方法論記事

新熱帯性無尿類におけるさまざまなスケールでのバイオマーカーを評価するための生態毒性学的方法論

DOI：

10.3791/64520

⸱

2023年4月28日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Instituto de Química de San Luis (INQUISAL), Consejo Nacional de Investigaciones Científicas Y Técnicas (CONICET), Facultad de Ciencias de la Salud (FCS), Universidad Nacional de San Luis (UNSL), 2Departamento de Ciencias Ambientales y Producción, Universidad Nacional de Los Comechingones (UNLC), 3Laboratório de Patologia Experimental - LAPEx, Instituto de Biociências - INBIO Universidade Federal de Mato Grosso do Sul, 4Cátedra de Citología, Facultad de Ciencias Naturales y Museo, Universidad Nacional de La Plata, 5Área de Biología, Departamento de Biología, Facultad de Química, Bioquímica y Farmacia, Universidad Nacional de San Luis (UNSL), 6Instituto de Recursos Biológicos, Centro de Investigaciones de Recursos Naturales (CIRN), Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA), 7Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET)

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この論文では、新熱帯無尾類種のバイオマーカーを評価するための標準化された生態毒性学的方法を紹介します。具体的には、この論文では、遺伝的、細胞組織学的、生化学的、形態学的、および個々のレベルなど、生態毒性学的評価のさまざまなスケールでのいくつかの方法論について詳しく説明します。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

生態毒性学における新たな疑問は、環境ストレス要因が生物に及ぼす影響の解釈だけでなく、その影響の可能性の判断も改善する生態毒性学的予測をもたらすため、一連のバイオマーカーを適用することの重要性を強調しています。組織のさまざまなレベルで生態毒性バイオマーカーを使用すると、環境ストレス要因に対する生物の生物学的応答を予測でき、環境リスク評価に役立つことはよく知られています。

しかし、観察された効果の性質や変動を解明するためには、基本的な手順の最適化を検討し、対照群で履歴データを作成し、臓器や組織での応答を評価するための特定のバイオアッセイを採用する必要があります。したがって、本研究は、さまざまな生態学的レベルで新熱帯無尿類のすべての段階で採用されているいくつかの生態毒性学的方法論を説明し、それらを野生生物と実験室条件の両方で使用される有用なバイオマーカーとして検証することを目的としています。本研究では、これらのバイオマーカーを個体/生物レベル(体調指数)、組織学的/生理学的レベル(病理組織学、組織測定、色素解析)、生化学的レベル(酸化ストレス酵素)、遺伝的レベル(コメットアッセイによるDNAの直接的および酸化的損傷)に適用しました。

これらの方法論は、種によってわずかなバリエーションや変更がありますが、これらの技術は、水生および陸生生態系の有用な指標種となる特定の特性を持つ無尾類に対する生体異物の影響を評価するための効果的なバイオマーカーを提供します。結論として、本研究で採用された一連のバイオマーカーは、新熱帯性無尾類の毒性反応を推定するのに十分であることが証明されており、汚染物質が地域の水生生態系に与える影響を特定するためのバイオ指標としてさらに推奨できます。最後に、特定の領域の無尾類に対するこれらの重要なバイオマーカーの標準化を達成し、リスク評価と意思決定にそれらを含めることが推奨される。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

環境ストレス要因の天然水域への投入は、水生生態系の健康に影響を与える可能性があります1。これらの環境ストレス要因への曝露は、直接曝露(短期および長期の両方)を含むさまざまな毒性メカニズムを通じて、水生生物の生存または適応度に影響を与える可能性があります2。したがって、フィットネスと生存に関連する毒物学的エンドポイントを評価するための標準化された実験室バイオアッセイは、現場でのストレスの多くの間接的な影響の信頼性の低い推定値である可能性があります。さらに、正常な生理学的レベルの変化や個体への影響(例えば、獲物の捕獲など)は、生物の生存と生殖適応度、ひいては生態系の健康への影響を長期的に示すより良い指標となる可能性がある1,3。既知の環境パラメータと汚染物質濃度に基づいて、生態系の構成と機能、および生物の健康の変化を予測することは、汚染管理を改善するために重要です1。

バイオマーカーは、生体異物化学物質への曝露またはその影響による生化学的、生理学的、または組織学的変化として定義されます4,5。バイオマーカーは、早期警告信号として非常に有用であることが証明されています4,5。バイオマーカーが答えるのに役立つ重要な問題は、特定のストレッサーが環境中に悪影響を引き起こすほど高濃度に存在するかどうかです。この情報は、損害の性質と程度、および原因物質を調査する価値があるかどうか、またはその場合にこれ以上リソースを投資すべきではないかどうかの評価に貢献します6,7,8。また、単一のバイオマーカーをバイオ指標として評価するという概念では不十分である可能性があるため5,7,8,9,10、早期に警告サインを検知し、生態系への不可逆的な影響を防ぐために、複数のバイオマーカーを包括的に評価する傾向が強まっています。

