マウス由来骨髄由来マクロファージの単離と培養

単球とマクロファージは、骨髄の前駆細胞に由来する単核食細胞です。近年の研究で、マクロファージは卵黄嚢由来の赤骨髄系前駆細胞にも由来することが報告されています¹。その由来に関係なく、これらの白血球は恒常性や炎症において重要なエフェクター機能を持っています^2,3。単球は末梢血由来の細胞であり、組織内でさらにマクロファージに分化することができる^2,4のに対し、マクロファージは、成長因子やサイト^カインの局所的な曝露によって制御される表現型や機能を示す不均一な細胞である5。マクロファージはこのような機能的多様性を示すため、多くの疾患モデルで研究されてきました。したがって、マクロファージのin vitro培養は、マクロファージの生理機能とさまざまな疾患におけるマクロファージの役割を理解するための重要なツールになっています。骨髄は、マクロファージ前駆細胞を含む前駆細胞の重要な供給源であり、これを単離して増殖させることで、得られるマクロファージの数を指数関数的に増加させることができます。さらに、骨髄由来のマクロファージは、組織内の異なる刺激に応答して表現型を変化させるため、組織微小環境によって生じる影響を回避するために特に重要である^6,7。骨髄前駆細胞は、マクロファージコロニー刺激因子(M-CSF⁾⁸に曝露されるとマクロファージに変化します。骨髄由来マクロファージは、組織中の生化学的マーカーによって単球由来マクロファージと区別することはできません。これらの細胞は、初代細胞の非常に均質な集団を表しており、他の多くの点で腹膜マクロファージに匹敵します^6,9。

マクロファージは細胞機能が不均一であるため、研究者によって長い間徹底的に研究されてきました。これらの細胞は、これらのプロセスに特徴があるため、感染性疾患や炎症性疾患を含むさまざまな実験モデルで使用できます^10,11。それらはまた、種々の微小環境刺激に応答したマクロファージの分極を調べるのにも有用であり得る^12,13。したがって、ここでは、マウスの骨髄から多数の一次マクロファージを得る目的で、単純で信頼性の高いプロトコルが提供されています。

この議定書は、全米動物実験管理評議会(Concea)および動物倫理および使用委員会(CEUA)の承認を得て実施されました。C57BL/6マウスは、ブラジルのベロオリゾンテにあるミナスジェライス連邦大学(UFMG)のBiotério Centralから購入しました。このプロトコルに記載されているすべてのステップで、白衣、手袋、目の保護具などの個人用保護具(PPE)を使用する必要があります。

