このプロトコルは、遺伝子発現および組織学的分析のためのマウス子宮内膜上皮オルガノイドを確立するための方法論を説明しています。
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この記事について
サマリー
要約
子宮内膜組織は子宮の内腔を裏打ちし、エストロゲンとプロゲステロンの周期的な制御下にあります。これは、管腔および腺上皮、間質コンパートメント、血管網、および複雑な免疫細胞集団で構成される組織です。マウスモデルは子宮内膜を研究するための強力なツールであり、着床、胎盤形成、および癌を制御する重要なメカニズムを明らかにしています。3D子宮内膜オルガノイド培養の最近の開発は、子宮内膜生物学の根底にあるシグナル伝達経路を解剖するための最先端のモデルを提示します。遺伝子操作されたマウスモデルから子宮内膜オルガノイドを確立し、それらのトランスクリプトームを解析し、単一細胞分解能でそれらの形態を視覚化することは、子宮内膜疾患の研究にとって重要なツールです。本論文では、マウスの子宮内膜上皮の3D培養を樹立する方法を概説し、遺伝子発現を定量化し、オルガノイドの組織像を解析する技術について説明します。目標は、子宮内膜上皮オルガノイドの遺伝子発現と形態学的特徴を確立、培養、および研究するために使用できるリソースを提供することです。
概要
子宮内膜 - 子宮腔の内層粘膜組織 - は、女性のリプロダクティブヘルスに重要な役割を果たすユニークで非常に動的な組織です。生殖寿命の間、子宮内膜は卵巣ホルモン - エストロゲンとプロゲステロンの協調作用によって調整されて、増殖、分化、および分解の数百サイクルを経験する可能性を秘めています。遺伝子操作マウスの研究により、ホルモンに対する子宮内膜の反応と、胚着床、間質細胞の脱落膜化、妊娠の制御を支える基本的な生物学的メカニズムが明らかになりました1。しかし、in vitro研究は、従来の2D細胞培養で形質転換されていない初代マウス子宮内膜組織を維持することが困難であるため、制限されていました2,3。3D臓器系(オルガノイド)としての子宮内膜組織の培養における最近の進歩は、子宮内膜細胞の再生と分化を制御する生物学的経路を研究する新しい機会を提供します。マウスおよびヒトの子宮内膜オルガノイドシステムは、さまざまなマトリックスに封入された純粋な子宮内膜上皮から開発されており4,5、ヒト子宮内膜は足場のない上皮/間質共培養6,7として、最近ではコラー....
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プロトコル
マウスの取り扱いと実験的研究は、ベイラー医科大学の施設内動物管理使用委員会(IACUC)によって承認されたプロトコルと、実験動物の世話と使用のためのNIHガイドによって確立されたガイドラインの下で実施されました。
1.酵素的および機械的方法を用いたマウスからの子宮上皮の単離
注:このセクションでは、ゲルマトリックススキャフォールドを使用してマウスから上皮子宮内膜オルガノイドを確立、継代、凍結、および解凍するために必要な手順について説明します。以前の研究では、マウス子宮内膜オルガノイドの最適な培養物が発情期4の間にマウスから確立されることが決定されており、これは膣スワブ15の細胞学的検査によって決定することができる。成体雌WTマウス(6〜8週齢、ハイブリッドC57BL/6Jおよび129S5/SvEvBrd)を全ての実験に使用した。マウスは、IACUC承認のガイドラインに従って、イソフルラン鎮静とそれに続く子宮頸部関節脱離を使用して人道的に安楽死させた。マウスを安楽死させたら、次の手順に従う必要があります。このプロトコルで使用される材料とソリューションに関連する詳細については、 材料の表 を参照してください。
- 使用前に、ゲルマトリックスを氷上で....
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結果
マウス子宮内膜オルガノイドの位相差画像
添付のプロトコルに記載されているように、WTマウス子宮内膜上皮からオルガノイドを樹立しました(図 1の図を参照)。マウス子宮内膜上皮の酵素的解離に続いて、上皮シートを子宮間質細胞から機械的に分離し、さらにコラゲナーゼで解離して単一細胞懸濁液を生成した。この上皮細胞と間質細胞分離の方法を正しく実行すれば、反対の細胞タイプの10%〜15%以下の汚染を持つサンプルが得られるはずです( 図2の免疫蛍光画像を参照)。次に、上皮細胞ペレットをゲルマトリックスに再懸濁し、室温でゲル化させ、組織培養プレート上の25 μLドームに播種しました。ゲルマトリックスドームが固化した後、それらをオルガノイド培地で覆い、成長させた。通常、図3に示すように、子宮内膜上皮細胞が 3〜4日以内にオルガノイドに集合することが観察されました。オルガノイドは培養中に維持され、培地の交換は3日ごとに発生し、継代は5〜7日ご.......
