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方法論記事

9日齢マウス新生児における肝外胆管および胆嚢郭清

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DOI：

10.3791/64424

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2022年8月23日

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1Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, 2Research Laboratory for Pediatric Surgery, 3Research Animal Facility, University Medical Center Hamburg-Eppendorf

この記事について

サマリー

マウス新生児胆管障害の観察には、無傷の胆管と効率的な準備が必要です。したがって、マウス新生児の肝外胆管系全体を分離するための新しいアプローチは、胆管の完全性を維持しながら首尾よく開発されました。

要約

マウス新生児胆管の解剖は難しいと言われている。記載された標準操作手順の主な目的は、調製中に胆管を損傷することなく、マウス新生児における肝外胆管(EBD)の単離である。胆管細胞細胞株と比較して非常に近い調製および肝外胆管系(EBDS)全体の採取のために、記載されたアプローチは、胆道閉鎖症などの新生児胆管障害の動物モデルの研究において非常に有用である。安楽死後、腹腔にアクセスし、胆管系、十二指腸、肝臓を独自のEn-bloc切除(EbR)で抽出しました。抽出したサンプルをフォームマットの上に置き、EBDを汚染細胞から非外傷的に解剖します。EBDS全体の解剖は、この方法の大きな利点です。胆管組織のサイズと量が小さいため、注意が必要です。記載された技術を使用しても、胆管細胞に損傷はない。また、当該技術の純度は再現性がある(n=10)。したがって、最適に比較可能なサンプルを採取することができます。さらに、胆管系との接触を調製中に回避し、胆嚢内に胆汁液を残すことができるため、胆管組織は損傷を受けません。最も重要なことは、最終的な胆嚢および胆管郭清を行う際に、非外傷性マイクロ器具を絞らずに胆管のわずかに外側にのみ使用したことです。これは、クリーンで無傷のサンプルの鍵であり、さらなる組織学的調査や胆管細胞の単離に不可欠です。要約すると、説明されている革新的な解剖技術により、特に経験の浅いオペレーターは、必要な機器を使用してEBDSを可能な限りきれいに分離できます。

概要

胆道閉鎖症、原発性硬化性胆管炎(PSC)、原発性胆汁性胆管炎(PBC)などの胆管障害の発生と進行は不明または不完全です1,2。これらの疾患の起源と進行についての理解が限られているため、治療の選択肢が不足しています3。新生児胆管疾患を研究する上で最も困難な障害は、病態生理学の分子的理解を得ることです。分子病理学をよりよく理解するための重要な鍵の1つは、患部組織の可能な限り最良の観察です。胆道閉鎖症4の潜在的なウイルス病因を観察するなど、研究間の比較可能性の低下や不一致を避けるために、実行された解剖技術の可能な限り最良の準備と共有の必要性が生じます。標的組織の純粋な調製は、後の顕微鏡調査や細胞および3Dオルガノイド培養の繁殖に必要です。しかし、マウス新生児障害では、組織サンプルはまれであり、サイズが非常に小さいため少量しか発生しません。胆管障害に関しては、マウス新生児における胆管のクリーンな調製の難しさが記載されている5。新生児の発達段階のために、組織分化は過度に進行しておらず、これは調製を複雑にし、成人サンプルの調製と比較して困難を増大させる。したがって、手術ワークグループは、新生児マウスモデルでEBDSを準備するための新しい戦略を調査しました。本研究では、この手法により、各サンプルの効率的な解剖が可能になります。

胆管系は、肝臓から生じる右上腹部に腹腔内に配置されます。胆嚢は、肝臓の右葉の内臓表面の下にあります。胆管は、門脈および肝動脈と共に、肝十二指腸靭帯に埋め込まれている。肝臓と十二指腸を直接結合し、十二指腸6に胆汁液を排出します。解剖学的には、胆管は左右の肝管、総肝管、嚢胞管、および嚢胞管と総肝管の合流点によって形成される総胆管7に分けられる。これは最終的に胆汁と唾液を膵管からベイターの膨大部 を介して 十二指腸に空にします。

