この論文では、新熱帯無尾類種のバイオマーカーを評価するための標準化された生態毒性学的方法を紹介します。具体的には、この論文では、遺伝的、細胞組織学的、生化学的、形態学的、および個々のレベルなど、生態毒性学的評価のさまざまなスケールでのいくつかの方法論について詳しく説明します。
このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。
この記事について
サマリー
要約
生態毒性学における新たな疑問は、環境ストレス要因が生物に及ぼす影響の解釈だけでなく、その影響の可能性の判断も改善する生態毒性学的予測をもたらすため、一連のバイオマーカーを適用することの重要性を強調しています。組織のさまざまなレベルで生態毒性バイオマーカーを使用すると、環境ストレス要因に対する生物の生物学的応答を予測でき、環境リスク評価に役立つことはよく知られています。
しかし、観察された効果の性質や変動を解明するためには、基本的な手順の最適化を検討し、対照群で履歴データを作成し、臓器や組織での応答を評価するための特定のバイオアッセイを採用する必要があります。したがって、本研究は、さまざまな生態学的レベルで新熱帯無尿類のすべての段階で採用されているいくつかの生態毒性学的方法論を説明し、それらを野生生物と実験室条件の両方で使用される有用なバイオマーカーとして検証することを目的としています。本研究では、これらのバイオマーカーを個体/生物レベル(体調指数)、組織学的/生理学的レベル(病理組織学、組織測定、色素解析)、生化学的レベル(酸化ストレス酵素)、遺伝的レベル(コメットアッセイによるDNAの直接的および酸化的損傷)に適用しました。
これらの方法論は、種によってわずかなバリエーションや変更がありますが、これらの技術は、水生および陸生生態系の有用な指標種となる特定の特性を持つ無尾類に対する生体異物の影響を評価するための効果的なバイオマーカーを提供します。結論として、本研究で採用された一連のバイオマーカーは、新熱帯性無尾類の毒性反応を推定するのに十分であることが証明されており、汚染物質が地域の水生生態系に与える影響を特定するためのバイオ指標としてさらに推奨できます。最後に、特定の領域の無尾類に対するこれらの重要なバイオマーカーの標準化を達成し、リスク評価と意思決定にそれらを含めることが推奨される。
概要
環境ストレス要因の天然水域への投入は、水生生態系の健康に影響を与える可能性があります1。これらの環境ストレス要因への曝露は、直接曝露(短期および長期の両方)を含むさまざまな毒性メカニズムを通じて、水生生物の生存または適応度に影響を与える可能性があります2。したがって、フィットネスと生存に関連する毒物学的エンドポイントを評価するための標準化された実験室バイオアッセイは、現場でのストレスの多くの間接的な影響の信頼性の低い推定値である可能性があります。さらに、正常な生理学的レベルの変化や個体への影響(例えば、獲物の捕獲など)は、生物の生存と生殖適応度、ひいては生態系の健康への影響を長期的に示すより良い指標となる可能性がある1,3。既知の環境パラメータと汚染物質濃度に基づいて、生態系の構成と機能、および生物の健康の変化を予測することは、汚染管理を改善するために重要です1。
バイオマーカーは、生体異物化学物質への曝露またはその影響による生化学的、生理学的、または組織学的変化として定義されます4,5
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
プロトコル
以下の技術には、国際的な倫理基準46,47,48に従って行われた動物の以前の犠牲、およびその後の臓器の解剖および切除が含まれる。動物は、サンルイス州の環境・農業・生産省の許可の下で捕獲されました(決議49-PMA2019)。動物の犠牲と安楽死の方法は、サンルイス国立大学の施設動物管理および使用委員会(CICUA、プロトコルQ-322/19)のプロトコルによって正式に承認されました。無尾類生物を用いた手順は、Garber et al.46、CONICET47、および INTA48 に詳述されているガイドラインに従って実施されました。さらに、ここで紹介するすべてのプロトコルは、幼虫および成虫のライフステージにある新熱帯無尾類種を対象としています。それらはすでに地元の研究者によって広く受け入れられており、厳格なプロトコルの下で、関係する各大学の「Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales(CICUA)」からの許可を得て実施されています。使用される材料とソリューションのリストは、
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
結果
ここで紹介するバイオマーカー技術はすべて、シンプル、迅速、便利、高感度、低コスト、正確な方法です。各バイオマーカーについて、以下の点に注意することが重要です。
個人レベル
スケーリングされた質量指数