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ディスカッション
ここでは、マウス子宮内膜から子宮内膜上皮オルガノイドを生成する方法と、それらのダウンストリーム分析に日常的に使用されているプロトコルについて説明します。子宮内膜オルガノイドは、子宮内膜症、子宮内膜がん、着床不全などの子宮内膜関連疾患を制御するメカニズムを研究するための強力なツールです。2017年に発表された画期的な研究では、マウスおよびヒト上皮由来の子宮内膜オルガノイドの長期および再生可能な培養物を培養する条件が報告されています4,5。オルガノイドは他の系における生物学的経路の研究に広く使用されてきたが、in vitroでの子宮内膜組織の研究は、培養中の非形質転換初代上皮を研究するための適切なモデルがないために制限されてきた26。ヒトおよびマウスの子宮内膜由来の子宮内膜オルガノイドは、腸、腎臓、肺などの他の臓器組織からのオルガノイドを培養するために通常使用される条件を使用し、それらをゲルマトリックス4で構成さ.......
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開示事項
著者は開示する利益相反を持っていません。
謝辞
ステファニー・パンガス博士とマーティン・M・マツク博士(M.M.M.)には、私たちの原稿を批判的に読み、編集していただき、ありがとうございます。研究は、 Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development Grants R00-HD096057 (D.M.), R01-HD105800 (D.M.)、R01-HD032067 (M.M.M.)、R01-HD110038 (M.M.M.)、およびNCI-P30 Cancer Center Support Grant(NCI-CA125123)の支援を受けた。ダイアナ・モンシバイス博士は、バロウズウェルカム基金から次世代妊娠賞を受賞しています。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| オルガノイド培地 製剤 | |||
| 名前 | 会社名 | カタログ番号 | 最終濃度 |
| Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, *LDEV-free | Corning | 354230 | 100% |
| ウシ膵臓からのトリプシン | Sigma Aldrich | T1426-1G | 1% |
| Advanced DMEM/F12 | Life Technologies | 12634010 | 1X |
| N2 サプリメント | Life Technologies | 17502048 | 1X |
| B-27™サプリメント(50X)、ビタミンAを差し引いた | Life Technologies | 12587010 | 1X |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | 100 & micro;g/mL |
| N-アセチル-L-システイン | Sigma Aldrich | A9165-5G | 1.25 mM |
| L-グルタミン | Life Technologies | 25030024 | 2 mM |
| ニコチンアミド | Σ | Aldrich N0636-100G | 10 nM |
| ALK-4, -5, -7 阻害剤, A83-01 | Tocris | 2939 | 500 nM |
| 組換えヒト EGF | Peprotech | AF-100-15 | 50 ng/mL |
| 組換えヒト Noggin | Peprotech | 120-10C | 100 ng/mL |
| 組換えヒト Rspondin-1 | Peprotech | 120-38 | 500 ng/mL |
| 組換えヒト FGF-10 | Peprotech | 100-26 | 100 ng/mL |
| 換えヒト HGF | Peprotech | 100-39 | 50 ng/mL |
| WNT3a | R&D systems | 5036-WN | 200 ng/mL |
| その他の消耗品および試薬 | |||
| 名前 | 会社名 | カタログ番号 | 最終濃度 |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma Aldrich | C0130-1G | 5 mg/ |
| ウシ膵臓由来のmLデオキシリボヌクレアーゼI | Sigma Aldrich | DN25-100MG | 2 mg/mL |
| DPBS、カルシウム不使用、マグネシウム不使用 | ThermoFisher | 14190-250 | 1X |
| HBSS、カルシウム不使用、マグネシウム不使用 | ThermoFisher | 14170112 1X | |
| Falcon ポリスチレンマイクロプレート(24ウェル) | Fisher Scientific | #08-772-51 | |
| Falcon ポリスチレンマイクロプレート(12ウェル) | Fisher Scientific | #0877229 | |
| Falcon Cell Strainers, 40 & micro;m | Fisher Scientific | #08-771-1 | |
| ダイレクトゾールRNA MiniPrep (50 µg) | Genesee Scientific | 11-331 | |
| Trizol reagent | Invitrogen | 15596026 | |
