために、または実験的操作の結果として遺伝子改変された株を指すために使用されるであろう。

B. burgdorferiで使用できる分子ツールボックスには、選択マーカー、遺伝子レポーター、シャトルベクター、トランスポゾン突然変異誘発、誘導性プロモーター、および逆選択マーカーが含まれます(レビューについては、Drektrah and Samuels12を参照)。これらの方法論を効果的に使用するには、目的のB.ブルグドルフェリ株に異種(外来)DNAを人工的に導入する必要があります。B. burgdorferiでは、異種DNAの導入は、電気パルスを利用して細菌膜を培地に導入されたDNAの小片に対して一過性に透過させる方法であるエレクトロポレーションによってほぼ独占的に達成される1。大部分の細胞(≥99.5%と推定)はパルスによって殺されますが、残りの細胞は異種DNAを保持する頻度が高い13。細菌にDNAを導入する最も効率的な方法の一つと考えられていますが、B. burgdorferiへのエレクトロポレーションの頻度は非常に低いです(5細胞に1つの形質転換体×104から5×106細胞の範囲)13。より高い頻度の変換を達成するための障壁は、技術的および生物学的の両方であるように思われます。B. burgdorferiのエレクトロポレーションを成功させるための技術的障壁には、必要なDNAの量(>10μg)と、エレクトロコンピテントセルを調製する際のスピロヘータが正確に正しい成長段階(中ログ、2×10 7細胞・mL−1と7 × 107細胞・mL−1の間)の両方が含まれます12,13。ただし、これらの技術的障壁は、生物学的障壁よりも克服しやすい場合があります。

ライム病の研究者は、B.ブルグドルフェリクローンが遺伝的に操作される能力に関して2つの大きなカテゴリーに分けることができることを認識しています13,14。高継代、実験室適応分離株は、しばしば容易に形質転換されるが、通常は感染力に必須のプラスミドを失い、生理学的に異常な挙動を示し、哺乳類宿主に感染することも、ダニベクター内で持続することもできない12,13。これらのクローンは、実験室内でスピロヘータの分子生物学的に解剖するのに有用でしたが、風土病サイクルの生物学的文脈の中でスピロヘータを研究するためにはほとんど価値がありません。一方、低継代感染分離株は、感染状態を反映した生理学的に振る舞い、感染サイクルを完了することができますが、通常は異種DNAの導入に難解であるため、研究のために操作することは困難です12,13。低継代分離株の形質転換の難しさは、少なくとも2つの異なる要因に関連している:(i)低継代分離株は、特にエレクトロポレーションに必要な高密度条件下で、しばしば緊密に凝集し、したがって、多くの細胞が電荷の完全な適用または培地中のDNAへのアクセスのいずれかを遮断する13,15;(ii)B.ブルグドルフェリは、高継代分離株で失われる可能性のある少なくとも2つの異なるプラスミド媒介制限修飾(R-M)系をコードする14,16。R-Mシステムは、細菌が外来DNAを認識して排除できるように進化しました17。実際、B. burgdorferiのいくつかの研究では、DNAのソースが大腸菌ではなくB. burgdorferiである場合に形質転換効率が向上することが示されています13,16。残念ながら、エレクトロポレーションに必要な高濃度のDNAをB. burgdorferiから取得することは、費用と時間のかかる見通しです。エレクトロポレーションおよび低継代分離株を選択する際の別の潜在的な懸念は、このプロセスが、重要な病原性関連プラスミドlp2514,18,19を失った形質転換体に有利に働くように見えることです。したがって、エレクトロポレーションを介して低継代B.ブルグドルフェリ単離株を遺伝的に操作する行為そのものが、風土病サイクル20内の生物学的に関連する分析に適さないクローンを選択し得る。これらの問題を考えると、異種DNAを高継代B.ブルグドルフェリクローンに電気変換し、エレクトロポレーション以外の方法で低継代感染分離株に移すことができるシステムは、ライム病スピロヘータで使用できる分子ツールのコレクションの増加に歓迎すべき追加となる可能性があります。

