ここでは、初代ヒト脳微小血管内皮細胞、アストロサイト、周皮細胞に基づく血液脳関門のトリプルセル培養モデルの確立方法について述べる。この多細胞モデルは、 in vitro での虚血性脳卒中中の神経血管ユニット機能障害の研究や薬剤候補のスクリーニングに適しています。
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この記事について
サマリー
要約
虚血性脳卒中は、世界中の主要な死因および障害であり、治療の選択肢は限られています。虚血性脳卒中の神経病理学は、細胞死および認知機能障害につながる脳への血液供給の中断によって特徴付けられる。虚血性脳卒中中および脳卒中後、血液脳関門(BBB)機能障害は傷害の進行を促進し、患者の回復不良の一因となります。現在のBBBモデルには、主に内皮単培養と、星状細胞または周皮細胞のいずれかとの二重共培養が含まれます。
このようなモデルは、細胞間コミュニケーションに不可欠な動的な脳微小環境を完全に模倣する能力を欠いています。さらに、一般的に使用されるBBBモデルには、翻訳制限をもたらす不死化ヒトリンパ管内皮細胞または動物由来(げっ歯類、ブタ、またはウシ)細胞培養物が含まれていることがよくあります。この論文では、初代ヒト細胞(脳微小血管内皮細胞、星状細胞、および脳血管周皮細胞)のみを含む新しいウェルインサートベースのBBBモデルについて説明し、 in vitroで虚血性脳損傷の調査を可能にします。
バリアの完全性に対する酸素-グルコース欠乏(OGD)の影響は、受動的透過性、経内皮電気抵抗(TEER)測定、および低酸素細胞の直接視覚化によって評価されました。提示されたプロトコルは、 インビボでのBBBの細胞間環境を模倣する明確な利点を提供し、虚血性脳損傷の設定における新しい治療戦略を開発するためのより現実的な インビトロ BBBモデルとして機能します。
概要
脳卒中は、世界中の主要な死因および長期障害の1つです1。脳卒中の発生率は年齢とともに急速に増加し、55歳以降10年ごとに倍増します2。虚血性脳卒中は、血栓性および塞栓性イベントによる脳血流障害の結果として発生し、これはすべての脳卒中症例の80%以上を網羅しています3。現在でも、虚血性脳卒中後の組織死を最小限に抑えるために利用できる治療選択肢は比較的少ない。存在する治療法は時間に敏感であり、その結果、必ずしも良好な臨床転帰につながるとは限りません。したがって、脳卒中後の回復に影響を与える虚血性脳卒中の複雑な細胞メカニズムの研究が急務です。
BBBは、血液と脳実質の間の分子交換のための動的インターフェースです。構造的には、BBBは、基底膜に囲まれた接合複合体によって相互接続された脳微小血管内皮細胞、周皮細胞、および星状細胞端部4で構成されています。周皮細胞および星状細胞は、強力でタイトな接合部の形成に必要な様々な因子の分泌を通じて、BBBの完全性の維持に不可欠な役割を果たす5,6。BBBの内訳は、虚血性脳卒中の特徴の1つです。脳虚血に関連する急性炎症反応および酸化ストレスは、タイトジャンクションタンパク質複合体の破壊および星状細胞、周皮細胞、および内皮細胞間の調節不全のクロストークをもたらし、BBB7全体の傍細胞溶質透過性の増加をもたらす。BBB機能障害は、脳浮腫の形成をさらに促進し、出血性変換のリスクを高めます8。上記のすべてを考慮すると、虚血性脳卒中中および脳卒中後にBBBレベルで発生する分子および細胞の変化を理解することに大きな関心があります。
多くのin vitro BBBモデルがここ数十年にわたって開発され、さまざまな研究で使用されてきましたが、それらのどれもin vivo条件を完全に複製することはできません9。一部のモデルは、ウェルインサート透過性支持体上で単独で、または周皮細胞または星状細胞と組み合わせて培養された内皮細胞単層に基づいていますが、トリプルセル培養モデル設計を導入しているのは最近の研究だけです。ほとんどすべての既存の三重培養BBBモデルは、動物種またはヒト多能性幹細胞に由来する細胞から単離された星状細胞および周皮細胞と共に初代脳内皮細胞を組み込んでいる10、11、12、13。
ヒトBBBをin vitroでよりよく再現する必要性を認識し、ヒト脳微小血管内皮細胞(HBMEC)、初代ヒトアストロサイト(HA)、および初代ヒト脳血管周皮細胞(HBVP)で構成されるトリプルセル培養in vitroBBBモデルを確立しました。このトリプルカルチャーBBBモデルは、孔径0.4 μmの6ウェルプレートポリエステルメンブレンインサート上にセットアップされます。これらのウェルインサートは、細胞接着に最適な環境を提供し、培地サンプリングまたは化合物塗布のために頂端(血液)コンパートメントと基底外側(脳)コンパートメントの両方に簡単にアクセスできます。この提案されたトリプルセル培養BBBモデルの特徴は、酸素(<1%O2)と栄養素の不足(グルコースフリー培地を使用)が加湿された密閉チャンバーを使用して達成された、虚血性脳卒中を模倣したOGD後のTEERおよび傍細胞フラックスを測定することによって評価されます。さらに、このモデルで誘導された虚血様条件は、低酸素細胞を直接可視化することによって正確に検証されます。