1. M-CSF源としての線維芽細胞L-929系統上清の調製

1. L-929線維芽細胞系譜細胞(American Type Culture Collection Certified Cell Line-ATCC CCL1)を解凍し、生存率を維持するために直ちに培養プロセスを開始します。
2. 層流バイオセーフティキャビネット内で、1,000 μLピペットを使用して、L-929線維芽細胞系統細胞をバイアルから50 mLの滅菌遠心チューブに移します。
3. 血清学的ピペットを使用して、カルシウムとマグネシウムを含まない50 mLの滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を追加します。
4. 300 x g、4°Cで10分間遠心分離します。上清を捨てます。
5. 血清学的ピペットを使用して、10%ウシ胎児血清(FBS)と1mLのペニシリン/ストレプトマイシン(P/S)(DMEM/F12-10)を添加した20 mLのダルベッコ改変イーグル培地F12にペレットを再懸濁します。
6. 再懸濁した細胞をT75細胞培養フラスコに移します。
7. 37°C、5%CO₂ インキュベーターで完全にコンフルエントするまでインキュベートします。
   注意: フラスコを操作するときは、汚染の原因となる可能性があるため、カバーを溶液で濡らさないように注意してください。都合の良い量の上清を得るためには、細胞が細胞培養フラスコの全表面を覆った後に細胞を複製する必要があります。L-929細胞は接触によって阻害されます。トリプシン/エチレンジアミン四酢酸(EDTA)溶液、DMEM/F12-10、PBSを37°Cまで滅菌して、以下の手順で説明するように細胞培養の増殖を開始します。
8. 完全な合流点に達したら、上清を細胞培養フラスコから、層流バイオセーフティキャビネット内に捨てます。
9. 細胞培養フラスコを血清学的ピペットを使用して20 mLの滅菌PBSで洗浄し、溶液を廃棄します。
10. 10 mLのトリプシン/EDTA(0.05%溶液)を、接着した細胞を含む細胞培養フラスコに加えます。
11. 細胞培養フラスコを層流から37°C、5%CO₂ インキュベーターに移し、3分間インキュベートします。
12. 細胞培養フラスコを振って培養フラスコの表面から細胞を解離させ、顕微鏡を使用してすべての細胞が解離したことを確認します。
13. トリプシン/ EDTA(0.05%溶液)を10 mLのDMEM / F12-10培地で不活化します。.
14. 血清学的ピペットを使用して溶液を50 mLの滅菌遠心チューブに移します。
15. 300 x g 、4°Cで10分間遠心分離します。上清を捨てます。
16. ペレットを10 mLのDMEM/F12-10培地に再懸濁します。
17. 細胞懸濁液1 mLをT175細胞培養フラスコ(1:10培養)に加えます。
18. この手順を繰り返して、T175細胞培養フラスコを10個入手します。
19. 各細胞培養フラスコに50 mLのDMEM/F12-10を加えます。
20. 37°C、5%CO₂ インキュベーターで完全にコンフルエントするまでインキュベートします。
    注:これらのステップは、500mLのL-929細胞上清を保証するものです。5日目に、細胞がT175細胞培養フラスコ表面を覆った後、上清はM-CSFのために濃縮され、収集されなければなりません¹⁴。
21. 接触阻害後5日目にインキュベーターから細胞培養フラスコを取り出します。
22. 培地を50 mLの滅菌遠心チューブに移します。
23. 3,200 x gで4°Cで10分間遠心分離します。
24. M-CSFが豊富な上清を回収し、溶液を50 mLの滅菌遠心チューブに移します。-20°Cの冷凍庫で保存してください。
    注:遠心分離は、上清から細胞や破片を除去するために非常に重要です。
25. L-929上清は、マクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)の便利で安価な供給源であり、通常、5〜10 ng/mLのM-CSF⁸を含んでいます。これらの上清には、微量の他のサイトカインや成長因子も含まれているが、マクロファージの生理機能には大きな影響を与えない¹⁵。ただし、精製されたM-CSFを購入して、1〜2 ng / mLの濃度でL-929上清の代替品^{として使用できます8。}

2.大腿骨と脛骨の除去

1. 全米動物実験評議会(Concea)の規範的決議番号18に従い、動物倫理および使用委員会(CEUA)の承認を得て、二酸化炭素窒息後の子宮頸部脱臼による生後8週齢のC57BL-6野生型雄マウス安楽死を続行します。
2. マウスを70%エタノール溶液に浸し、滅菌ハサミを使用して腹部に沿って1cmの切開を行います。
3. 後ろ足の筋肉が完全に露出するまで皮膚をはがします。
4. 大腿骨と脛骨を壊さないように注意しながら、腰の高さで後ろ足を取り外します。
5. 後肢を70%エタノール溶液を入れた円錐形の遠心分離チューブに入れます。
   注:常に病原体を含まないマウスを使用してください。より多くのセルを達成するために、必ず両方の脚を収集してください。ステップ2は、非滅菌環境(ベンチトップ)で実行されます。したがって、細菌汚染を避けるために、大腿骨と脛骨を慎重に取り除き、無傷のままでいることが重要です。この手順の残りのステップは、層流バイオセーフティキャビネットで実行されます。脚を70%エタノール溶液にさらす時間は10分に制限する必要があります。時間が長いと、骨髄前駆細胞が影響を受ける可能性があります。