ミリメートルスケールで写真を撮ることは、この値がソフトウェアのキャリブレーションに使用され、SVL変数を取得する際のキャリパー測定に対する客観性が向上するため、非常に重要です。さらに、後で分析するために写真を使用すると、サンプリングの時間が常に重要な実験室またはフィールド調査中に、個人の取り扱い中の処理時間を節約できます。スケーリングされた質量指数の分析を実行するためには、スケーリング指数(b)を決定するために、分子種のSVLと体量との間のべき乗関数の関係を示す非線形回帰分析を実行することが重要です(b)(図2)。スケールされた質量指数は、同じ種の成体または幼体のグループを比較するのに役立ちます。
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
ディスカッション
個々のレベルでのバイオマーカーは、これらのバイオマーカーを調べるのに、通常どの研究室でも利用できる数個の機器しか必要としないため、非常に簡単に決定でき、非常に低コストです。さらに、これらのバイオマーカーは、動物の健康とフィットネスに関する一般的な情報を提供します。各プロトコルで使用される動物の数は、信頼性の高い結果を得るために重要です。データのばらつきにより、各治療には最低5匹の動物(N = 5)が必要です。具体的には、カメラ位置の角度の変動がSVL測定の変動を引き起こす可能性があるため、個人レベルでのバイオマーカーの重要なステップは、体調指数のSVLを測定することです。同じ研究に参加しているすべての個人の画像は、同じ方法で、同じ角度で、撮影対象物から同じ距離で撮影されることが不可欠です。ただし、画像解析法によるSVLの測定は、時間の節約という理由から、キャリパー測定よりも好ましいです。したがって、この画像解析方法を使用すると、研究する動物の数を増やすことが可能になり、より堅牢で信頼性の高い結果が得られます。
肝.......
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
開示事項
著者は、競合する利益を宣言しません。
謝辞
著者らは、サンルイス国立研究所「Dr. Roberto Olsina」-Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Tecnológicas(INQUISAL-CONICET)、サンルイス国立大学(Project PROICO 2-1914)、Laboratório de Patologia Experimental(LAPEx)-Instituto de Biociências(INBIO)-Universidade Federal de Mato Grosso do Sul(UFMS)、Cátedra de Citología-Universidad Nacional de La Plata(UNLP)、およびAgencia Nacional de PromociónCientífica(FONCYT;PICT-2018-02570およびPICT-2018-01067)に資金援助を依頼しました。また、原稿の校正にあたっては、ネイティブスピーカーのLidia Unger氏とサンルイス国立大学のGAECI-UNSL(科学ライティング支援センター)にも感謝します。
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 分析スケール | |||
| 電気泳動電源 | エンデューロ | E0203-250V | |
| エオシン | メルク | ||
| 蛍光光顕微鏡 | オリンパス | BX50 | ハリ |
| メルク | 社のヘマトキシリン | ||
| 高解像度フォトカメラ | >16メガピクセル | ||
| ホモジナイザー | |||
| 水平電気泳動チャンバー | シグマ | ||
| デン | バー 計器 | ||
| 顕微鏡 | ライカ | DM4000 B | 画像キャプチャシステム搭載 ライカ DFC 280 |
| ミクロトーム | ライカ | 2265 | |
| パラプラスト | シグマ | P3558 | |
| パソコン | Mac OS X、Lynux、またはWindows | ||
| 冷蔵遠心分離機 | |||
| UV&ndashと同等です。Vis分光光度計 | Rayleigh | 723G | UVランプ付き |
参考文献
- Hook, S. E., Gallagher, E. P., Batley, G. E. The role of biomarkers in the assessment of aquatic ecosystem health. Integrated Environmental Assessment and Management. 10 (3), 327-341 (2014).
- Connon, R. E., et al.
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
再版と許可
