マウス卵母細胞における紡錘体アセンブリチェックポイント完全性の評価

Summary

染色体分配の誤りは、卵母細胞に共通する特徴です。したがって、紡錘体アセンブリのチェックポイントを研究することは、健康な卵を生産するために必要なメカニズムについての重要な手がかりを与えます。本プロトコルは、マウス卵母細胞における紡錘体アセンブリチェックポイント完全性を評価するための3つの相補的アッセイを記載する。

Abstract

異数性は、ヒトの早期流産および妊娠不全を引き起こす主要な遺伝的異常である。異数性を引き起こす染色体分配のほとんどのエラーは、卵母細胞の減数分裂中に発生しますが、卵母細胞の減数分裂がエラーを起こしやすい理由はまだ完全には理解されていません。細胞分裂中、細胞は紡錘体アセンブリチェックポイント(SAC)を活性化することにより、染色体分配のエラーを防ぎます。この制御メカニズムは、動原体(KT)-微小管(MT)付着の検出と、紡錘体繊維によって発生する張力の検出に依存しています。KTが結合解除されると、SACが活性化され、細胞周期の進行が妨げられます。SACは最初にMPS1キナーゼによって活性化され、MAD1、MAD2、BUB3、およびBUBR1で構成される有糸分裂チェックポイント複合体(MCC)の動員と形成を引き起こします。次に、MCCは細胞質に拡散し、後期促進複合体/サイクロソーム(APC / C)アクチベーターであるCDC20を隔離します。KTが微小管に付着し、染色体が中期プレートに整列すると、SACがサイレンシングされ、CDC20が放出され、APC/Cが活性化され、サイクリンBとセクリンの分解が引き起こされ、後期発症が起こります。体細胞と比較して、卵母細胞のSACは、KTが付着していないにもかかわらず細胞が後期を迎えることができるため、それほど効果的ではありません。 SACがより寛容である理由と、この寛容性が卵母細胞の染色体分配エラーの原因の1つであるかどうかを理解することは、さらに調査する必要があります。本プロトコルは、マウス卵母細胞におけるSAC完全性を包括的に評価するための3つの技術を記載する。これらの技術には、ノコダゾールを使用してMTを解重合してSAC応答を評価すること、セクリン破壊の速度論を追跡することによってSACサイレンシングを追跡すること、免疫蛍光によるKTへのMAD2の動員を評価することが含まれます。これらの技術を組み合わせることで、SACの完全性を完全に評価することにより、健康な卵子を生産するために必要なメカニズムを調査します。

Introduction

染色体分配の誤りから生じる異数性は、早期流産の主な原因であり、減数分裂の間違いと強く関連しています¹。減数分裂は、DNA複製ステップを介さずに2ラウンドの細胞分裂で構成されるため、有糸分裂とは異なります。減数分裂Iでは、相同染色体は分離し、姉妹染色分体は一緒に残ります。卵母細胞では、このステップはエラーが発生しやすく、異数性卵の生成につながります²。

染色体分配エラーを防ぐために、ほとんどの細胞タイプは、スピンドルアセンブリチェックポイント(SAC)と呼ばれる細胞周期を一時停止する監視メカニズムを活性化します。このメカニズムは、動原体(KT)-微小管(MT)の付着を感知し、染色体が双極性に配向すると張力が発生します³。接続されていない動原体は、SACのマスターレギュレーターであるMPS1の動原体^3,4への採用から始まるSAC応答をトリガーします。MPS1は、他のSACコンポーネントのリクルートを開始し、有糸分裂チェックポイント複合体(MCC)を形成するためのプラットフォームとして機能します。MCCは、MAD1、MAD2、BUB3、およびBUBR1で構成され、細胞質に拡散し、アクチベーターCDC20を隔離することによりAPC/C活性化を阻害します。すべての動原体がMTに安定して結合し、染色体が中期プレートに整列すると、SACがサイレンシングされ、MCCがCDC20を分解して放出し、APC/C活性化が可能になります。活性APC / Cは、後期発症を引き起こす2つの重要なステップであるセクリンとサイクリンBを分解します^5,6。体細胞では、SACは単一の未付着の動原体によって活性化され、細胞周期停止を誘導するのに十分であるため、厳格です⁶。しかしながら、卵母細胞減数分裂の間、SACはより寛容であり、卵母細胞は1つ以上の未付着の動原体6、^7、8、^9、10で後期Iに入ることができる。SACが卵母細胞においてより寛容である理由を理解することは、この分野で進行中の焦点分野です。SAC活性化またはSACサイレンシングに欠陥を引き起こすメカニズムは、染色体分配のエラーまたは長期の細胞周期停止および細胞死につながる可能性があります。したがって、卵母細胞のSAC完全性を維持するメカニズムを評価することは、健康な倍数体の卵を形成するプロセスを理解するために重要です。