形質転換(裸のDNAの取り込み)に加えて、細菌が異種DNAを定期的に取り込むメカニズムは他に2つあります:互いに直接物理的に接触している細菌間のDNAの交換であるコンジュゲーションと、バクテリオファージによって媒介されるDNAの交換である形質導入21。実際、HGTを媒介するバクテリオファージの能力は、多数の細菌系内の分子プロセスを解剖するための実験ツールとして使用されてきた22、23、24。B. burgdorferiは裸のDNAの取り込みに自然有能ではなく、B. burgdorferiが接合を成功させるために必要な装置をコードしているという証拠はほとんどありません。 しかし、以前の報告では、B. burgdorferi25,26,27,28の温帯バクテリオファージであるφBB-1の同定と予備的な特性評価が記載されている。φBB-1は、B. burgdorferi25内に見られる30 kbプラスミドのファミリーをパッケージ化します。このファミリーのメンバーはCP32に指定されています。Stevensonらは、B. burgdorferi株間のHGTへの参加におけるφBB-1の役割と一致して、他の点では異なるcp32を持つ2つの株で同一のcp32が見つかったことを報告し、おそらく形質導入を介して、これら2つの株間でこのcp32が最近共有されていることを示唆しています29。また、他の点では比較的安定したゲノム30,31,32,33のcp32の間でHGTを介した有意な組換えの証拠もあります。最後に、φBB-1がcp32sおよび異種シャトルベクターDNAの両方を、同じ株の細胞間および2つの異なる株の細胞間で形質導入する能力は、以前に実証されている27,28。これらの知見から、φBB-1はB. burgdorferiの分子生物学解剖のための別のツールとして提案されている。

このレポートの目的は、 B. burgdorferiからファージφBB-1を誘導および精製する方法を詳述し、 B. burgdorferi クローン間の形質導入アッセイを実行し、潜在的な形質導入物質を選択およびスクリーニングするためのプロトコルを提供することです。

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プロトコル

組換えDNAおよびBSL-2生物を用いたすべての実験は、クイニピアック大学機関バイオセーフティ委員会によってレビューおよび承認されました。

1. φBB-1生産のための B.ブルグドルフェリ 培養液の調製

  1. 6.6%熱不活化正常ウサギ血清(BSK)を添加したバーバー・ストーナー・ケリー培地を調製します15。1 Lの1x BSKに対して、表1に記載されている成分を900 mLの水に混ぜ合わせ、 1 N水酸化ナトリウムを使用してpHを7.6に調整し、4°Cで2〜4時間ゆっくりと混合します。混合が完了したら、必要に応じてpHを確認して7.6に再調整し、水で容量を1 Lに増やします。0.22 μMフィルター( 材料表を参照)を通過させて培地を滅菌し、新鮮なものを使用するか、4°Cで≤2か月間保管します。
  2. 形質導入プロトコルを開始する3〜5日前に、150 μLの適切なB.ブルグドルフェリクローンを、しっかりとキャップされた滅菌コニカル遠心チューブ内の15 mLの1x BSKに接種します(材料の表を参照)。B. burgdorferiクローン内の異種DNAの選択と維持のために、適切な濃度の抗生物質または抗生物質の組み合わせを培地に補給します(表2)。
    注: B.ブルグドルフェリ はバイオセーフティレベル2の生物です。この生物を扱う間、すべての適切な予防策を講じてください。 B. burgdorferi の生きた培養物を使って、認定され適切に消毒されたクラスIIバイオセーフティキャビネットですべての作業を行います。 B. burgdorferi と生物自体に接触するすべての物質は、CDCガイドライン34に基づいて適切に廃棄してください。
  3. 培養物が≥5 ×10 7 スピロヘータ·mL−1の密度に達するまで、振とうせずに33°Cで培養物をインキュベートします。