すべての毒性影響は、ストレッサーと生体分子との相互作用から始まることに注意することが非常に重要です。この意味で、影響は、生化学的、細胞内、細胞、組織、器官、個体、集団、コミュニティ、生態系、景観、および生物圏の組織レベルを通じてカスケードできます。細胞は、環境ストレス要因と生物学的システムとの間の相互作用の主要な場所です。したがって、分子的および遺伝的影響を理解することで、研究者は低レベルの生態学的組織と高レベルの生態学的組織を関連付けることができ、まだテストされていない環境汚染物質、たとえば人間の健康への影響を予測するのに役立ちます5。さらに、細胞の特異性が高いため、細胞は環境汚染物質の評価だけでなく、人間の健康の評価にも有用です5,11。したがって、ストレッサーの影響を生化学的レベルで理解することで、観察された影響の原因についての洞察が得られ、それらを次に高いレベルのものと関連付けることができるかもしれません5。さらに、ストレッサーの生化学的メカニズムを理解することにより、まだ毒性学的に評価されていない新しいストレッサーの影響を、機能の類似性に基づいて他のよく知られた汚染物質と比較して予測できます。さまざまな環境ストレス要因の存在下では、遺伝的および生化学的バイオマーカーが観察された特定の影響に関する貴重な情報を提供する可能性があります。これに加えて、生化学的変化に関連する組織化学的評価は、毒物力学に関する情報を提供することができます5。要するに、細胞、生化学的、および組織学的バイオマーカーの包括的な分析が必要であり10,12、このタイプの分析は、次に、局所種のバイオモニタリングプログラムに含める必要があります5,13,14。

それにもかかわらず、実験室条件下でのバイオマーカーの研究は、汚染物質への曝露後の亜致死的影響および慢性的な影響の検出、および採用された方法の検証および標準化の困難、複雑な時間または用量依存の応答、適応度への不明瞭または未確定の関連、および統合されたメカニズムモデルの欠如を含む、いくつかの困難を提示する可能性があります1。4.これらの問題を解決するための解決策は、測定されるバイオマーカーの数を増やすことではなく、生物全体に対する化学的影響のメカニズム的基盤を説明するのに役立つ研究と検証可能な仮説を慎重に設計することです4。

生態毒性学における新たな疑問は、環境ストレス要因が生物に及ぼす影響の解釈を改善する生態毒性学的予測を生成するために、一連のバイオマーカーを適用することの重要性を強調しています。また、その影響の可能性についての意思決定も改善します。さらに、環境リスク評価とバイオモニタリングにおいて、バイオマーカーとバイオインジケーターの両方の概念を組み合わせることの重要性は、研究者が特定の対象環境の生物が生理学的に正常であるか、ストレスを受けているかを判断できるようになることです。この研究で採用されたアプローチは、人間で行われる生化学的分析のアプローチと似ています。この意味で、生物が野外と実験室の両方で健康であるかどうかを確認するために、一連のバイオマーカーを分析することができる6。最後に、バイオマーカーは、(1)希少種および/または長命種の曝露を評価する、および(2)生物学的組織のさまざまなレベルでの化学的影響のメカニズムに関する仮説を検証する、という2つの方法で生態学的リスク評価に貢献します4。

過去10年間で、バイオマーカーは、細胞傷害性および遺伝毒性汚染物質への曝露をバイオモニタリングするために無尿類で使用されてきました。これらの中で、最も頻繁に使用されている技術は、小核(MN)アッセイとコメットアッセイ、またはシングルセルゲル電気泳動(SCGE)アッセイによる一本鎖DNA切断の誘導です。さらに、これらの技術は、いくつかの新熱帯性無尾類14,15,16,17,18,19におけるさまざまな環境ストレス要因によって誘発されるDNA損傷を推定するために成功裏に使用されてきました。他のバイオマーカーは、環境汚染物質16,17,18,19に曝露された生物の酸化状態の変化を調べるために使用できる。酸化ストレスは、さまざまな生体異物への曝露に対する反応であり、曝露された個人の抗酸化能力5,6,7,19,20を含むいくつかの有害な影響につながります。