このプロトコルは、チェックポイントのさまざまな重要なステップを調べることにより、マウス卵母細胞減数分裂におけるSAC完全性を包括的に評価する技術について説明しています。まず、SAC活性化誘導後のSAC応答の評価について説明する。この活性化は、^MTs11を解重合する薬物であるノコダゾールを使用して、付着していない動原体を生成することによって達成されます。第二に、SACサイレンシングをモニタリングする方法は、卵母細胞成熟中のSecurin分解のダイナミクスを追跡することによって説明されています。最後に、免疫蛍光ベースのアッセイを使用して、MCC成分の1つであるMAD2の動原体への動員を測定します。一緒に、これらのアッセイは、卵母細胞の減数分裂成熟中のSACの完全性を包括的に評価します。

Protocol

これらのプロトコルで使用されたすべてのマウスは、ラトガース大学施設動物使用およびケア委員会(プロトコル201702497)および国立衛生研究所のガイドラインに従って飼育および飼育されました。これらの規制機関は、動物実験を含むすべての実験手順を承認しました。本研究で使用した全てのマウスは、6〜8週齢のCF-1雌であった。

1. 実験準備

1. SAC評価を開始する前に、以前に発表された第¹²報告書に従ってマウス卵母細胞を採取してください。採取した卵母細胞を3つの均等なサイズのグループに分け、減数分裂の再開を避けるために、2.5 μMミルリノンを含むChatot、Ziomek、およびBavister(CZB)培養培地( 材料の表を参照)に保管します¹³。
   注: CZB 組成: 81.6 mM NaCl;4.8 ミリリットル KCl;1.2 mM KH₂PO₄;1.2 mM MgSO_{4-7H 2}O;0.27 mMピルビン酸;1.7 mM CaCl₂;30.8 mM DL-乳酸;7 mMタウリン;0.1 mM EDTA;25 mM NaHCO₃;ゲンタマイシン;および0.3%のBSA。
2. 前述のようにマイクロインジェクション用のcRNAを調製する^12、14。マウス胚小胞卵母細胞からクローニングしたcDNAからマウスSecurin遺伝子を増幅し、続いてGfp配列^15、16を含むpMDL2ベクターにサブクローニングする。
   1. セクリン-Gfp cRNAを調製するには、プラスミドをNde I消化で直鎖化します。T3 RNAポリメラーゼを使用し、cRNA¹⁶を精製することにより、in vitro転写を実行します。
      注:cRNAは、使用するまで-80°Cで2〜3 μLのアリコートで保存してください。

2.ノコダゾール治療とライブイメージング

1. 5 μMのノコダゾール(NOC)を含む培地(CZB)1 mL、5 μMのNOCと0.5 μMのリバーシン(NOC + REV)を含む1 mLの培地、および対照としてジメチルスルホキシド(DMSO)を含む1 mLの培地(1:2000)を準備します( 材料表を参照)。
2. 卵母細胞の成熟とライブイメージングには、インキュベーター内で37°C、5%_CO2、湿度80%で予熱した96ウェルプレートを使用します。最初のウェルに、150 μLのコントロールDMSO処理を負荷します。2番目のウェルに、150 μLのNOC処理を負荷します。そして3番目のウェルに、150μLのNOC + REV処理を負荷します。必要になるまで、プレートを上記と同じ条件下でインキュベーターに保管してください。
   注:96ウェルプレートでは、境界線の影が画像の品質を妨げるため、最初の行と最初の列の使用は避けてください。
3. 減数分裂成熟を開始するには、ミルリノンを除去します。30倍から64倍の倍率を使用して実体顕微鏡下で卵母細胞を観察しながら、DMSOを含む100 μLのミリノンフリー培養培地を6滴ずつ卵母細胞を順次移して培地からミリノンを洗い流し、手動または口操作のピペットを使用して96ウェルプレートの対応するウェルに入れます。
   1. 手または口で操作するピペットを使用して卵母細胞を拾い上げ、次の滴に送達して卵母細胞を数え、卵母細胞を失うことを防ぎます。卵母細胞は単一で、大きく(直径~80μm)、丸い細胞です。核は細胞の中心にボタンのように現れ、膜と透明帯が卵母細胞を囲みます。
      注:卵母細胞を滴の間で移動させ、可能な限り少ない量の液体を移動します。これにより、培地からミルリノンを最適に除去することができます。卵母細胞が減数分裂を再開できない場合は、ミルリノンが効果的に除去されなかった可能性があります。
4. NOCおよびNOC + REV処理に対して同じプロセス(ステップ2.3)を繰り返します。
5. 37°C、5%_CO2、湿度80%の条件下で制御された環境を備えたインキュベーターチャンバーを備えた明視野顕微鏡を使用して卵母細胞を画像化します。卵母細胞の中央面で20分間隔で24時間画像を撮影します。
6. 非対称の細胞質分裂を経る細胞を特定することにより、極体(PB)を押し出す卵母細胞の数を定量化します。その結果、卵の隣と共有透明帯内に小さな細胞(PB)ができます。イメージングソフトウェアを使用して画像を表示します(ImageJ、 材料表を参照)。
7. 画像配列を画像解析ソフトウェアにインポートし、1つ以上の細胞が非対称の細胞質分裂を経験するまでフレームを進めます。全卵母細胞¹⁷のうちPBを押し出す卵母細胞の割合を算出する。