3.脛骨と大腿骨の内腔から骨髄前駆細胞を取得します

1. 70%エタノール溶液から脚を取り出し、滅菌PBSに移します。
2. 鉗子と消毒用ワイプを使用して、すべての筋肉と筋膜を取り除きます。このステップの後、骨はきれいになるはずです。
3. 滅菌済みの外科用メスの刃を使用して、両端の骨端を切断し、骨髄を露出させます。
4. 20 mLシリンジに2%ペニシリン/ストレプトマイシン溶液を補充した10 mLの滅菌PBSを入れ、26 Gの針を接続します。
5. 片方の手で解剖学的解剖鉗子を使用して骨を保持し、もう一方の手で針を骨腔に挿入します。鉗子で骨を潰さないように注意してください。
6. PBSで骨の内側を洗い流し、骨髄を滅菌済みの円錐形遠心チューブに集めます。この手順の後、骨腔は白く見えるはずです。
7. 収集した細胞を300 x g 、4°Cで10分間遠心分離します。
8. 上清を捨て、細胞ペレットを1 mLのDMEM/F12-10に再懸濁します。
9. ホモジナイズしてさらに9 mLのDMEM/F12-10培地を添加し、細胞を合計10 mLにします。

4. マクロファージ培養

1. 100 mm x 20 mmの丸いプラスチック製ペトリ皿(合計10皿)のそれぞれに1 mLの細胞前駆細胞を加え、ピペットで細胞をプレート全体に広げて均一に分布させます。ティッシュカルチャー処理した皿は使用しないでください。
2. L-929細胞上清の20%を添加したDMEM/F12-10を各ディッシュに9mL加えます。
3. 37°C、5%_CO2 インキュベーターでインキュベートします。
4. 3^日目に 、L-929細胞の上清20%を補充したDMEM/F12-10培地10mLを各ディッシュに加えます。このようにして、培養皿には合計20 mLの培地が備わっており、成熟が終了するまで細胞を増殖させるのに十分です。
   注:マクロファージは、表面との強い相互作用によって特徴付けられる天然の接着細胞として、後でディッシュから容易に解離しないため、組織培養処理済みディッシュは使用しないでください。通常、1匹のマウス(2つの大腿骨)の細胞前駆細胞を10個の培養皿に播種することができます。細胞前駆細胞はマクロファージに形質転換し、インキュベーション7日目から10日目まで使用できます。成熟確認は、マクロファージの形態の変化によって識別されます。成熟したマクロファージは接着性があり、不均一な形態を示し、さまざまな方向への偽足の放出によって説明されます。これらの成熟細胞の例を代表的な結果に示します。

5. マクロファージの採取

1. すべての培養皿から上清を捨てます。
2. 各培養皿を10 mLの温かい(37°C)滅菌Mg²⁺ およびCa²⁺ 遊離PBSで洗浄します。
3. 各皿から溶液を捨てます。
4. 非酵素的細胞解離溶液を37°Cに予温し、各皿に3 mLを加えます。37°C、5%_CO2 インキュベーターで10分間インキュベートします。倒立顕微鏡を使用して、マクロファージが培養皿から解離しているかどうかを視覚化します。
   注:非組織培養処理されたプラスチックプレートを使用すると、細胞の解離が容易になり、プレートから細胞をこすり落とす必要がなくなります。
5. 非酵素的細胞解離溶液で血清学的ピペットを使用して皿を何度も洗い、円を描くように動かして、すべてのマクロファージが皿から解離していることを確認します。
6. すべての培養皿の溶液を円錐形の50 mL遠心分離チューブに集めます。
7. 10 mLの滅菌済み温温済みPBSを空の培養皿に加え、ステップ5.4と同様に進めます。この手順は、ステップ5.4の繰り返しであり、すべてのマクロファージが収集されることを保証することを目的としています。
8. 300 x g、4°Cで10分間遠心分離します。
9. 上清を捨て、ペレットを1 mLのDMEM/F12-10で再懸濁します。ピペットを使用してゆっくりと慎重に上下に均質化し、細胞の損傷を防ぎます。
10. 10 μL の Trypan Blue で希釈した 10 μL のマクロファージ溶液を調製し、血球計算盤を使用して細胞をカウントします。
    注:7日目には、各ディッシュは約2 x 10⁶ マクロファージを生成します。これは、10枚のプレートで収穫すると、1匹のマウスが約2 x 10⁷ の一次マクロファージを産生できることを意味します。M-CSFはマクロファージの成熟を促進するだけなので、この手順は、本質的にマクロファージであり、他の汚染性白血球を含まない細胞集団を保証する¹⁶。