2. B. burgdorferi 培養物の密度を決定する (Samuels から改変)15

  1. 5 × 106 細胞・mL−1を超えると予想される密度については、分光法を使用して細胞密度を決定します。
    1. 1 mLの培養液を1.7 mLの微量遠心チューブに移し、8,000 x g で室温で5分間遠心分離します。
    2. 上清を廃棄し、細胞ペレットを1 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS;137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na 2 HPO 4、および1.8 mM KH2PO4)に再懸濁します。細胞懸濁液全体をセミミクロUV透明キュベットに移します。
    3. 波長600nm(A600)で再懸濁したサンプルの光学密度を決定する。分光光度計( 材料表を参照)をPBSに対してゼロにします。
    4. 元の培養液中のスピロヘータ·mL−1 の濃度を計算するには、A600 での光学密度に1.4×10を掛けます9。
  2. 密度が5×104 細胞・mL−1 から5×106 細胞・mL−1の間であると予想される密度については、ペトロフ・ハウザー計数チャンバー( 材料表を参照)を使用して細胞密度を決定し、スピロヘータの数を直接カウントします。この方法は、適切な希釈後の高密度にも使用できます。
    注:生きたスピロヘータの視覚化には、暗視野コンデンサーで改造された顕微鏡が必要です。
    1. 10 μLのサンプルを計数チャンバーに塗布し、適切なカバーガラスで覆います。密度が1 × 107を超える場合は、サンプルをPBSで希釈して、フィールドあたり50〜100個のスピロヘータを生成します。
    2. 暗視野顕微鏡を使用して200x〜400xの倍率で細胞をカウントします。すべての平面で16個の小さな正方形の25グループのフィールド全体を数えます。
    3. カウント数に希釈係数(存在する場合)を掛け、5 × 104 を掛けて、元の培養の細胞·mL−1 を生成します。

3. B.ブルグドルフェリ ファージφBB-1の誘導

注:オートクレーブですべてのガラス製品とプラスチック製品を滅菌します。オートクレーブまたは0.22 μMフィルターによるろ過により、すべての溶液を滅菌します。以下の手順は15 mLの容量に基づいて示されていますが、この方法は、実験の個々のニーズに応じて、より小さな容量またはより大きな容量に拡張可能です。

  1. ファージが産生される B. burgdorferi 培養物(ドナー)については、ステップ2のいずれかの方法で計算された濃度を使用して、4 mLの2×108 スピロヘータ·mL−1を生成するために必要なスターター培養の量を決定します。これにより、回復段階で15 mL中に5 ×10 7 スピロヘータ·mL−1 の最終濃度が得られます(以下のステップ3.6)。
  2. ステップ3.1で計算した培養量を6,000 x g で10分間遠心分離します。上清をデカントし、ペレットを4 mLの新鮮なBSKに再懸濁します。 最小限のヘッドスペースでサンプルを保持するために、利用可能な最小の滅菌チューブにサンプルを移します。
  3. ファージ産生を誘導するために、4mLの培養容量に基づく推奨濃度(表3)に適量の誘導剤を添加します。チューブにしっかりと蓋をして、よく混ぜます。
  4. サンプルを33°Cで2〜4時間インキュベートします。
  5. インキュベーション後、サンプルを15 mL遠沈管に移します。サンプルを6,000 x g で10分間遠心分離します。上清をデカントします。
  6. 細胞ペレットを15 mLの1x BSKに再懸濁します。
    注:ファージの誘導後、形質導入アッセイを進めるには2つの異なる方法があります。これらのメソッドは、 図 1 と手順 4 と手順 6 に示されています。

4.ドナーを誘導剤に曝露した後の共培養中の形質導入(図1A)

注:このプロトコルは、ファージ産生株(ドナー)が特定の抗生物質に対して耐性を持ち、形質導入される株(レシピエント)が別の抗生物質に対して耐性を持っている場合にのみ使用できます。

  1. 上記のステップ1のドナー株について説明したように、形質導入アッセイにおいてレシピエントとして使用する B.ブルグドルフェリ 培養物を調製する。ステップ2のように決定された密度に基づいて、1×10個の7 スピロヘータ・mL−1を15mL生成するのに必要な容量を計算します。
  2. ステップ4.1で計算した培養量を6,000 x g で10分間遠心分離します。上清をデカントします。
  3. ステップ3.6(ファージドナーを再懸濁)から1mLの培養物にペレットを再懸濁する。再中断されたレシピエントをドナーと一緒にカルチャに追加します。抗生物質を補給しないでください。両方の培養物を含む総容量は15mLです。
  4. 33°Cで72〜96時間インキュベートします。
  5. ステップ7に記載されるように共培養後に固相プレーティングによる形質導入体の選択を行う。