胆管細胞は胆管を肝内および肝外に並べ、複雑な解剖学的ニッチに住み、胆汁産生と恒常性を助けます8。胆汁は、これらの特殊な上皮細胞を毎日高濃度で通過させます。特に、HCO3-傘の維持は、胆汁酸毒性から保護するために非常に重要です9。胆管細胞は、例えば管腔微生物10に対する肝胆道系における第一の防御線である。胆管細胞の毒性攻撃に対する防御効果は、遺伝的素因によって弱まる可能性があります。.有毒な過負荷は損傷と破壊を引き起こし、したがって胆管障害につながる可能性があります。さらに、発達中の胆管は、すべての自己防衛機構を完全に行うことができるわけではなく、新生児胆管11における環境毒素に対するより高い感受性をもたらす。

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プロトコル

倫理的承認(N045/2021)後、雄および雌のC57BL / 6マウス新生児が9日齢まで観察されました。動物は、ドイツのハンブルクにあるハンブルクエッペンドルフ大学医療センターの動物施設によって生まれ、実験目的で提供されました。新生児は親動物と一緒にケージに収容されました。環境条件は、温度(20〜24°C)、12:12時間の明暗サイクル、および相対湿度40%〜70%で制御されました。

1. 実験準備

  1. はさみ、鉗子など、外科手術に必要な機器を準備します( 資料表を参照)。
  2. 消毒およびオートクレーブ処理した器具を手術台の横の無菌面に置きます。
  3. 手術用ハサミで斬首することにより、P9年齢の新生児マウスを迅速に安楽死させます。安楽死させた新生児マウスの体を無菌手術場に置きます。9日齢のマウス新生児のEBDSを解剖します(ステップ5)。
    注:説明されている解剖手順は、科学者に新生児および高齢のマウスからEBDSを除去するための適切なツールを提供します。マウスが古ければ古いほど、準備は容易になります。

2.腹膜腔へのアクセス

  1. 鉗子で膀胱の位置の上の皮膚をつかみます。腹膜とその下にある構造を損傷することなく、ハサミを使用して直径2mmの穴を皮膚に切開します。左前腋窩線に沿って、断頭の位置にカットを拡大します。非外傷性鉗子で左から右に皮膚を取り除きます。
  2. 脾臓を囲む腹膜をつかみます。腹膜がテントのような構造に似るまでゆっくりと持ち上げ、中央に直径1mmの穴を開けます。「腹膜テント」が空気で満たされるのを待ちます。この手順と次の手順には、10倍の顕微鏡倍率を使用します。
  3. 肝臓、胆管系、胃、小腸、結腸への完全なアクセスを確保するために、下肋骨、両方の外側腹部領域、および下部膀胱領域で囲まれたウィンドウで腹膜を切り取ります。
    注:肝臓へのアクセスを改善するために、剣状突起、鷹状靭帯、肝臓、および胆管構造を無傷のままにして、3つの最下部の肋骨を取り除く追加の切開を行うことができます。肝臓の眺めは簡単に入手できます。

3.胆嚢と胆管の検査

注意: 次のすべての手順では、サンプルを定期的に濡らしてください。

  1. 剣状突起を頭蓋鼻腔の位置に慎重に引っ張って胆嚢を調べます。
    注:この動きで鷹状靭帯の緊張が高まり、付着した胆嚢が見えるようになります。
    1. 胆管系から胆嚢が裂ける可能性のある鷹状靭帯の制御不能な裂傷を避けるために、わずかな引っ張りを行うだけです。次のステップの前に剣状突起のプルを解放します。
  2. 十二指腸をそっと引き下げて、胆管系を解放します。
    注:肝十二指腸靭帯の張力が上がると、胆管組織が見えるようになります。