マクロファージは、特殊な生理学的特性を持つ大きくて付着性の細胞です。それらは、ガラスやプラスチックに接着する能力のために、培養における多様な形態学的提示を示し、それらの典型的な広がりの形態は細胞質伸長の放出に関連しています(図1)。骨髄前駆細胞がL-929細胞上清からM-CSFに曝露され、成熟マクロファージへの形質転換を開始すると、ペトリプレートに付着するようになります。

図2 は、骨髄前駆細胞から成熟マクロファージへの変換の動態を示しています。3日目には、いくつかの未成熟マクロファージが現れ、そのほとんどが膜突起がほとんどない典型的な丸い形態を示します(図3)。それらはプロセス全体に沿って変化しますが、通常、現在のプロトコルの最大効率を保証するのに十分な数と成熟度を達成するためには7日間が必要です。

また、マクロファージは、大量の抗原性または非抗原性粒子を食作用させることができる食細胞(マクロ=大きい;ファゴス=食べる)です。表現型的には、表面分子F4/80およびCD11bの発現によって特徴付けられます。フローサイトメトリーによる分析は、本プロトコルを通じて得られたマクロファージが、サイズおよび粒度の点で均質な集団を表していることを示しています (図4)。 さらに、集団の100%がF4/80とCD11bを発現し、明確に定義された単一の細胞集団を形成しました。また、 リーシュマニア主要 寄生虫の食作用の解析では、莫大な食作用能力が示され、成熟した高分化型マクロファージであることが証明されました(図5)。

この研究で示された顕微鏡データは、Image Acquisition and Processing Center(CAPI-ICB/UFMG)の蛍光顕微鏡と位相差顕微鏡を使用して取得されました。

図1:骨髄前駆細胞に由来するマクロファージの培養、プレートに接着した状態での5日目の形態の変化。 マクロファージは、移動や食作用を可能にする長い細胞質拡張を放出します。輝度とコントラストは、微分干渉コントラスト(DIC)20倍フィルターを使用して画像取得後に調整しました。バー = 100 μm. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:1日目、3日目、5日目、7日目の骨髄前駆細胞から成熟マクロファージへの形質転換の動態 DIC 20xフィルターを使用して画像を取得した後、明るさとコントラストを調整しました。バー = 100 μm. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:3日目に軽く付着した未成熟マクロファージの存在で、膜の突起がほとんどない典型的な丸い形状の形態を示します。 輝度とコントラストは、DIC 20xフィルタを使用して画像を取得した後に調整しました。バー = 100 μm. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:骨髄由来マクロファージのフローサイトメトリー解析。 マクロファージをディッシュプレート(セルストリッパー)から分離し、抗F4/80 FITCおよび抗CD11b PE-Cy7で染色した。(A)サイズと粒度に基づく細胞の様相(FSC×SSC)。(B)F4/80およびCD11b細胞マーカーの発現。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図5: リーシュマニア主要 寄生虫の食作用後の蛍光顕微鏡分析。 マクロファージをプレートから切り離し、丸いガラスカバースリップに播種し、これに リーシュマニアの主要な 寄生虫を添加しました。この図は、マクロファージ内の食作用寄生虫を示しています。 リーシュマニアの主要 寄生虫をFITC抗リーシュマニア 抗体で染色し、細胞核(マクロファージおよび リーシュマニア主要)をヨウ化プロピジウムで対比染色しました。(A)20倍;(B)40倍。バー = 100 μm. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

著者は、利益相反がないことを宣言します。