3. 減数分裂成熟期のセクリン-gfp分解パターンのモニタリング

1. 3 μLの セクリン-Gfp cRNAを19,283 x g で4°Cで30分間遠心分離(ステップ1.2)^{します 18}.
   注意: マイクロインジェクション中に針の詰まりを引き起こす可能性のある不純物の負荷を避けるために、上清を使用してください。
2. 以下の段階的な卵母細胞マイクロインジェクションは、参考文献¹²に広く記載されている。ステップ1.2で調製した100 ng/μLのSecurin-gfp cRNAを前期I-停止卵母細胞にマイクロインジェクションします。
3. マイクロインジェクション後、卵母細胞を_CO2 インキュベーター内で少なくとも3時間回収してRNAを翻訳させます。自動マルチチャンネル蛍光イメージングシステム( 材料表参照)で卵母細胞を観察して発現を確認し、GFPシグナルを表示します。
4. ステップ2.2で説明したように、5 μMのノコダゾールの有無にかかわらず150 μLの培養培地、および0.5 μMのリバーシンを含む150 μLの培養培地を96ウェルプレートの3つの異なるウェルにロードします。
5. マイクロインジェクションした卵母細胞を6滴のミリノンフリー培養培地で洗浄し、卵母細胞の1/3を各処理に移します。
6. ミルリノン洗浄の約3時間後に、卵母細胞が減数分裂を再開するまで、5%のCO₂ および80%の湿度で、プレートを37°Cのインキュベーターに保ちます。
   注:倍率が30x〜64xの実体顕微鏡を使用して、減数分裂再開の特徴として核エンベロープの破壊を評価します。
7. ステップ2.6に記載されるようにインキュベーターチャンバーを備えた蛍光顕微鏡を使用して卵母細胞成熟の画像を記録する。明視野設定を使用して、ウェル内の卵母細胞を見つけます。488フィルターを使用してSecurin-gfpシグナルを検出し、細胞が過剰に露出しないように蛍光強度を調整します。
   1. イメージングシステムが自動化されている場合は、各ウェル内の卵母細胞の位置を保存します。Securin-gfpは細胞質に均等に分布しているため、卵母細胞の中央面で20分間隔で24時間画像を撮影します。卵母細胞のグループを1枚の写真に収めるには、10倍などの低倍率の対物レンズを使用します。
8. 画像解析ソフトウェアを使用して、Securin-gfp破壊を定量化します。GFP チャネルの画像を開きます。時点 1 から開始します。好みの解析ソフトウェアでは、選択ツールまたは形状ツールを使用して各卵母細胞をマークし、各細胞の関心領域(ROI)を生成します。
   1. 同じROIを使用して、後で減算する背景領域を選択します。各ROIのGFPピクセル強度を測定します。
9. ステップ3.8で生成された各卵母細胞のROIを使用して、すべての時点でGFP強度を測定します。
   注意: 一部のソフトウェアプログラムでは、[分析]タブで測定機能を選択できます。
   1. 次に、次の時間枠に進み、このプロセスを繰り返して、各時間枠におけるGFPの強度を測定します。最後に、各GFP値に対して、ステップ3.8で選択したバックグラウンドでのROIの測定値を差し引きます。この分析により、各時点での各卵母細胞のSecurin-gfp強度の値が得られます。
10. セクリン破壊のパターンから異なるパラメータを抽出する:(a)セクリン-gfp分解が始まった時間。これは、SAC サイレンシングがいつ開始されたかを示します。(b)セクリン-gfp最小シグナルの時間。これは、SACサイレンシングが閾値レベルを下回ったときに、高いAPC/C活性化と完全なSecurin-GFP分解を可能にすることを示します。(c) セクリン-gfp破壊率¹⁹.これは、SAC活性がAPC/C活性化およびSecurin-GFP分解の閾値レベルを下回る速さを示します。