4.ブロック切除

  1. 以下の手順に従って、下部ブロック動員を実行します。
    1. 胆管系を十二指腸に接続する十二指腸乳頭を特定します。
    2. 乳頭の右側から約2 cmの十二指腸を切り取ります。
    3. 幽門領域を切り取ります。胃の内容物が切断位置と十二指腸乳頭の間の幽門領域に存在することを確認してください。
      注:これは、口腔および口腔十二指腸部分の正しい位置の向きを後で確認するための重要なステップです。
  2. 上部ブロック動員を実行します。
    1. 剣状突起をそっと引っ張って、鷹状靭帯にアクセスします。
    2. 胆嚢と剣状突起の間の剣状突起にできるだけ近い、鷹状靭帯を1 cmの長さで切断します。胆嚢を傷つけないようにしてください。
    3. 肝臓と胸部の間の次の接続構造を切り取ります:食道、下大静脈、胸部大動脈、肝臓の裸の領域を囲むすべての靭帯、および背側に残っているすべての組織接続。
      注:一括サンプルは完全に解剖されています。それは肝臓、胆管系、そして胃の幽門領域に接続されている十二指腸コーパスを含みます。

5.最終的な胆嚢および胆管解離

  1. 以下の手順に従って、総準備を実行します。
    1. エンブロックサンプルを、通常脱水に使用されるフォームパッドに置きます。この手順と次の手順では、20倍の顕微鏡倍率と最大先端サイズ6mmの2つの顕微手術用非外傷性鉗子を使用します。
    2. フォームパッドでサンプルを組み立てます。サンプルを正しい解剖学的位置に再編成します。十二指腸の口腔部分と口腔部分を平らにし、穏やかな動きをします。
    3. 十二指腸乳頭で動きを開始し、非外傷性鉗子を使用して刃先まで続けます。十二指腸の口腔部分でのみ発生する胃の白い果肉の内容物を滑らかにします。胆管の回転の可能性を除外するために、十二指腸の口腔部分と大声部分を特定するようにしてください。
    4. 肝組織の大きな残りを切り取り、胆管の解剖を開始します。
  2. 最終的な分離を実行します。
    1. 残りの肝組織をフォームマットの毛穴にそっと押し込みます。掻き取りの動きが胆管系から始まり、肝臓の境界につながることを確認してください。
    2. さまざまな方向に数回こすった後、サンプルをフォームマットのよりきれいな位置に移します。バックグラウンドで肝臓組織が圧迫されないという利点を利用して、EBDSと不要な細胞を可能な限り最良の分化のためにビューを最適化します。肝組織が何も、またはできるだけ少なくなるまで、胆管から肝組織をこすり落とします。.
    3. 孤立したEBDSが残るまで肝十二指腸靭帯を処理します。肝動脈、門脈、小さな残骸などの靭帯内血管を取り除きます。この繊細なフィラメントを、穏やかな引っ張りと細心の注意を払って、左側の側面から取り外します。この解剖ステップは、肝組織の事前の除去中に意図せずに、または部分的にすでに開始されている可能性があり、最終的には同じ結果につながります。
      注:血管は、十二指腸乳頭の口腔で約3〜5 mmの白くて非常に繊細なフィラメントとして出現し、左側から肝十二指腸靭帯に結合し、胆管とともにグリソニアントライアドに蓄積します。このステップが完了すると、最終サンプルは完全に単離されます。記録が必要な場合は、胆管構造を解剖学的位置に整理した後に画像をキャプチャできます(図1)。フォームマットで最後の準備手順を実行することは、サンプルが操作フィールドの表面にそれほど付着しないため、推奨されます。毛穴が濡れていると、胆管が浮上または浮遊します。サンプルを移動する際、手術布に準備する場合ほどしっかりとくっつかず、サンプルの移動中に裂けることはありません。

6.組織学的分析の準備

  1. 単離したサンプルを、解剖後できるだけ早く緩衝溶液、特殊培地、またはホルマリン含有固定液( 材料表を参照)に入れます。
  2. さらに計画された処理ステップに応じて、適切なストレージソリューションを選択してください。
    注意: ホルマリン含有固定剤は、急性毒性、腐食性、およびさまざまな健康被害があるため、通気口の下でのみ使用してください。.
    注:提示された研究では、EBDSサンプルはパラホルムアルデヒドに挿入され、脱水され、パラフィンに埋め込まれています。それらは室温で保存され、切片化の前に冷却されています。加温キャビネット内で、2 μmのスライスを一晩保管し、従来のヘマトキシリンとエオジン4 を使用して染色しました( 材料の表を参照)。

