ここでは、適合ベクターのセットを使用して、タグ差のあるタンパク質を細菌で共発現させる方法について説明し、その後、 in vitroで組み立てられないタンパク質複合体を研究するための従来のプルダウン技術について説明します。
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方法論記事
細菌細胞での共発現と組み合わせたプルダウンアッセイは、困難なタンパク質間相互作用をテストするための時間効率の良いツールとして
この記事について
サマリー
要約
プルダウンは、簡単で広く使用されているタンパク質間相互作用アッセイです。しかし、 in vitroで効果的に集合しないタンパク質複合体の研究には限界があります。そのような複合体は、共翻訳アセンブリおよび分子シャペロンの存在を必要とし得る。それらは、 in vitro で解離および再会合することができない安定なオリゴマーを形成するか、結合パートナーなしでは不安定である。これらの問題を克服するために、従来のプルダウン技術に続く一連の適合ベクターを用いた差次的タグタンパク質の細菌共発現に基づく方法を用いることができる。このワークフローは、相互作用するタンパク質の個別の精製とその後のインキュベーションという時間のかかるステップがないため、従来のプルダウンと比較して時間効率が高くなります。別の利点は、ステップ数が大幅に少なく、 in vitro 環境内に存在するタンパク質がタンパク質分解および酸化にさらされる期間が短いため、再現性が高いことです。この方法は、他の in vitro 技術が不適切であることが判明した場合に、多くのタンパク質間相互作用を研究するために首尾よく適用されました。この方法は、タンパク質間相互作用のバッチ試験に使用できます。BTBドメインと天然変性タンパク質との相互作用、および亜鉛フィンガー関連ドメインのヘテロ二量体の研究について、代表的な結果が示されています。
概要
従来のプルダウンは、タンパク質間相互作用の研究に広く使用されています1。しかしながら、精製されたタンパク質は、インビトロで効果的に相互作用しないことが多く2,3、それらのいくつかは、それらの結合パートナーなしでは不溶性である4,5。そのようなタンパク質は、共翻訳アセンブリまたは分子シャペロンの存在を必要とするかもしれない5,6,7,8,9。従来のプルダウンの別の制限は、共翻訳的に組み立てられた安定なホモオリゴマーとして存在し得るドメイン間のヘテロ多量体化活性の試験です8,10、それらの多くはインビトロで解離および再会合することができないため、インキュベーション時間中に。共発現は、....
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プロトコル
メソッドワークフローの概略図を 図1に示します。
1. 大腸菌の共形質転換
- 標準的なクローニング法を用いて標的タンパク質の発現ベクターを調製します。
注:通常、GST/MBPタグ付きタンパク質の発現にはアンピシリン耐性遺伝子とColE1起源を持つ従来のpGEX/pMALベクターを使用し、6xHisタグタンパク質を発現させるにはp15AまたはRSF起源とカナマイシン耐性を持つ適合ベクターを使用し、場合によっては溶解性を高めるためにチオレドキシンまたはSUMOタグのいずれかと組み合わせることをお勧めします。通常、実験の前にタグのいくつかの組み合わせをテストする必要があります。記載された方法自体は、標的タンパク質の発現条件をバッチ試験するのに便利である。ほとんどのロゼッタ株には、希少コドンのtRNAを発現させるためのp15A起源のプラスミドがすでに含まれているため、そのような株を使用することが可能な選択肢である場合は、p15Aプラスミドを避けるべきであることに注意することが重要です。詳細については、 材料の表 を参照してください。- 適切な菌株の細菌を37°CのLuria-Bertani(LB)培地で0.1〜0.2の光学密度(OD)まで増殖させます。BL21(DE3)株は、この研究の実施例に使用されま....
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結果
記載された方法は、多くの異なるターゲットで日常的に使用されていた。ここでは、従来のプルダウン技術では得られない可能性のある代表的な結果をいくつか紹介します。1つ目は、特異的ZAD(亜鉛フィンガー関連ドメイン)二量体化の研究です11。ZADは安定で特異的な二量体を形成し、ヘテロ二量体はパラロググループ内の密接に関連するドメイン間でのみ可能です。これらのドメインによって形成される二量体は安定しており、少なくとも数日間は解離しません。したがって、精製されたZADを混合しても、検出可能な結合は生成されません。同時に、MBPとチオレドキシン-6xHis融合ZADの共発現は、良好で再現性のあるホモ二量体化活性を示し(図2A)、MBPプルダウンアッセイのSDS-PAGE結果に追加のバンドとして現れます。ヘテロダイマーのごく一部は、別のドメインと共発現するM1BPで見ることができます。この相互作用はY2Aでは確認されておらず、これらのドメインはシステインが豊富で非常に凝集しやすいため、タンパク質濃度が高いため、非特異的な会合の結果である可能性が最.......