生態毒性学の研究では、生物指標種は、より高い組織レベル(例えば、生物、個体群、コミュニティ、および生態系レベル)での環境ストレス要因の長期的な相互作用と悪影響を特定する生物であるため、使用されます10,20,21。バイオマーカーとバイオインジケーターという2つの概念を統合することにより、生物組織の1つ以上のレベルで測定された生物学的影響と相関または関連する生化学的、生理学的、または生態学的構造またはプロセスを広く定義するために、種をスクリーニングすることができます。最後に、ストレッサーの毒性の推定値を改善するために両方の概念を利用するという大きな課題は、生態学的リスクの評価に高い有用性を持つバイオマーカーとバイオインジケーターの分析に関連しています20。この意味で、バイオマーカーとバイオインジケーターを早期警告サインとして採用することの関連性についてはコンセンサスがあり、それらは環境ストレス要因12,20,21に対する試験生物の反応に関する関連情報を提供する。

両生類は、世界で最も脅威にさらされ、急速に減少している生物群の1つです。この減少の主な理由の1つは、農薬、金属、新興汚染物質22,23,24,25など、生息地に侵入する汚染物質です。アヌランには、透過性の皮膚、水との密接な関係、環境汚染に対する感受性など、バイオ指標種として役立ついくつかの特徴があります2,23,24。これらの特性により、両生類は環境衛生の効果的な生物指標になります7,8,22,23,24,26。

しかし、基本的な手順の最適化や対照群でのヒストリカルデータの生成だけでなく、臓器や組織での応答を評価するための特定のバイオアッセイを用いて、バイオインジケーターで観察される効果の性質や変動を解明する必要があります。この意味で、本研究は、さまざまな生態学的レベルで新熱帯無尾類のすべての段階で使用されるいくつかの生態毒性学的方法論を説明し、それらを野生生物と実験室の両方の条件で使用される有用なバイオマーカーとして検証することを目的としています。この研究は、統合される可能性があり、環境ストレス要因にさらされた無尾類の実験室および野生生物のバイオモニタリングで証明された一連のバイオマーカーを示しています。

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プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

以下の技術には、国際的な倫理基準46,47,48に従って行われた動物の以前の犠牲、およびその後の臓器の解剖および切除が含まれる。動物は、サンルイス州の環境・農業・生産省の許可の下で捕獲されました(決議49-PMA2019)。動物の犠牲と安楽死の方法は、サンルイス国立大学の施設動物管理および使用委員会(CICUA、プロトコルQ-322/19)のプロトコルによって正式に承認されました。無尾類生物を用いた手順は、Garber et al.46、CONICET47、および INTA48 に詳述されているガイドラインに従って実施されました。さらに、ここで紹介するすべてのプロトコルは、幼虫および成虫のライフステージにある新熱帯無尾類種を対象としています。それらはすでに地元の研究者によって広く受け入れられており、厳格なプロトコルの下で、関係する各大学の「Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales(CICUA)」からの許可を得て実施されています。使用される材料とソリューションのリストは、材料の表と表1に示されています。