5.形質導入アッセイで使用するファージを回収するためのポリエチレングリコール(PEG)沈殿

注:このプロトコルは、ファージ産生株(ドナー)が特定の抗生物質に対して耐性を持ち、形質導入される株(レシピエント)が抗生物質耐性を持たないか、別の抗生物質に対して耐性がある場合に使用できます。

  1. ステップ3.6の培養物に 、表2に示す濃度の適切な抗生物質を補充します。サンプルを33°Cで72〜96時間インキュベートします。
  2. PEG沈殿のための溶液を調製する。
    1. 500 mLの5 M NaClを調製します。オートクレーブ滅菌し、冷ましてからご使用ください。室温で保管してください。
    2. 200 gのPEG8000を400 mLの水に溶解して、500 mLの40%PEGを調製します。溶液がよく混ざるまで攪拌しながら穏やかに加熱する。水で容量を500 mLまで上げます。PEG8000を完全に溶解して溶液を滅菌するには、溶液をオートクレーブして冷却してから使用してください。室温で保管してください。
    3. 100 mLの懸濁培地(SM;100 mM NaCl、10 mM MgSO4、および50 mM Tris-HCl [pH 7.5])を調製します。オートクレーブ滅菌で滅菌します。4°Cで保存してください。
  3. ド ナーB.ブルグドルフェリ クローンからのファージのPEG沈殿(ステップ3.6から)の場合、72〜96時間のインキュベーション後、サンプルを8,000 x g で4°Cで20分間遠心分離します。
  4. 上清を清潔な50mLコニカルチューブにデカントします。セルペレットを廃棄します。5 M NaClを最終濃度1 Mまで加えます。室温で1時間穏やかに揺ります。
  5. サンプルを8,000 x g で4°Cで10分間遠心分離します。 上清を清潔な50mLコニカルチューブにデカントします。ペレットは小さいか存在しない可能性があります。40%PEG8000溶液を最終濃度10%になるまで上清に加える。よく混ぜて、氷の上に1時間以上一晩置きます。
    注:より長い時間は、ファージ回収の有意な増加と相関していないようです。
  6. サンプルを8,000 x g で4°Cで20分間遠心分離します。 上清を廃棄し、ファージ粒子を含むペレットを失うことなく、できるだけ多くの余分な液体を取り除きます。
  7. ペレットを最小量のSMに再懸濁し、SMを使用してボトルの側面を洗い流し、潜在的なファージ粒子を収集します。推奨される比率は、元の上清10 mLあたり400 μLのSMですが、ペレットのサイズによっては、完全な再懸濁に多かれ少なかれSMが必要になる場合があります。
  8. 回収したファージサンプルを、再懸濁液の量に基づいて等量のクロロホルムで処理します。サンプルをよく混合し、8,000 x g で10分間遠心分離します。水性(最上)層をきれいなチューブに移し、厚い界面層を避けます。
    注:φBB-1は非エンベロープバクテリオファージであり、クロロホルム処理の影響を受けません25。このステップは、膜結合構造(すなわち、細胞またはブレブ)をさらに破壊し、潜在的な細胞汚染物質を殺すために行われます。クロロホルムは揮発性有機物であり、換気の良いドラフトでのみ使用してください。クロロホルムを含む物質は有機廃棄物として廃棄してください。
  9. 最初のクロロホルム処理後に回収された容量を決定し、その容量の10%に等しい量のクロロホルムでサンプルを再度処理します。よく混合し、8,000 x g で10分間遠心分離します。水性(最上)層を除去し、界面または有機層のいずれかを避けるように注意する。水層をきれいなチューブに移します。
  10. ファージを直ちに使用するか(ステップ6に記載)、4°Cで保存してください。
    注:φBB-1ファージサンプルの凍結は推奨されません。φBB-1の4°Cでの安定性は厳密には調べられていませんが、回収後最大1ヶ月間4°Cで保存されたサンプルは、形質導入アッセイで成功裏に使用されています。