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プロトコル
注意: このプロトコルで使用されるすべてのセル、材料、機器、およびソリューションに関連する詳細については、 材料の表 を参照してください。
1. トリプルセル培養BBBモデル設定
- 周皮細胞の播種
- 細胞接着のために活性化された表面を有するT75培養フラスコ内でHBVPを、5%CO2 インキュベーター内で、コンフルエントになるまで37°Cで培養する。コンフルエントに達したら、古い周皮細胞培地を吸引し、5 mLの温かいダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)で細胞を洗浄します。DPBSを吸引し、4 mLの温かいトリプシン-EDTA溶液と1 mLのDPBSの組み合わせを使用して、フラスコから細胞を剥離します。
注: P7 より後のパッセージは使用しないでください。 - フラスコをCO2 インキュベーター内で37°Cで5分間インキュベートする。細胞がフラスコから剥離しているかどうかを確認するために顕微鏡で観察する。5 mLの温かい周皮細胞培地(2%ウシ胎児血清[FBS]を含む)をフラスコに加え、剥離した細胞を50 mLの遠沈管に移します。
- 細胞懸濁液を200 × gで3分間遠心分離し、細胞がチューブの底にペレットを形成できるようにします。チューブから培地を吸引し、細胞ペレットが無傷のままであることを確認します。
- 細胞ペレットを周皮細胞培地に再懸濁する;細胞の合流点と必要なウェルインサートの数に応じて培地の量を計算します。再懸濁した細胞を10 μL取り、細胞カウントスライドに入れ、細胞数をカウントします。
- 細胞密度を決定し、1 mLの周皮細胞培地に300,000細胞/インサートをウェルインサート(6ウェルフォーマット)の腺側に播種します。
注:インサートの下側にHBVPをシードする場合は、最初にウェルインサートプレートを逆さまに裏返すことが非常に重要です。プレートを表面に平らに置いた状態で、底部を取り外してウェルインサートのアブミナル側を露出させます。果皮細胞懸濁液をアブミナル側に加えた後、蒸発を防ぐためにウェルインサートを反転プレートで覆います。すべてのプレートを逆さまにして、37°Cの5%CO2 インキュベーターで一晩保持します。
- 細胞接着のために活性化された表面を有するT75培養フラスコ内でHBVPを、5%CO2 インキュベーター内で、コンフルエントになるまで37°Cで培養する。コンフルエントに達したら、古い周皮細胞培地を吸引し、5 mLの温かいダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)で細胞を洗浄します。DPBSを吸引し、4 mLの温かいトリプシン-EDTA溶液と1 mLのDPBSの組み合わせを使用して、フラスコから細胞を剥離します。
- アストロサイトの播種
- コンフルエントに達するまで、5%CO2
- コンフルエントに達するまで、5%CO2
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結果
HBMECのバリア機能に対するアストロサイトと周皮細胞の影響を調べるために、細胞培養インサート上のトリプルセル培養BBBモデル(図1A)と、HBMEC単培養および2つの二重共培養モデルをコントロールとして構築しました(図1B)。二重共培養コントロールには、HBMECとHAの非接触共培養およびHBMECとHBVPの接触共培養が含まれていました。共培養で6日後、すべての実験セットアップを4時間OGDに供した。示されたBBB構成における内皮単層のバリア完全性は、OGDの前後、および再酸素化の24時間後にTEERを決定することによって評価されました(図1C)。4時間の間、OGDは、HBMEC単培養およびHBMECおよびHBVPとの共培養モデルでのみTEER値の有意な減少を引き起こした。これらの減少したレベルは、24時間の再酸素化後にベースラインレベルに達しました。.HBMECおよびHAとの共培養モデルに対するOGDの効果は、 in vitroの虚血状...