1.個人レベル:体調と肝臓および生殖腺指数

  1. ボディコンディションインデックス:スケール質量指数
    注:このインデックスは、成虫と幼虫の両方で使用できます。この方法論はPeig and Green27に基づいており、Brodeur et al.28,30およびMacCracken and Stebbings29に従って無尾類に若干の修正が加えられています。
    1. 精密な分析スケールを使用して、各検体の体重を記録します。
    2. 各標本をミリメートルシートに置き、~15cmの距離で写真を撮ります。
      注意: 常に同じ距離から写真を撮ることが重要です。
    3. 写真分析:
      注:写真は、オンライン(https://imagej.nih.gov/ij/index.html)で無料で利用できるImageJプログラム、または写真に含まれるスケールから測定を行うことができる他の画像分析プログラムを使用して分析できます。
      1. ImageJプログラムの 測定ツールを使用して 各標本の鼻孔長(SVL)を測定し、最初にミリメートルシートの既知の測定値を参照します。
        注:オタマジャクシでは、体長の測定は、尾びれを無視して、総排泄腔まで行う必要があります。
    4. スケーリングされた質量指数(S)
      1. 各アヌランの体重とSVLから得られたデータを使用して、SVL(x軸)に対する体重(y軸)の非線形べき乗関数回帰線を構築します。
      2. 調査対象の母集団から測定されたすべての個人のSVLデータを使用して、平均長さを計算します。
      3. 最後に、式 (1) を使用して、Peig and Green27 および Brodeur et al.28 に従ってスケーリングされた質量指数 (S) を計算します。
        S = Mi(L0/Li)b (1)
        ここで、Mi と Li は、それぞれ個々の i の体重と SVL です。bは、非線形べき関数回帰28によって推定されたスケーリング指数です。L0 は、調査対象の母集団の平均長さです。S は、SVL が L0 値に標準化されている場合の個々の i の予測体重です。
        注:bは種特異的な定数であり、性的に二形性の種でも性特異的である可能性があることに注意することが重要です。
  2. 肝体指数:スケーリングされた肝臓指数
    注:体調指数については、この指数は発達のあらゆる段階の個人で使用できます。この方法論は、Brodeur et al.28に基づいています。
    1. ステップ1.1.2およびステップ1.1.3に従って各検体のSVLを記録します。
    2. 無尾類両生類の倫理基準に従って個人を安楽死させる46,47,48。
    3. 肝臓全体を取り出し、その質量をミリグラム単位で精密な分析スケールで記録します。
    4. 各アヌランの肝臓の質量とSVLから得られたデータを使用して、SVL(x軸)に対する肝臓の質量(y軸)の非線形べき乗関数回帰線を作成します。
    5. 調査対象の母集団から測定されたすべての個人のSVLデータを使用して、平均長さを計算します。
    6. 式 (2) を使用して、Brodeur et al.28 に従ってスケーリングされた肝臓指数 (SLI) を計算します。
      SLI = Lmi (L0/Li)b (2)
      ここで、Lmi と Li は、それぞれ個々の i の肝臓質量と SVL です。bは、非線形べき関数回帰28によって推定されたスケーリング指数です。L0 は、調査対象の母集団の平均長さです。SLI は、SVL が L0 に標準化されている場合の個々の i の予測肝臓質量です。
  3. 生殖腺指数:スケーリングされた生殖腺指数
    注:この方法論はBrodeur et al.30 に基づいており、成人の個人にのみ有用です。男性と女性のインデックスは、異なるスケールで異なるため、別々に分析する必要があることに注意することが重要です。
    1. ステップ1.1.2およびステップ1.1.3に従って各検体のSVLを記録します。
    2. 無尾類両生類の倫理基準に従って個人を安楽死させる46,47,48。
    3. 左右の生殖腺を切除し、精密な分析スケールで質量をミリグラム単位で記録します。
    4. 各アヌランの生殖腺の質量とSVLから得られたデータを使用して、ステップ1.1.4.1およびステップ1.2.3と同様に、生殖腺の質量(y軸)とSVL(x軸)の非線形べき乗関数回帰線を構築します。