6. φBB-1のPEG沈殿後の形質導入アッセイ(図1B)

  1. 上記のステップ1のドナー株について説明したように、形質導入アッセイでレシピエントとして使用する B.ブルグドルフェリ 培養物を調製する。ステップ2のように決定された密度に基づいて、10個のスピロ ヘータ×mL−1を15mL生成するために必要なレシピエントの培養量を計算します。
  2. ステップ6.1で計算した培養量を6,000 x g で10分間遠心分離します。上清をデカントし、ペレットを14.5 mLの新鮮なBSKに再懸濁します。
  3. ≤500 μLのPEG沈殿ファージサンプル(ステップ5から)をレシピエントクローンの培養液に加えます。よく混合し、33°Cで72〜96時間インキュベートします。
    注:PEG沈殿中に回収されるファージの量は、いくつかの要因に応じて変動する可能性があります。しかしながら、誘導 されたB.ブルグドルフェリ 株CA−11.2Aの15mL培養物から、500μLは典型的には50〜1,000個の生菌ファージ28を含有する。ファージ回収量≥500μLは、おそらくSMとBSKの比率の増加により、 B.ブルグドルフェリ の増殖に悪影響を及ぼします。
  4. ステップ7に記載されるようにPEG沈降ファージと混合した後に固相プレーティングによって形質導入体の選択を行う。

7. 形質導入剤の選定

注:潜在的な形質導入剤の固相メッキは、Samuels15によって最初に記述されたプロトコルの単層変更を使用して実行されます。 B. burgdorferi コロニーは寒天内で増殖するため、固相プレーティングによる形質導入剤の選択には、プレートを注ぐ間にサンプルを培地に添加する必要があります。96ウェルプレートにおける希釈法を用いる形質転換体の選択のための代替方法も、以前に記載されている35。この技術は形質導入体の選択にも有効かもしれないが、この目的のためにはまだ試みられていない。