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結果

図1A は、記載された技術を用いて解剖したマウス新生児のEBDSを示す。顕微鏡的には、それ以上の肝組織は見えません。肝組織は、プロトコルの最終分離ステップで除去され、色と一貫性に関して胆管組織と簡単に区別できます。 図1B は、分離されたサンプルをミリメートルスケールと比較したものです。EBDの長さ(胆嚢から十二指腸乳頭まで測定)は10mm未満です。非常に繊細な胆管管の直径は0.05〜0.2 mmの範囲で変化しました。 図2 は、開いた内腔を有するEBDSの縦断面のヘマトキシリン-エオジン染色を示しています。胆管細胞は、内腔の周囲を単層として識別し、より暗く染色することができます。顕微鏡観察は20倍の倍率を用いて行った。図は、記載された解剖プロトコルを使用すると、新生児マウスであっても、オペレーターが管の縁近くのEBDSを顕微鏡で解剖できることを示しています。サンプルは、9日齢のマウス新生児から採取されました。

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ディスカッション

この記事では、安楽死させた新生児マウスのEBDSを除去するための新しい外科的アプローチの作成と検証について報告し、議論しました。顕微鏡的および組織学的所見により、このアプローチはEBDを迅速に検出し、新生児マウスであっても管の縁の近くでそれらを解剖することが明らかになりました。記載されたプロトコルには、手術器具と20倍の倍率の顕微鏡のみが必要です。さらに、このアプローチにより、EBDS全体を分離することができます。この手法は非常に効率的で、わかりやすく、簡単に複製できます。

胆道閉鎖症、PSC、PBCなどの胆管疾患の研究には、胆管システム全体の機械的抽出が頻繁に必要になります。特に新生児ではサイズが小さいため、解剖、処理、分析が困難です。1日齢の新生マウスEBDの肝外乳管細胞の単離はすでに確立されているが、この方法は困難であると説明されている。一般的に、この手順に不慣れな個人は、解剖技術と小胆管の洗浄に関する技術的な課題のために苦労します5。したがって、手術ワークグループは、新生児マウスモデルでEBDSを準備するための新しい戦略を調査...