    5. 調査対象の母集団から測定されたすべての個人のSVLデータを使用して、平均長さを計算します。
    6. 式 (3) を使用して、各動物の Brodeur et al.30 に従ってスケーリングされた生殖腺指数 (SGI) を推定します。
      SGI = Gmi(L0/Li)b (3)
      ここで、Gmi と Li はそれぞれ個々の i の生殖腺質量と SVL、b は Brodeur et al.30 による非線形べき乗関数回帰によって推定されたスケーリング指数、L0 は調査対象の集団の平均長さ、SGI は SVL が L0 に標準化された場合の個々の i の予測生殖腺質量です。

2.形態学的組織学的レベル

注:この分析には、組織学的切片を使用する必要があります。最初のステップは、組織を収集することです。

  1. 固定と脱水
    1. 固定液を使用して構造を保存します。無尾路組織には、他の固定溶液よりも推奨されるメタカンまたはブイン溶液を使用することが望ましいです(表1)。
      注:使用時にはすべての物質を混合する必要があります。
    2. オタマジャクシまたは50〜100 mgの組織片を、1〜2 mLの固定液を入れた円錐形のチューブに入れ、4°Cで3時間放置します。ティッシュを同量の70%エチルアルコールで30分間洗浄します。
    3. ティッシュを新鮮な70%エチルアルコール溶液に入れます。
      注:この時点で、脱水症状を続ける前に数日間手順を停止することができます。
    4. 一連のアルコール溶液で組織を脱水します:エチルアルコール80%(10分)、アルコール90%(10分)、エチルアルコール100%(10分)、エチルアルコール100%(10分)。
    5. キシレンで2 x 10分間ダイアファニゼーション(クリア)を行います。
    6. パラフィンをビーカーで溶かします。ティッシュペーパーを10分間浸します。組織を取り出し、溶かしたパラフィンを入れた組織型に入れます。室温で固まるのを待ちます。
    7. 回転するミクロトーム上に作製した3μm切片をスライドガラス上に置きます。
  2. 組織測定分析
    1. 組織切片をヘマトキシリン-エオシン31で染色します。
    2. 10-20枚の顕微鏡写真を使用して、光学顕微鏡で100倍対物レンズで測定します。各顕微鏡写真で5〜10個の肝細胞を解析します。
      注:ここでは、肝臓をモデルとして使用して、この技術を説明しました。他の組織を使用することも可能です。使用する光学顕微鏡の対物レンズが組織の種類に適していることを確認してください。測定する細胞を見て識別できる必要があります。
  3. 病理組織学
    1. ヘマトキシリン-エオシン32で組織切片を染色した後、10倍、20倍、40倍、および100倍の対物レンズで5〜10個の組織切片を調べます。
    2. 組織の変化を探し、式 (4) を使用して Bernet et al.32 で説明されている組織変化の程度 (DTC) 指数を推定します。
      DTC =Σalt。(×W)   (4)
      ここで、Σaltは変化の合計です。a はダメージ ステージ (0、存在しない、1、低い、2、中程度、3、高い) を表します。w はダメージの可逆性を表します (1、可逆的、2、部分的に可逆的、3、不可逆的)。
      注:ここでは、肝臓をモデルとして使用して、この技術を説明しました。他の組織を使用することも可能です。使用する光学顕微鏡の対物レンズが組織の種類に適していることを確認してください。
  4. 色素系
    1. スライドをヘマトキシリン-エオシンで染色した後、20倍の対物レンズで10〜20枚の顕微鏡写真を調べます。
    2. Santos et al.33によると、Image Pro-Plusソフトウェアを使用して染色強度の違いを測定することにより、メラニンが占める領域を定量化します。
    3. ソフトウェアImage Pro Plus 6.0®を開きます。
    4. メニューとツールバー:生物学的を選択します。
    5. 顕微鏡写真の撮影に使用する 倍率の空間キャリブレーション を選択します。
    6. 組織学的画像を開きます。
    7. ツール数を選択 |オブジェクトを測定します。
    8. [色の選択]ボタンをクリックします。
    9. スポイトツールを選択し、画像で測定する色をマークします。
    10. ウィンドウを閉じて、[ カウント]をクリックします。
    11. [表示] |統計を使用して結果を確認します。