4. 減数分裂成熟期の免疫蛍光による動原体におけるMAD2の動員

注:卵母細胞の採取と成熟については、以前に発表されたレポート¹²を参照してください。

1. 卵母細胞を3つのグループに分けます。卵母細胞の各グループを100 μL滴のミリノンフリー培養培地に移します。滴を鉱油で覆い、インキュベーター(37°C、5%_CO2、湿度80%)に3時間、5時間、7時間入れて、それぞれ前中期初期I期、後期前中期I期、中期I期に到達させます。
   注意: 減数分裂成熟の定期的なタイミングに影響を与えるインキュベーターから同じ皿を数回取り出さないように、各時点を異なる皿に入れます。
2. 割り当てられた時点で、前述の9ウェルガラス皿を使用して、1x PHEMバッファー中の2%PFAの500 μL滴に卵母細胞を室温で20分間移し、卵母細胞を固定します²⁰。次に、細胞を500 μLドロップのブロッキング溶液(PBS + 0.3% BSA + 0.01% Tween-20 + 0.02% NaN₃)を含むクリーンウェルに移します。
   注:PHEM組成:60 mMパイプ;25 mM HEPES;10 mM EGTA;および2mMマグネシウム_Cl2。
   注:この時点で停止し、免疫蛍光を完了するのに都合の良い時間まで、4°Cの9ウェルプレートのブロッキング溶液に卵母細胞を保存することができます。
3. MAD2検出を継続するには、500 μL滴の透過処理溶液(PBS + 0.3% BSA + 0.1% TritonX-100 + 0.02% NaN₃)を含むクリーンウェルに卵母細胞を移します。室温で20分間インキュベートし、次いで細胞をブロッキング溶液の新しいウェルに移し、10分間インキュベートする。
4. 残りの免疫蛍光ステップでは、前述のようにくぼみのある96ウェルディッシュ蓋を使用します²⁰。光への露出と蒸発を避けるために、加湿された暗いチャンバーを使用してください。卵母細胞を抗MAD2抗体(1:1000、ウサギ)および抗セントロメア抗体(ACA)(1:30、ヒト)を含む30 μL滴のブロッキング溶液に移し( 材料の表を参照)、室温で2時間インキュベートします。
   注:96ウェルディッシュの蓋は、複数のタンパク質とグループを同時に処理するためのスペースを確保します。
5. 過剰な一次抗体を洗浄するには、細胞を0.5%トリトンを添加した1x PHEMバッファーの30 μL滴に移し、加湿チャンバーで10分間インキュベートします。この手順をさらに 2 回繰り返します。
6. 4回目の洗浄を行い、細胞を0.5%1xトリトンを含まない1x PHEMバッファーの30 μL滴に移し、10分間インキュベートします。
7. 抗ヒト-633(1:200)や抗ウサギ-568(1:200)などの二次抗体を含むブロッキング溶液30 μL滴に細胞を移し( 材料の表を参照)、室温で1時間インキュベートします。
   注:蛍光色素の組み合わせは、顕微鏡レーザーまたはフィルターに基づいて選択してください。
8. 過剰な二次抗体を洗浄するには、手順4.5〜4.6を繰り返します。
9. 細胞を顕微鏡スライドにマウントするには、DAPI(0.1 mg/mL)を含む10 μL滴の封入培地に細胞を移します( 材料の表を参照)。カバーガラスの各角にワセリンの小さなドットを追加し、それらをマウントメディアドロップの上に慎重に置き、ゆっくりと押して分散させます。透明なマニキュアを使用して、カバーガラスをスライドにシールします。実装プロセスの詳細な説明については、参考文献²⁰を参照してください。
10. 40倍または63倍の対物レンズを備えた共焦点顕微鏡( 材料表を参照)を使用した画像運動原体。ACAシグナルを使用して、染色体領域全体のイメージングを可能にするz範囲を決定します。
    メモ: 一部のイメージングシステムでは、4.0 の光学ズームと 0.5 μm の z ステップサイズを使用できます。これらのパラメータはシステムによって異なる場合があり、最適化が必要になります。
11. 画像解析ソフトを用いて動原体におけるMAD2強度を解析します。Z スタックの最大投影を作成し、チャネルを分割します。
12. まず、ACAチャネルを選択してACAチャネルを使用してマスクを作成し、すべての動原体信号を識別するしきい値を確立します。 編集 タブに移動し、選択を作成します。次に、この選択でROIを作成します。
13. MAD2チャンネルを選択し、手順4.12で作成した選択範囲を取り込みます。MAD2信号によりよく適応するしきい値方式を選択します。強度を測定します。
    注:対照処理で閾値法を選択し、異なる処理を分析するときは一定に保ちます。
14. 相対ピクセル強度の計算を行うには、各細胞の強度を実験中のWT卵母細胞の平均強度で割ります。