| DMEM/F-12, HEPES, no phenol red | ThermoFisher | 11039021 | |
| Fetal Bovine Serum, Charcoal stripped | Sigma Aldrich | F6765-500ML | 2% |
| Estratiol (E2) | Sigma Aldrich | E1024-1G | 10 nM |
| ホルムアルデヒド 16% 水溶液ソリューション、EMグレード | VWR | 15710 | 4% |
| Eprediaカセット1スロットティッシュカセット | フィッシャーサイエンティフィック | 1000961 | |
| エプレディアステンレス鋼埋め込みベースモールドフィ | ッシャーサイエンティフィック | 64-010-15 | |
| エタノール、200プルーフ(100%) | フィッシャーサイエンティフィック | 22-032-601 | |
| Histoclear | Fisher Scientific | 50-899-90147 | |
| Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | 50-277-97 | |
| Epredia ナイロン生検バッグ | Fisher Scientific | 6774010 | |
| HistoGel Specimen Processing Gel | VWR | 83009-992 | |
| Hematoxylin solution Premium | VWR | 95057-844 | |
| Eosin Y (黄色がかった) 溶液 プレミアム | VWR | 95057-848 | |
| TBS バッファー、20X、pH 7.4 | GenDEPORT | T8054 | 1X |
| TBST (10X)、pH 7.4 | GenDEPORT | T8056 | 1X |
| クエン酸 | シグマ アルドリッチ | C0759-1KG | |
| クエン酸ナトリウム三塩基性二水和物 | シグマ アルドリッチ | S4641-500G | |
| Tween20 | フィッシャー サイエンティフィック | BP337-500 | |
| ウシ血清アルブミン(BSA) | Sigma Aldrich | A2153-100G | 3% |
| DAPI溶液(1 mg / mL) | ThermoFisher | 62248 | 1:1000 |
| VECTASHIELD退色防止マウンティング媒体 | ベクターラボ | H-1000-10クリア | |
| ネイルポリッシュ | フィッシャーサイエンティフィック | NC1849418 | |
| ッシャーブランドスーパーフロストプラス顕微鏡スライドフィ | ッシャーScientific | 22037246 | |
| VWR マイクロ カバー グラス | VWR | 48393-106 | |
| SuperScript VILO Master Mix | ThermoFisher | 11755050 | |
| SYBR Green PCR Master Mix | ThermoFisher | 4364346 | |
| Krt8 抗体 (TROMA-I) | DSHB | トロマ-I | 1:50希釈 |
| ビメンチン アントボディ | 細胞シグナル | 5741S | 1:200 希釈 |
| Donkey 抗ラット IgG (H+L) 高交差吸着 二次抗体 抗体、Alexa Fluor 594 | ThermoFisher | A-21209 | 1:250 希釈 |
| Donkey、抗ラビン IgG (H+L) 高交差吸着 二次抗体 抗体、Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | A-21206 | 1:250 希釈 |
| ZEISS Stemi 508 ステレオ顕微鏡 | ZEISS | ||
| ZEISS Axio Vert.A1 デジタルカメラ付き倒立ルーチン顕微鏡 | ZEISS | ||
| strong>Primer Sequence | Forward (5'-3') | Reverse (5'-3') | _ |
| Lipocalin 2 (Lcn2) | GCAGGTGGTACGTTGTGGG | CTCTTGTAGCTCATAGATGGTGC | |
| ラクトフェリン (LTF) | TGAGGCCCTTGGACTCTGT | ACCCACTTTTCTCATCTCGTTC | |
| プロゲステロン (PGR) | CCCACAGGAGTTTGTCAAGCTC | TAACTTCAGACATTTCCGG | |
| グリセルアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼ (Gapdh) | CAATGTGTCCGTCGTGGATCT | GCCTGCTTCACCACCTTCTT |
参考文献
- Wang, H., Dey, S. K. Roadmap to embryo implantation: clues from mouse models. Nature Reviews Genetics. 7 (3), 185-199 (2006).
- Hibaoui, Y., Feki, A. Organoid models of human endometrial development and disease. Frontiers in Cell and Developmental Biol....
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