3. 生化学的レベル:活性酸素種(ROS)およびコリン作動性酵素

  1. サンプルの均質化
    注:実験が終了したら、サンプル(組織またはオタマジャクシ)をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で保存し、その時点で処理しない場合は、-20°C(2か月間)または-80°C(6か月間)で凍結します。あるいは、以下に提案する推奨事項に従って、その時点で均質化することもできます。
    1. オタマジャクシ
      1. オタマジャクシまたはオタマジャクシのプール1gを精密分析天びんに計量します。
      2. PBS1 mLが入った15 mLのコニカルチューブにオタマジャクシ1 gを入れ、氷浴(4°C)に浸します。
      3. コニカルチューブに適合したテフロン先端のホモジナイザーでホモジナイズし、低温条件(4°C)で作業します。
        注意: 回転数を多くすると、タンパク質が破壊され、温度が上昇する可能性があるため、使用しないでください。
      4. 各サンプルの同量の液体ホモジネートを2本の標識2 mLマイクロ遠心チューブに移し、低温条件(4°C)で作業します。
      5. 液体ホモジネートを使用してサンプルを4°C、9,520 × gで10分間遠心分離します。
      6. 最後に、上清を抽出し、微量遠心チューブに入れ、0.5 mL〜1 mLのアリコートで標識し、酵素アッセイまで-80°C(6か月)または-20°C(2か月)の冷凍庫で保存します。
    2. 大人
      1. 目的の組織(肝臓、筋肉、腎臓など)を取り出し、精密分析天びんで1 gの重量を量ります。
      2. PBS1 mLが入った50 mLのコニカルチューブに組織を入れ、氷浴(4°C)に浸します。
      3. コニカルチューブに適合したテフロン先端のホモジナイザーで均質化し、冷間(4°C)で作業します。
        注意: 高回転数を使用すると、タンパク質が破壊され、温度が上昇する可能性があるため、使用しないでください。
      4. 各サンプルの同量の液体ホモジネートを2本の標識2 mLマイクロ遠心チューブに移し、冷間(4°C)で作業します。
      5. 液体ホモジネートを含むチューブを4°C、9,520 × gで10分間遠心分離します。
      6. 最後に、上清を抽出し、微量遠心チューブに入れ、0.5 mL〜1 mLのアリコートで標識し、酵素アッセイまで-80°C(6か月)または-20°C(2か月)の冷凍庫で保存します。
  2. タンパク質の測定
    注:タンパク質値は、酵素活性値の過小評価または過大評価を回避しながら、タンパク質の総量に対する酵素活性を推定するために取得されます。この方法論は、Bradford34 に基づいており、無尾類に若干の変更を加えています。
    1. Bradford試薬を調製します( 表1を参照)。
    2. 100 mL の H3PO4 を 85% (p/v) で Coomassie G-250 + エタノールに加え、蒸留水で 1 L の容量にします。
    3. 既知のタンパク質標準試料としてウシ血清アルブミン(BSA)を使用して検量線を調製します(表 1)。
    4. 3 mLの分光光度計キュベット用に、濃度を上げたアルブミン標準試料を調製します。標準曲線の例については、 表 2 を参照してください。
    5. 分光光度計を使用して、590 nm(試薬とタンパク質の複合体が形成される波長)で吸光度を測定します。
      注:最大容量3 mL、光路1 cmのガラスキュベットを使用して、分光光度計で読み取るためのサンプルでブラッドフォード反応を実行すると、タンパク質の測定に役立ちます。
    6. 2,000 μLのBradford試薬 + X μLのサンプル(X = 20 μLの成人アヌラン由来のホモジネートサンプル、またはオタマジャクシ由来の40 μLのホモジネートサンプル)の順にキュベットに入れます。
    7. 最後に、分光光度計で590nmの吸光度を測定します。
      注:4°Cで作業する必要はありません。
  3. カタラーゼ
    注:この方法論は、Aebi35 に基づいており、無尾類に若干の変更を加えています。
    1. 1,900 μL の PBS + 40 μL の過酸化水素 (H202) + 20 μL のサンプル (オタマジャクシでは純粋で、成体組織では 1/25 に希釈) を、光路長 1 cm の 3 mL 石英キュベットでインキュベートします。
      注意:インキュベーション中の試薬とサンプルの添加については、上記の順序に従ってください。反応物は、無尾類が生理学的に外温性であるため、室温(25°C)でインキュベートできます。
    2. カタラーゼ動態を240 nmでUV分光光度計で2分間読み取ります。
    3. 次の式(5)35で酵素活性を計算します。
      k (mmol・min-1・mg-1 Prt) = (Δ 吸光度/1,000)/タンパク質濃度 (5)
      注:精製酵素調製物を用いた研究では、比活性 k'0 は k をモル吸光係数(e = 43,6)で割ることによって得られます。 k' = (k/e) です。
  4. グルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)
    注:この方法論は、Habig et al.36 に基づいており、無尾類に若干の変更を加えています。
    1. 300 μL の GST + 10 μL の 1-choro-2, 4-dinitrobenzeno (CDNB) (0.1 M) + 10 μL のサンプル (オタマジャクシでは純粋で、成体組織では 1/25 に希釈) をキュベットでインキュベートします。
      注意:インキュベーション中は、上記の試薬とサンプルの添加順序を尊重してください。無尾類は生理学的に外温性であるため、試薬は室温(25°C)でインキュベートできます。
    2. GSTを準備します(表1)。
    3. 分光光度計で340nmのGST動態を2分間読み取ります。
    4. 次の式(6)で酵素活性を計算します。
      GSTの活性率(mmol/1分/mgタンパク質)=([Δ吸光度/1,000]/9.6 × 104)/タンパク質濃度(6)
      ここで、9.6 mM-1 cm-1 = モル吸光係数。
  5. 脂質過酸化(TBARS)
    注:この方法論は、BuegeとAust37 に基づいており、無尾類に若干の変更を加えています。
    1. MDAを標準試料とし、0.7%TBAで検量線を作成します(表3)。
    2. 標準MDA溶液(10 mM)を調製します(表1)。溶液を50°Cの水浴に1時間置くことにより、MDAへのTHP加水分解を行います。
    3. TBAの0.7%(w / v)溶液(表1)を磁気ホットプレートスターラーを使用して調製します。
    4. 次に、サンプルホモジネートを9,520 × g 、4°Cで30分間遠心分離します。
    5. 上清500μLを抽出し、6M NaOH100μLを加え、60°Cの熱浴に30分間入れます。
    6. 温浴後、35% HClO4を250 μL加え、氷浴(4°C)に30分間入れます。
    7. その後、9,520 × g で12分間遠心分離し、上清300 μLを抽出します。
    8. 0.7% TBAの300 μLを上清(サンプル)に加え、温浴(97.5 °C)に30分間入れます。
    9. サンプルとTBAによって形成される複合体の吸光度を532 nmで読み取り、曲線の式に吸光度値を代入してサンプル中のMDA濃度を決定します(図1)。
  6. アセチルコリンエステラーゼ(AChE)
    注:この方法論は、Ellmanらによって提案されたものに基づいており、38 無尾類に若干の変更を加えています。
    1. 測定の瞬間に、DTNBおよびアセチルチオコリンヨウ化物(ATCh)試薬をセットします。
    2. DTNB反応を調製します(表1)。
    3. AChE反応を調製します(表1)。
    4. 光路が1cmのガラスセルに、これらの試薬を次の順序で配置してAChE反応を調製します:150μLのPBSバッファー(pH = 8)+150μLのDTNB+50μLのATCh+サンプルの10μL(オタマジャクシでは純粋で、成人の無尾動物では1/10に希釈)。
    5. 412 nmでAChE速度論を室温で2分間読み取ります。
    6. 次の式を使用してAChEアクティビティの値を取得します(7)。
      AChE(mmol・min-1・mg-1 タンパク質)の活性率=([Δ吸光度/1,000]/1.36)/タンパク質濃度(7)