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ディスカッション
記載された方法は、インビトロで効率的に組み立てることができず、共発現を必要とするタンパク質間相互作用の試験を可能にする。この方法は、ヘテロ二量体化タンパク質を研究するための数少ない適切なアプローチの1つであり、別々に精製すると、そのようなタンパク質は、実験中に解離および再会合することが最も多い安定したホモ二量体を形成するため、ホモ二量体化も可能です3,11。
記載された方法のワークフローは、相互作用するタンパク質の分離精製およびその後のインキュベーションの時間のかかるステップがないため、従来のプルダウンと比較して時間効率が高い。別の利点は、タンパク質分解および酸化にさらされながら人工のin vitro環境内に存在するステップ数が大幅に少なく、期間が短いため、再現性が高いことです。この方法は、他のin vitro技術が不適切であることが判明した場合に、いくつかのタンパク質間相互作用を研究するために首尾よく適用されま.......
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開示事項
著者は競合する利益を宣言しません。
謝辞
この研究は、ロシア科学財団のプロジェクト19-74-30026(メソッド開発と検証)および19-74-10099(タンパク質間相互作用アッセイ)によってサポートされました。ロシア連邦科学高等教育省による助成金075-15-2019-1661(代表的なタンパク質間相互作用の分析)。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 8エレメントプローブ | Sonics | 630-0586 | ハイスループット8エレメントソニケータープローブ |
| 寒天 | AppliChem | A0949 | |
| アミロース樹脂 | ニューイングランドバイオラボ | E8021 | MBPタグ付きタンパク質の精製用樹脂 |
| 抗生物質 | AppliChem | A4789(カナマイシン);A0839(アンピシリン) | |
| β-メルカプトエタノール | AppliChem | A1108 | |
| BL21(DE3) | Novagen | 69450-M | |
| CaCl2 | AppliChem | A4689 | |
| 遠心分離機 | Eppendorf | 5415R (Z605212) | |
| Glutathione | AppliChem | A9782 | |
| Glutathione agarose | Pierce | 16100 | GSTタグ付きタンパク質の精製用樹脂 |
| Glycerol | AppliChem | A2926 | |
| HEPES | AppliChem | A3724 | |
| HisPur Ni-NTA Superflow Agarose | Thermo Scientific | 25214 | 6xHisタグ付きタンパク質の精製用樹脂 |
| イミダゾール | AppliChem | A1378 | |
| IPTG | AppliChem | A4773 | |
| KCl | AppliChem | A2939 | |
| LB | AppliChem | 414753 | |
| Maltose | AppliChem | A3891 | |
| MOPS | AppliChem | A2947 | |
| NaCl | AppliChem | A2942 | |
| NP40 | Roche | 11754599001 | |
| pACYCDuet-1 | Sigma-Aldrich | 71147 | p15A複製起点を持つタンパク質の共発現用ベクター |
| pCDFDuet-1 | Sigma-Aldrich | 71340 | Vector for co-expression of proteins with CloDF13 replication origin |
| PMSF | AppliChem | A0999 | |
| Protease Inhibitor Cocktail VII | Calbiochem | 539138 | Protease Inhibitor Cocktail |
| pRSFDuet-1 | Sigma-Aldrich | 71341 | Vector for co-expression of proteins with RSF replication origin |
| SDS | AppliChem | A2263 | |
| Tris | AppliChem | A2264 | |
| VC505 | sonicator Sonics | CV334 | 超音波液体プロセッサ |
| ZnCl2 | >AppliChem | A6285 |
参考文献
- Louche, A., Salcedo, S. P., Bigot, S. Protein-protein interactions: Pulldown assays. Methods in Molecular Biology. 1615, 247-255 (2017).
- Rose, R. B., et al. Structural basis of dimerization, coactivator recognition and MODY3 ....
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再版と許可