  1. 形質導入アッセイおよびプレーティングするコントロールからのサンプル数に基づいて、形質導入剤の選択に必要なプレート数を決定します。
    注:通常、サンプルごとに2つのプレートが注がれ、1つは培養量の約10%に相当し、もう1つは残りの培養液を含みます。さらに、ドナーおよびレシピエントとして使用されるファージ調製物および/または親クローンが、選択中に使用された抗生物質の存在下で増殖しないことを個別にテストするためのネガティブコントロールとして機能するポアプレート。少なくとも2つの余分なプレート用のメッキ材料を準備することもお勧めします。たとえば、めっきするサンプルとコントロールの数が8の場合、10枚のプレートに十分なめっきミックスを準備します。
  2. 以下に説明するようにめっき用の溶液を調製する。
    注:各プレートは30 mLで、メッキ用の1.5x BSK20 mLと2.1%アガロース(2:1の比率)10 mLで構成されます。これにより、最終濃度が1x BSKおよび0.7%アガロースのプレートが得られます。例えば、10枚のプレートの場合、200 mLの1.5x BSKと100 mLの2.1%アガロースからなる300 mLの総メッキミックスを調製します。
    1. 表1の1.5x BSKについて記載されている各成分の量を使用して、ステップ1.1で1x BSKについて説明しているように、1.5x BSKを1 L準備します。1x BSKの説明に従って保存します。
    2. 2.1%アガロースを水とオートクレーブで調製します。新鮮なアガロース溶液を使用するか、室温で保存してください。室温で保管する場合は、めっき前に完全に溶融するまで蓋をした状態で電子レンジで加熱します。
    3. 適切な濃度を達成するために必要な抗生物質の量を決定します(表2)全体のメッキミックスに基づいて。
      注:最終めっき液の総量が300 mLの場合は、200 mLの1.5x BSKと十分な抗生物質を混合して、300 mL全体が正しい最終抗生物質濃度になるようにします。形質導入アッセイのドナーとレシピエントの両方が異なる抗生物質耐性遺伝子を持っている場合、プレーティングミックスには両方の抗生物質が含まれている必要があります。ドナーからのPEG沈殿ファージ(ステップ5で調製)が抗生物質耐性マーカーをコードし、レシピエントが抗生物質耐性マーカーをコードしていない場合、プレーティングミックスには抗生物質を1つだけ含める必要があります。
  3. 注ぐプレートの数に基づいて、適切な量の1.5x BSKと抗生物質を、メッキ混合物全体を保持するのに十分な大きさの滅菌ボトルに移します。56°Cの水浴中で≥15分間平衡化します。
  4. オートクレーブまたはマイクロ波から採取した溶融アガロースを56°Cの水浴中で≥15分間平衡化します。
  5. 平衡化後、決定した量の2.1%アガロースを1.5x BSK(抗生物質を含む)とともにボトルに加え、めっき液を42°Cの水浴に10〜15分間戻します。
    注意: 高温はスピロヘータを損傷または殺す可能性があります36。上記と同じウォーターバスを使用する場合は、平衡化のタイマーを開始する前に、ウォーターバスを42〜45°Cに冷却してください。めっき液を42°Cで20分以上平衡化させないと、プレートを注いで固まり始めます。
  6. 平衡化中に、めっきする B.ブルグドルフェリ サンプルを準備します。めっきする量を滅菌済みの50 mLコニカル遠心チューブに移します( 材料の表を参照)。
    1. 1.5 mL(最終的な30 mLプレート容量の<5%)未満の量をめっきする場合は、サンプルを新しいチューブに移し、めっき中にめっき混合物をサンプルに直接追加します。
    2. 大容量の場合は、必要な量の培養液を新しいチューブに移し、室温で6,000 x g で10分間遠心分離します。上清の100〜500 μLを除くすべてをデカントし、残りを使用してペレットを完全に再懸濁してからめっきします。
    3. 共培養後のコントロールプレートの場合、ドナーまたはレシピエントクローンの≥107 細胞を滅菌50 mLコニカル遠心チューブに追加します。容量が1.5 mLを超える場合は、ステップ7.6.2と同様にペレットを遠心分離して再懸濁します。PEG沈殿ファージを用いて形質導入アッセイを行った場合、レシピエントクローンに加えて、100〜250μLのファージサンプルを滅菌済みの50mLコニカルチューブに入れてめっきします。
  7. めっき液が42〜45°Cで10〜15分間平衡化した後、30mLのめっき液を適切なサンプルの入ったチューブに移します。すぐにメッキミックスとサンプルをラベル付きプレートに分注します。めっきするサンプルごとに新しいピペットで繰り返します。
  8. プレートを15〜20分間固化させてから、5%CO2を添加した33°Cのインキュベーターに入れます。注いだ後、少なくとも48時間はプレートを反転させないでください。
  9. レシピエントクローンのバックグラウンドに応じて、10〜21日間のインキュベーション後に、選択プレート上のアガロース内にコロニーが現れることを確認します。滅菌綿栓5.75ホウケイ酸ピペット( 材料の表を参照)を使用して、両方の抗生物質の存在下でプレート上で成長する少なくとも5〜10個のコロニーを選び、適切な抗生物質を含む1xBSKの1.5mLに接種します。
  10. 接種したコロニーをステップ1.3のように33°Cで3〜5日間、または暗視野顕微鏡を使用して20倍の倍率でフィールドあたり約20〜40スピロヘータの密度に達するまで成長させます。
    注:スクリーニング後(ステップ8を参照)、0.22 μmフィルターでろ過滅菌した60%グリセロールと40%1x BSKの混合物と等量の培養液を混合することにより、スピロヘータを-80°Cで長期保存するために凍結できます。

8. 潜在的な形質導入剤の検証

注:2つの抗生物質の存在下でプレート上で増殖するクローンをスクリーニングして、予想される(レシピエント)バックグラウンドで真の形質導入剤を表していることを確認します。これらの方法は、ポリメラーゼ連鎖反応による特定の領域の増幅、および潜在的にシーケンシングに基づいています。 B. burgdorferi でPCRを行う詳細なプロトコルおよび実施方法は、他の場所に記載されている(最近の例については、Seshu et al.37を参照されたい)。使用する菌株に基づいて形質導入体のスクリーニングに使用するプライマーを選択します。形質導入体のスクリーニングにアプローチする方法に関するいくつかの提案を以下に記載する。