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ディスカッション
このプロトコールでは、イン ビトロで虚血性脳卒中の設定におけるBBB機能障害を研究するための信頼性の高い三重内皮細胞・周皮・アストロサイト培養BBBモデルをセットアップする方法を記載する。周皮細胞が インビボで 内皮細胞の最も近い隣接であることを考慮すると、HBVPは、このモデル16においてウェルインサートの下側に播種されている。この配置は、アストロサイトと内皮細胞との間の直接的な細胞間コミュニケーションを欠いているが、この配置は、分泌された可溶性因子 を介した 細胞型間の間接的な細胞間コミュニケーションを可能にする。この系に星状細胞と周皮細胞が存在すると、HBMECの完全性が大幅に向上し、単層の細胞透過性が小さいサイズのトレーサーに制限されます。さらに、星状細胞および周皮細胞は、OGD状態においてHBMECに対して保護効果を有する。
開発したプロトコルでは、細胞比(1:1:1)と基底外側コンパートメントの培地混合物を最適化しました。トリプルBBBモデルは、適切なHBMEC単層形成...
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開示事項
すべての著者は、利益相反がないことを明らかにしました。
謝辞
この研究は、国立衛生研究所(NIH)の助成金MH128022、MH122235、MH072567、MH122235、HL126559、DA044579、DA039576、DA040537、DA050528、およびDA047157によってサポートされました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 24 mmトランズウェル、0.4 & マイクロ;m 細孔ポリエステル膜インサート | コーニング | 3450 | |
| 35 mm ガラス底皿 | MatTek ライフサイエンス (FISHERSCI) | P35GC-1.5-14-C | |
| アストロサイト 培地 | 科学細胞 | 1801 | |
| 接着因子 | 細胞システム (フィッシャーサイエンティフィック) | 4Z0-201 | |
| BD 60 mL シリンジ | BD | 309653 | |
| BrainPhys イメージング最適化された培地 | STEMCELL Technologies | 5791 | |
| 血清とCultureBoost | 4Z0-500 | セルシステム | |
| Corning 50 mL PP 遠心分離チューブ (CentriStar キャップ | 付き円錐底 VWR | 430829 | |
| Corning 75cm²U字型傾斜ネック未処理細胞培養フラスコ | Corning | 431464U | |
| Corning CellBIND 96ウェル フラットクリアボトム ブラックポリスチレンマイクロプレート | Corning | 3340 | |
| Countes Cell Counting Chamber Slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | ZGEXSCCOUNTESS2FL | |
| Decon CiDehol 70 Isopropyl Alcohol Solution | フィッシャーサイエンティフィック | 04-355-71 | |
| シャーレ | VWR25384-088DMEM | ||
| 培地(グルコースなし、グルタミンなし、フェノールレッドなし) | サーモフィ | ッシャーA14430-01 | グルコースフリー培地 |
| DPBS(カルシウムなし、マグネシウムなし) | サーモフィッシャー | 14190250 | |
| EBM内皮細胞増殖基礎培地、フェノールレッドフリー、500mL | ロンザ | CC-3129 | |
| EVOM2 STX2電極付き上皮電圧/オーム(TEER)計 | World Precison Instruments NC9792051 | 上皮電圧計 | |
| フルオレセインイソチオシアネート–デキストラン(重量20,000) | ミリポアシグマ | FD20-250MG | |
| フルオレセインイソチオシアネート–デキストラン (重量 70,000) | ミリポアシグマ | FD70S-250MG | |
| Fluorview FV3000 共焦点顕微鏡 | オリンパス | FV3000 | |
| ガスタンク (95% N2, 5% CO2) | エアガス | X02NI95C2003071 | |
| HBSS (カルシウム、マグネシウム、フェノールレッド) | モフィッシャー | 14025092 | |
| Hoechst 33342、三塩酸塩、三水和物 - 10 mg/mL 水溶液 | ThermoFisher | H3570 | |
| ヒト アストロサイト | Science Cell | 1800 | |
| ヒト脳血管周皮細胞 | Science Cell | 1200 | |
| 低酸素インキュベーターチャンバー | STEMCELL Technologies | 27310 | |
| Image-iT Green Hypoxia Reagent | ThermoFisher | I14834 | |
| ペリサイト培地 | 科学細胞 | 1201 | |
| 初代ヒト脳 微小血管内皮細胞 | ACBRI 376 | 細胞システム | |
| ロッキングプラットフォーム シェーカー、ダブル | VWR | 10860-658 | |
| シングルフローメーター | STEMCELL Technologies | 27311 | |
| SpectraMax iD3 マイクロプレートリーダー | 分子デバイス | 75886-128 | |
| シリンジフィルター、25 mm、0.22 μm、PVDF、滅菌済み | NEST Scientific | 380121 | |
| TPP マルチウェルプレート (6 ウェル) | MidSci | TP92406 | |
| TPP 組織培養フラスコ T-75 フラスコ | 接着用活性化表面付き | MidSci | TP90075 |
| トリプシン-EDTA (0.25%)、フェノールレッド | サーモフィッシャー | 25200056 | |
| UltraPure 蒸留水 | Invitrogen (Life Technologies) | 10977-015 | |
| 宇野ステージトップインキュベーター- | おこラボ | UNO-T-H-CO2-TTL |
参考文献
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