Results

ノコダゾール処理によるSAC応答性の評価
この実験の目的は、SACの活性化と強度を評価することです。ノコダゾールを使用して紡錘体微小管を解重合することにより、すべての動原体が付着しなくなり、SACを介した細胞周期停止を引き起こします。本画像化システムでは、DMSO処理されたコントロール卵母細胞は、ミルリノンから放出されてから約14時間後に極性体を押し出した(図1、上パネル)。SAC活性化と一致して、ノコダゾール処理された卵母細胞は中期Iで停止し、極性体を押し出さなかった(図1、中央のパネル)。このアッセイがSAC活性の信頼できる指標であることを実証するために、MPS1阻害剤であるリバーシンを使用してSAC活性化を予防しました²¹。SACが活性化できない場合、卵母細胞はKT-MTアタッチメントがないにもかかわらず極性体を押し出しました(図1、下のパネル)。SACが弱体化した卵...

Discussion

紡錘体アセンブリチェックポイントは、染色体分配エラーを防ぐために設計された細胞分裂中の重要な制御メカニズムです。これにより、セルは不適切なKT-MTアタッチメントを修正するのに十分な時間を確保できます。卵母細胞の減数分裂はエラーが発生しやすいプロセスであり、染色体の誤分離のほとんどは減数分裂I中に発生し、ヒトの早期流産と不妊の主な原因である異数性卵の生成につながります^1,24。女性の減数分裂に誤りがある理由を解きほぐすために、いくつかの仮説がテストされています。考えられる理由の1つは、SACが体細胞よりも効率が低く、1つ以上のKTの誤付着による後期発症を可能にする^{ことです9}、^10、25。したがって、卵母細胞におけるSACメカニズムの包括的な研究と主要な調節因子の特定は、倍数体卵を生成するプロセスを理解するために必要です。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ウシ血清アルブミン(BSA)	Sigma	A4503
DAPI	ライフテクノロジー	ズD1306
ジメチルスルホキシド(DMSO)	シグマ	D5879
ロバ抗ウサギ-Alexa-568	ライフテクノロジー	ズA10042
EVOS FLオートイメージングシステム	ライフテクノロジー		ズ蛍光顕微鏡
EVOS Onstage Incubator	Life Technologies		Incubator Chamber
Glass Bottom 96- well plates N 1.5 uncoated	MatTek Corporation	P96G-1.5-5-F
goat-anti-human-Alexa-633	Life Technologies	A21091
HEPES	Sigma	H3537
Human anti-ACA	Antibodies Incorporated	15-234	Dilution 1/30
ImageJ	NIH
KCl	Sigma	P5405
KH2PO4	Sigma	P5655
Leica SP8 は 63×、1.40 NA 油浸対物レンズ	Leica
MgSO4·7H20	Σ	M7774
ミルリノン	Σ	M4659
Na2HPO4Σ		S2429
NaCl	Σ	S5886
NaN3	Σ	S2002
ノコダゾール	Σ	M1404
パラホルマルギド (PFA)	Sigma	P6148
PIPES	Sigma	P6757
ウサギ抗 MAD2	バイオレジェンド	924601	希釈 1/1000; 以前はコーヴァンス #PRB-452C
リバーシン	ケイマン ケミカル	10004412
Triton-X	Sigma	274348
Tween-20	Sigma	X100
ベクタシールド	ベクター研究所	H-1000