このプロトコルでは、ダイバージェントプライマーを使用して細胞内の環状RNA(circRNA)レベルを正確に定量するためのデジタルドロップレットPCR(dd-PCR)の詳細な方法について説明します。
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この記事について
サマリー
要約
デジタル液滴ポリメラーゼ連鎖反応(dd-PCR)は、最も感度の高い定量方法の1つです。反応を約20,000個の油中水滴に分画し、PCRは個々の液滴で行われます。dd-PCRは、低存在量のターゲットの検出精度の向上、定量のための参照遺伝子の省略、サンプルの技術的な複製の排除、サンプル中の阻害剤に対する高い回復力を示すなど、従来のリアルタイムqPCRに比べていくつかの利点があります。最近、dd-PCRは、遺伝子発現解析および診断のために標的DNAまたはRNAを正確に定量するための最も一般的な方法の1つになっています。環状RNA(circRNA)は、最近発見された共有結合的に閉じたRNA分子の大きなファミリーで、5'末端と3'末端を欠いています。それらは、RNA結合タンパク質およびマイクロRNAのスポンジとして作用することによって遺伝子発現を調節することが示されている。さらに、circRNAは体液中に分泌され、エキソヌクレアーゼに対する耐性があるため、疾患診断のバイオマーカーとして機能します。本稿では、ダイバージェントプライマー設計、RNA抽出、cDNA合成、およびdd-PCR分析を実行して、細胞内の特定の環状RNA(circRNA)レベルを正確に定量する方法を示すことを目的としています。結論として、dd-PCRを用いたcircRNAの正確な定量を実証する。
概要
RNAシーケンシング技術と新しい計算アルゴリズムの最近の進歩により、環状RNA(circRNA)1と呼ばれるノンコーディングRNAファミリーの新しいメンバーが発見されました。名前が示すように、circRNAは自由末端を持たない一本鎖RNA分子のファミリーです。これらは、バックスプライシングと呼ばれる非標準的なヘッドツーテールスプライシングによって形成され、上流のスプライスアクセプター部位が下流のスプライスドナー部位と共有結合して安定したRNAサークルを形成します1,2。このプロセスは、環状エクソンの上流および下流に存在する逆Alu反復要素を含むいくつかの要因によって媒介されるか、またはいくつかのスプライシング因子またはRNA結合タンパク質(RBP)によって媒介される可能性があります2,3。エキソン配列またはイントロニック配列のみから生成された環状RNAは、エキソンcircRNAおよび環状イントロニックRNAまたはci-RNAに分類されますが、一部のエキソンcircRNAはイントロンを保持し、エクソン-イントロンcircRNA(EIcircRNA)と呼ばれます3,4
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プロトコル
RNAはRNaseに敏感です。したがって、すべての試薬、機器、およびワークスペースはRNaseを含まず、取り扱いには注意が必要です。
1. circRNAのダイバージェントプライマー設計( 図1参照)
- BEDToolsを使用してcircRNAアノテーションデータから、またはバックスプライス接合座標18,19の間に存在するエクソン/イントロン配列を結合することにより、UCSCゲノムブラウザーから成熟配列を取得します。
- 全長のcircRNA配列の最後の100ヌクレオチドを10のcircRNA配列の最初の100ヌクレオチドに結合することにより、長さ200ヌクレオチドのPCR鋳型配列を調製する。
注:circRNAの長さが200ヌクレオチド未満の場合は、それを2つの等しい半分に分割し、後半から前半の初めまでヌクレオチドを結合します。 - Primer3ウェブツールを使用して、120〜180ヌクレオチド長20の範囲のPCR産物長を設定することにより、プライマー設計に上記のテンプレート配列を....