  1. PCRスクリーニングのために B.ブルグドルフェリ 溶解物を調製します。
    注:次のプロトコルを使用して、ステップ7.9のように増殖した培養細胞から洗浄 したB.ブルグドルフェリ 溶解物を生成し、PCRによるDNAの即時分析を行います。この方法は、BSKにおける潜在的な阻害剤の干渉を最小限に抑えるように設計されていますが、シーケンシングまたは保存用の高品質のDNAを製造するには推奨されません。そのためには、全ゲノム抽出用のプロトコルまたはキットを使用してください( 材料表を参照)。親クローン(ドナー株とレシピエント株の両方)からのライセートも、各分析に含めるために同時に調製することを強くお勧めします。
    1. 選択した各潜在的な形質導入体500 μLを、ステップ7.10と同様にクリーンなマイクロ遠心チューブに移して培養します。
    2. 培養液を室温で8,000 x g で10分間遠心分離します。
    3. 上清を除去し、各ペレットを500 μLのTE(10 mM Tris Cl、pH 8.0; 1 mM EDTA、pH 8.0)に再懸濁します。室温で8,000 x g で5分間遠心分離します。
    4. 上清を除去し、各ペレットを50 μLのPCR品質の水に再懸濁します。サンプルを10分間煮沸します。それらを短時間冷ましてから、室温で8,000 x g で10分間遠心分離します。
    5. 各PCRについて、遠心分離したサンプルの上部から2 μLを直ちに使用します。ペレットを乱さないでください。
  2. PCRを使用して、抗生物質耐性をコードする特定の遺伝子の潜在的な形質導入物質をスクリーニングします。形質導入アッセイで一般的に使用される抗生物質耐性マーカーをスクリーニングするためのプライマーについては 、表4 を参照してください。
    注:私たちの経験ではまれですが、 B.ブルグドルフェリ の異種DNAの選択に使用されるアミノグリコシド抗生物質への自然突然変異が発生する可能性があります。
  3. 別の株またはクローンマーカーを使用して潜在的な形質導入物質をスクリーニングし、バックグラウンドがレシピエントのバックグラウンドであることを確認します。これらの分析には、ドナーとレシピエントの両方の親クローンを含めます。使用した菌株と、菌株の完全性を決定するための個々のラボプロトコルに基づく配列を使用して、菌株特異的マーカーをスクリーニングします。
  4. ダニベクターまたは哺乳類宿主内で使用するために、または別のクローンとの直接比較のために毒性クローンに形質導入を試みる場合は、形質導入体および親クローンの完全なプラスミド含量を決定する。これは、他の場所に記載されているように、比較株と同じプラスミド含量、または風土病サイクル内の増殖に必要な遺伝的要素の存在を保証するために行われます18、19、37、38、39。

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結果

より容易に形質転換可能なB. burgdorferi株または電気変換に抵抗性のあるクローン間でDNAを移動するためのバクテリオファージの使用は、ライム病の決定要因の継続的な分子調査のための別のツールを表しています。本明細書に記載される形質導入アッセイは、潜在的な形質導入物質の選択のために1つまたは2つの抗生物質のいずれかを使用して、目的の任意のクローン間のDNAの移動を容易にするために必要に応じて改変することができる。高継代株CA-11.2Aクローンと高継代株B31クローンおよび低継代毒性株297の両方との間のプロファージDNAと異種大腸菌/B.ブルグドルフェリシャトルベクターの両方の形質導入が以前に実証されています28。以下に示す結果は、2つの高継代病原性クローン間のプロファージDNAの移動を示しています。ドナークローンc1673は、プロファージDNA27,28上のカナマイシン耐性遺伝子をコードするB.ブルグドルフェリ株CA-11.2Aクローンであ...