4.遺伝的および細胞レベル:小核および彗星アッセイ

  1. 小核(MN)アッセイ
    注:この方法論は、新熱帯無尾類にわずかな変更を加えたFenech39 によって提案されたものと一致しています。
    1. 氷水(4°C)に浸して標本を麻酔し、オタマジャクシでは蓋の後ろを切片にするか、成人では心臓穿刺によって血液サンプルを採取します。
    2. 標本から末梢血を2滴、事前に洗浄したスライドに塗ります。
    3. その後、スライドを風乾し、100%(v / v)冷メタノール(4°C)で20分間固定し、5%ギムサ溶液で12分間染色します。
    4. 1人の研究者にコードを作成してもらい、1,000倍の倍率でスライドをブラインドコードします。
    5. 各検体から1,000個の成熟赤血球を解析してMNsの頻度を決定し、1,000細胞あたりのMNの総数として表します。
    6. MNを正しく識別するには、次の基準を使用してください。
      1. 主核の直径の1/3より小さいMNを探します。
      2. MNの着色が屈折性ではなく、主核の染色強度と同じかそれより軽いことを確認してください。
      3. メイン核境界と区別でき、コアに接続されていない、またはメイン核と重なっている MN 境界を探します。
      4. 細胞内のMNの数が、核に関連するMNが4つを超えないようにしてください。
  2. コメットアッセイまたはシングルセルゲル電気泳動(SCGE)
    1. 氷水に浸して標本を麻酔し、オタマジャクシでは蓋の後ろを切片にするか、成人では心臓穿刺によって血液サンプルを採取します。
    2. 血液を 1 mL の PBS で希釈し、遠心分離 (381 × g、9 分)、最終容量の 50 mL の PBS に再懸濁します。
    3. 30 μLの血液サンプルを70 μLの低融点アガロース(LMPA)に0.5%濃度のアガロースで混合し、第2層を形成します。続いて、0.5%正常融点アガロース100μLを含む層1で以前にコーティングしたスライド上に、50μLの層2を置きます。
    4. スライドをカバーガラスで覆い、冷たく(4°C)に10分間置いて、レイヤー2を固めます。
    5. 固化後、カバーガラスをはがし、0.5% LMPAを100μL置いて第3層を形成します。
    6. 3番目の層が固まったら、カバーガラスをはがし、各スライドを同じ日に調製して4°Cに保った溶解溶液(表1)が入った100mLのCoplinジャーに浸します。 Coplinジャーを暗所(4°C)で1時間冷浴に入れ、溶解します。
      注: 実験は一時停止して、後で再開できます。溶解期間は1時間から1ヶ月続くと報告されています。
    7. 溶解の最後に、スライドを取り出し、電気泳動タンク内の電気泳動緩衝液(表1)に浸します。このステップを暗闇で4°Cで15分間実行し、DNAをほどくまで待ちます。核DNAを巻き戻した後、同じバッファー上で4°Cの温度で25Vおよび250mAで10分間電気泳動を行います。
    8. 電気泳動の最後に、スライドに含まれるサンプルを2 mLのTris-HCl溶液(表1)を加えて、スライドに含まれるサンプルを3 x 5分間中和します。
    9. コメットアッセイ技術の最後のステップでは、アルコール(95%)を含む100mLのCoplinジャーにサンプルを4°Cで入れて、サンプルを脱水します。
    10. 最後に、スライドの中央に10 μLの4′,6-ジアミノ-2-フェニルインドール(DAPI)を配置してサンプルを染色し、サンプル全体に色素を広げるカバースリップを配置します。WBフィルター付きの蛍光光顕微鏡でスライドを調べます。
      注意:DNAの光分解を避けるために、プロセス全体を暗闇で実行する必要があります。
    11. 核様体からのDNA移動の長さを評価することにより、DNA損傷を定量化します。この場合、重複せずにランダムに選択された100個のセルで視覚的に決定します。DNA損傷を0-I(損傷なし)、II(最小損傷)、III(中程度)、IV(最大損傷)の4つのクラスに分類します。データを損傷細胞の平均数(クラスII-IVの合計)と各治療群の平均コメットスコアで表します。これらのデータから、次の式(8)を使用して、各試験生物の遺伝的損傷指数(GDI)を計算します。
      GDI = (1[I] + 2[II] + 3[III] + 4[IV])/N[I-IV]) (8)
      ここで、I-IVは核様体損傷のタイプを表し、NI-NIVはPitarque et al.40に従ってスコアリングされた核種の総数を表します。