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開示事項

著者は利益相反を宣言しません。

謝辞

著者らは、ヨハンナ・ハーゲンス、ポーリーネ・シュパート、クララ・フィリッピ、PD博士クリスチャン・トムシャット、スヴェンヤ・ワーンケ、PDダイアナ・リンドナー博士、ディルク・ウェスターマン教授、ミリアム・トムザック、ニコール・リューダー、ナディーン・クルザワ、ライア・パジェロールス・ラルイ博士、ビルギット・アプル、マグダレーナ・トロチミウクの貢献を認めています。ハンス・クリスチャン・シュミットは、ハンブルクのUKEにあるエルゼ・クローナー・フレゼニウス・シュティフトゥングiPRIME奨学金(2021_EKPK.10)によって財政的に支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
2-プロパノールCHEMSOLUTE11365000脱水剤として使用される
30 G カニューラB Braun/Sterican, Melsungen ドイツ4656300カニューレ サンプルの水和用
エアベンC + P Möbelsysteme GmbH &Co. KG、ブライデンバッハ、ドイツTec-Ononmic AZ 1200通気孔の使用は、ホルマリン含有固定剤の吸入を避けるのに役立ちます
アクア広告注射 ブラウンB ブラウン、メルズンゲン、ドイツ2351744生理食塩水;容器:Mini-Plasco connect、20 x 10 mL、滅菌済み
大型顕微手術用鉗子DIADUST von Aesculap、Trossingen DeutschlandFD253Rストレート、180 mm (7インチ)、プラットフォームチップ、丸型ハンドル、幅:0,800 mm、ダイヤモンドダストコーティング済み、非滅菌、観察および非常に最終的な準備を除くすべての準備ステップのための再利用可能なオプションツール。腹膜の皮膚を分割
するカメラ」SmartCAM 5インチ Basler and Vision Engineering, Send, United KingdomEVC131AオプションのLynx Exoカメラモジュール: sensortype: CMOS, resolution 2560 x 1920 pixels, sensor size: 1/2";ビデオ制作と技術評価に使用
脱水機/シタデル 2000 ティッシュ プロセッサフィッシャー サイエンティフィック GmbH、シュヴェルテ、ドイツ12612613自動脱水、ショート プログラム (約 4.8 時間)
脱水スポンジ カール・ロス、カールスルーエ、ドイツTT56.1スポンジ最終解剖ステップ用、最小細孔サイズ60孔/インチ他のスポンジ/フォームパッドも適しており、埋め込みカセットごとに2つのフォームパッドは、埋め込みカセットDulbecco´の穿孔を介してスライドを防ぐために、下と上からサンプルを覆うことをお勧めします
。S Phosphat Buffered Saline (PBS)Gibco14190-144Doesn´tはカルジウムまたはマグネシウム、500 mL
埋め込みカセットEngelbrecht GmbH、Edermüを含んでいます。nde、ドイツ17990
EosinMEDITE Medical GmbH、ブルクドルフ、ドイツ41-6660-00染色液、すぐに使用できる
ファインハサミCeramaCutFST、ハイデルベルクドイツ14959-09ヒント:シャープシャープ、合金/材質:セラミックコーティングステンレス鋼、鋸歯状:、はい;特徴:CeramaCut、先端形状:ストレート、刃先:22 mm、長さ:9 cm;皮膚の切開、腹膜窓の切開
Graefe ForcepsFST、ハイデルベルクドイツ11051-10長さ:10 cm、先端形状:湾曲、鋸歯状、先端幅:0.8 mm、先端寸法:0.8 x 0.7 mm、合金/材質:ステンレス鋼
HematoxylinMEDITE Medical GmbH、ブルクドルフ、ドイツ41-5130-00染色液、すぐに使用できる
Highresolotion 顕微鏡Vision Engineering、英国を送信EVO503 最大60倍の倍率まで拡大でき、6倍から20倍の倍率しか使用できませんでした 
顕微鏡Olympus Optical CO, Ltd., ハンブルク, ドイツBX60F5
顕微鏡カバー GlasesMarienfeld, Lauda-Königshofen、ドイツ10124460 mm幅、SCHOTT D 263ガラス
製 顕微鏡スライドR. Langenbrinck GmbH、Emmendingen、ドイツ03-0060
MicrotomeLeica、Nußloch, GermanySM2010R切片作成用ツール (2 & micro;mスライス) 
Omnifix-F 1 mL シリンジB Braun, Melsungen, Germany9161406Vsyringe without canula
ParaffinSakura Finetec, Torrance, USA4511Tissue-Tek Paraffin Wax Tek III, without DMSO
Paraffin embedding machineMEDITE Medical GmbH, Burgdorf, GermanyTES 99この研究で使用された埋め込みマシンには、TES 99.420、TES 99.250、TES 99.600の3つの個別のモジュールが含まれていました。サンプルは脱水の直後にパラフィンに埋め込むべきで、冷蔵庫での暫定的な保存は、冷蔵庫での収縮と湿気の可能性があるため、行うべきではありません
パラホルムアルデヒド(PFA)モルフィスト1176201000肝臓サンプル用の2mLエッペンドルフ円錐管チューブに1mLアリコートを準備し、肝外胆管サンプル用の1mLエッペンドルフ円錐管チューブに0.5mLアリコートを準備します。 PBSの4%ph 7.4 
小型顕微手術用鉗子 EPM(Erich Pfitzer Medizintechnik)、Bütthard、バイエルン、ドイツ(00)165ラウンドハンドル、ストレート、0.3 mmチップ、観察および準備のすべてのステップのためのツール、特に最終準備に有用
ステンレス鋼定規Agntho's AB、Lidingö、スウェーデン30085-15150mmメトリック&インチ卒業
手術用ハサミ–斬首のためのシャープブラントFST、ハイデルベルク ドイツ14001-14斬首用装置
加温キャビネットハラエウス、ハーナウ、ドイツT 6060スライスされたサンプルは、顕微鏡スライド上のサンプルの付着を確保するために、加温キャビネットに保管する必要があります
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参考文献

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