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ディスカッション

形質導入の使用は、B. burgdorferi 1,4,13,37の電気変換に関連する生物学的および技術的障壁の少なくともいくつかを克服する1つの方法を表すことができる。多くの系において、バクテリオファージは、一般化形質導入または特殊化形質導入のいずれかによって、細菌細胞間で宿主(非プロファージ)DNAを移動させることができる22、23、24、49、50。特殊な形質導入では、いくつかの宿主遺伝子が常にプロファージDNA49,50とともにファージ...

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開示事項

著者は開示するものは何もありません。

謝辞

著者は、Shawna Reed、D. Scott Samuels、Patrick Secorの有益な議論と、技術支援を提供してくれたVareeon (Pam) Chonweerawongに感謝したいと思います。この研究は、生物医科学部とクイニピアック大学健康科学部のクリスチャンH.エガーズへの教員研究助成金によってサポートされました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1 Lフィルターユニット(PES、0.22 µミリポアシグマS2GPU10RE
12 mm x 75 mmチューブ(デュアルポジションキャップ)(ポリプロピレン)USA Scientific1450-0810、低ボイドボリュームで4 mLを保持します(誘導用)
15 mL円錐遠心チューブ(ポリプロピレン)USA Scientific5618-8271
1-メチル-3-ニトロソ-ニトログアニジン(MNNG)ミリポアシグマ注意:潜在的な発がん性物質;もはや容易に入手できない、テストされていない代替
5.75インチパスツールピペット(綿栓/ホウケイ酸ガラス/非滅菌)サーモフィッシャーサイエンティフィック13-678-8Aオートクレーブを使用する前に
50mL円錐形遠心分離チューブ(ポリプロピレン)USAサイエンティフィ1500-1211
無臭エタノール
アガロースLEドットサイエンティフィック株式会社AGLE-500
バクト ネオペプトンGibcoDF0119-17-9
バクト TC イェストレートギブコ255772
ウシ血清アルブミン (血清交換グレード)ジェミニ バイオプロダクツ700-104P
クロロホルム (分子生物学用)サーモフィッシャーサイエンティフィックBP1145-1注意:揮発性有機物、化学フュームフードでのみ使用
CMRL-1066 w/o L-グルタミン (粉末)US BiologicalC5900-01細胞培養グレード
エリスロマイシンResearch Products International CorpE57000-25.0
ゲンタマイシン試薬溶液Gibco15750-060
グルコース (デキストロース無水)サーモフィッシャーサイエンティフィックBP350-500
HEPESサーモフィッシャーサイエンティフィックBP310-500
硫酸カナマイシンサーモフィッシャーサイエンティフィック25389-94-0
Millex-GS (0.22 µM孔径)ミリポアシグマSLGSM33SS抗生物質やその他の少量溶液をろ過滅菌
マイトマイシンCサーモフィッシャーサイエンティフィックBP25312注意:発がん性物質の可能性がある;化学ヒュームフードでのみ使用
N-アセチル-D-グルコサミンMP バイオメディカルズ、LLC100068
オリゴヌクレオチド(PCR用プライマー)IDT DNA
OmniPrep (全ゲノム抽出キット)G Biosciences786-136
ペトリ皿 (100 mm × 15 mm)サーモフィッシャーサイエンティフィックFB0875712
Petroff-Hausser 計数チャンバーサー科学HS-3900
ペトロフハウザー計数チャンバーカバーガラスハウサー科学HS-5051
ポリエチレングリコール 8000 (PEG)サーモフィッシャーサイエンティフィックBP233-1
ウサギ血清非滅菌微量溶血ヤング(NRS)Pel-Freezバイオロジカルズ31119-3メーカーの指示に従って熱不活化セミ
ミクロUV透明キュベットUSAサイエンティフィック9750-9150
炭酸ナトリウムモフィッシャーサイエンティフィックBP328-500
塩化ナトリウムサーモフィッシャーサイエンティフィックBP358-1
ピルビン酸ナトリウムミリポアシグマP8674-25G
Spectronic Genesys 5サーモフィッシャーサイエンティフィック
ストレプトマイシン硫酸溶液ミリポアシグマS6501-50G
クエン酸三ナトリウム二水和物ミリポアシグマS1804-500GBSK用クエン酸ナトリウム
はック ハウ重サー

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