5. 相関バイオマーカー

注:最近では、バイオマーカーは、BeliaeffとBurgeot49 によって提案され、新熱帯無尾動物に適応したバイオマーカー反応(IBR)インデックスを使用して、すべてのレベルで統合できます。IBRは、すべてのバイオマーカー応答を統合する数値を提供します。IBR値が高いほど、ストレスレベルが高いことを示します49。特定のステーションのIBR推定または特定の調査の処理に関して、最終スコアを決定するための連続したデータ処理ステップは次のとおりです。

  1. 個々の結果が利用可能な場合の平均推定値(X)を計算します。それ以外の場合は、各サンプリング・ステーションでプールされたサンプルの値を使用します。
  2. 各バイオマーカーについて、比較するすべてのステーションおよび/または調査の X の一般平均(m)と標準偏差(s)を計算します。
  3. X を標準化して Y を取得します。 Y という値を計算します: Y = (X- m)/s。
  4. Z = Y または Z = -Y は、ストレッサーに応答した阻害または活性化に対応する生物学的効果の場合、次のように計算します。
  5. 最後に、スコア (S) を S = Z + |Min|、ここで S ≥ 0 と |ミン|は、決定された最小絶対値です。
  6. 各バイオマーカー(Si)のSの値を計算し、IBRを取得するための合計を実行した後、スパイダー図またはスターダイアグラムをプロットします。
    注:計算の詳細については、元の論文49を参照してください。

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結果

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ここで紹介するバイオマーカー技術はすべて、シンプル、迅速、便利、高感度、低コスト、正確な方法です。各バイオマーカーについて、以下の点に注意することが重要です。

個人レベル
スケーリングされた質量指数
ミリメートルスケールで写真を撮ることは、この値がソフトウェアのキャリブレーションに使用され、SVL変数を取得する際のキャリパー測定に対する客観性が向上するため、非常に重要です。さらに、後で分析するために写真を使用すると、サンプリングの時間が常に重要な実験室またはフィールド調査中に、個人の取り扱い中の処理時間を節約できます。スケーリングされた質量指数の分析を実行するためには、スケーリング指数(b)を決定するために、分子種のSVLと体量との間のべき乗関数の関係を示す非線形回帰分析を実行することが重要です(b)(図2)。スケールされた質量指数は、同じ種の成体または幼体のグループを比較するのに役立ちます。

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ディスカッション

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個々のレベルでのバイオマーカーは、これらのバイオマーカーを調べるのに、通常どの研究室でも利用できる数個の機器しか必要としないため、非常に簡単に決定でき、非常に低コストです。さらに、これらのバイオマーカーは、動物の健康とフィットネスに関する一般的な情報を提供します。各プロトコルで使用される動物の数は、信頼性の高い結果を得るために重要です。データのばらつきにより、各治療には最低5匹の動物(N = 5)が必要です。具体的には、カメラ位置の角度の変動がSVL測定の変動を引き起こす可能性があるため、個人レベルでのバイオマーカーの重要なステップは、体調指数のSVLを測定することです。同じ研究に参加しているすべての個人の画像は、同じ方法で、同じ角度で、撮影対象物から同じ距離で撮影されることが不可欠です。ただし、画像解析法によるSVLの測定は、時間の節約という理由から、キャリパー測定よりも好ましいです。したがって、この画像解析方法を使用すると、研究する動物の数を増やすことが可能になり、より堅牢で信頼性の高い結果が得られます。

肝...

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は、競合する利益を宣言しません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者らは、サンルイス国立研究所「Dr. Roberto Olsina」-Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Tecnológicas(INQUISAL-CONICET)、サンルイス国立大学(Project PROICO 2-1914)、Laboratório de Patologia Experimental(LAPEx)-Instituto de Biociências(INBIO)-Universidade Federal de Mato Grosso do Sul(UFMS)、Cátedra de Citología-Universidad Nacional de La Plata(UNLP)、およびAgencia Nacional de PromociónCientífica(FONCYT;PICT-2018-02570およびPICT-2018-01067)に資金援助を依頼しました。また、原稿の校正にあたっては、ネイティブスピーカーのLidia Unger氏とサンルイス国立大学のGAECI-UNSL(科学ライティング支援センター)にも感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
分析スケール
電気泳動電源 エンデューロ E0203-250V 
エオシン メルク
蛍光光顕微鏡 オリンパス BX50ハリ
メルク社のヘマトキシリン
高解像度フォトカメラ  >16メガピクセル
ホモジナイザー
水平電気泳動チャンバー シグマ
デンバー 計器
顕微鏡ライカDM4000 B画像キャプチャシステム搭載 ライカ DFC 280
ミクロトームライカ2265
パラプラストシグマP3558
パソコン Mac OS X、Lynux、またはWindows
冷蔵遠心分離機
UV&ndashと同等です。Vis分光光度計Rayleigh723GUVランプ付き
ス製適切なフィルターコンビネーション搭載 の

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