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結果
各サンプル中のcircRNAの絶対数は、エクスポートされたdd-PCRデータから導き出すことができます。リアルタイム定量PCR分析は、分化したC2C12筋管細胞における circBnc2 の差次的発現を示唆した(データは示さず)。ここでは、増殖するC2C12筋芽細胞および筋管における circBnc2 の絶対コピー数を確認したいと考えました。 circBnc2 の発現は2つの条件で比較されるため、同じ試薬と手順を使用して、RNA単離、cDNA合成、およびPCRのためにすべてのサンプルを同時に処理することが非常に重要です。dd-PCR反応を用いてcircRNAの絶対定量を行うには、cDNA合成に等量の初期総RNAを使用して、全RNAナノグラムあたりの標的RNA分子の正確な数を計算する必要があります。例えば、cd-PCRアッセイを実行する前に、cDNA合成に1 μgの総RNAを使用し、ヌクレアーゼフリー水を使用して500 μLに希釈して最終濃度2 ng/μLを得ました(図1)。
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ディスカッション
CircRNAの研究は、ハイスループットシーケンシング技術の発見により、過去10年間で成長しました。その結果、将来のRNA治療薬の潜在的な分子と見なされています。さらに、癌や心血管疾患を含むいくつかの疾患においてバイオマーカーとして作用することが知られている4,8。しかしながら、circRNAの同定は、その存在量が少なく、親mRNA9と区別する1つの特異的バックスプライス接合配列しか持たないため、難しい。ダイバージェントプライマーを用いたRT-PCRは、その発見以来、circRNAを検証するためのゴールドスタンダード技術となっています9,10。circRNAの定量にはいくつかの分子法が開発されていますが、circRNAの発現は存在量が少ないため、正確に測定することは困難です。dd-PCRは、特定のサンプル14か.......
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開示事項
著者は利益相反を宣言しません。
謝辞
この研究は、生命科学研究所からの壁内資金、DBT研究助成金(BT / PR27622 / MED/30/1961/2018)、およびウェルカムトラスト/ DBTインドアライアンスフェローシップ[IA / I / 18/2/504017]によってサポートされましたアマレシュC.パンダに授与されました。論文を校正してくださった他の研究室メンバーに感謝します。
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 1.5 ml マイクロセンティフジ チューブ | ターソン | 500010 | |
| 0.2 ml チューブ ストリップ キャップ付き | ターソン | 610020、510073 | |
| フィルターチップ | ターソン | 528104 | |
| DNase/RNase-フリー蒸留水 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 10977023 | |
| リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) | シグマ | P4417 | |
| セルスクレーパー | HiMedia | TCP223 | |
| クロロホルム | SRL | 96764 | |
| DNA 希釈液 | HiMedia | MB228 | |
| ランダムプライマー | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 48190011 | |
| dNTP セット | サーモフィッシャーサイエンティフィック | R0181 | |
| マウス RNase 阻害剤 | NEB | M0314S | |
| マキシマリバース転写酵素 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | EP0743 | |
| QX200 dd-PCR Evagreen Supermix | Bio-Rad | 1864033 | |
| 液滴発生オイル Evagreen | Bio-Rad | 1864006 | |
| PCR プレート ヒートシール、ホイル、ピアス可能な | Bio-Rad | 1814040 | |
| DG8 カートリッジおよびガスケット | Bio-Rad | 1864007 | |
| DG8 カートリッジホルダー | Bio-Rad | 1863051 | |
| QX200 Droplet Generator | Bio-Rad | 1864002 | |
| ddPCR 96-Well Plates | Bio-Rad | 12001925 | |
| PX1 PCR Plate Sealer | Bio-Rad | 1814000 | |
| C1000 Touch Thermal Cycler with 96–ディープウェル反応モジュール | Bio-Rad | 1851197 | |
| QX200 Droplet Reader | Bio-Rad | 1864003 | |
| Quantasoft Software | Bio-Rad | 1864011 | |
| Silica column | Umbrella Life Science | 38220090 | |
| UCSC Genome Browser | https://genome.ucsc.edu/ | ||
| Primer 3 |
参考文献
- Salzman, J., Gawad, C., Wang, P. L., Lacayo, N., Brown, P. O. Circular RNAs are the predominant transcript isoform from hundreds of human genes in diverse cell types. PLoS One. 7 (2), 30733(2012).
- Chen, L. L., Yang, L. Regulation of circRNA biogenesis. RNA Biology. ....
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再版と許可
