S. cerevisiaeの減数分裂を研究するためのタイムラプス顕微鏡とタンパク質のステージ特異的核枯渇の使用

サマリー

タイムラプス顕微鏡は、出芽酵母の減数分裂を研究するための貴重なツールです。このプロトコルでは、細胞周期同期、タイムラプス顕微鏡、および標的タンパク質の条件付き枯渇を組み合わせて、減数分裂染色体分配中の特定のタンパク質の機能を研究する方法を実証する方法について説明しています。

要約

タイムラプス蛍光顕微鏡は、固定細胞のイメージングでは見られない時間的および空間的データを提供することにより、減数分裂細胞周期イベントの理解に革命をもたらしました。出芽酵母は、多くの減数分裂遺伝子が高度に保存されているため、減数分裂染色体分配を研究するための重要なモデル生物であることが証明されています。出芽酵母の減数分裂のタイムラプス顕微鏡検査により、さまざまな減数分裂変異体をモニタリングして、突然変異が減数分裂プロセスをどのように破壊するかを示すことができます。しかし、多くのタンパク質は減数分裂の複数の点で機能します。したがって、機能喪失または減数分裂ヌル変異体の使用は、初期のプロセスを混乱させ、後のプロセスをブロックまたは妨害し、個々の役割に関連する表現型を決定することを困難にする可能性があります。この課題を回避するために、このプロトコルでは、タイムラプス顕微鏡を使用して減数分裂イベントを監視しながら、減数分裂の特定の段階でタンパク質を核から条件付きで枯渇させる方法について説明します。具体的には、このプロトコルでは、細胞が前期Iでどのように同期されるか、アンカーアウェイ技術を使用して特定の減数分裂段階で核からタンパク質を枯渇させる方法、およびタイムラプスイメージングを使用して減数分裂染色体分配を監視する方法について説明します。この技術の有用性の例として、減数分裂中の異なる時点で動原体タンパク質Ctf19が核から枯渇し、減数分裂IIの終わりにクロマチン質量の数が分析されました。全体として、このプロトコルは、減数分裂を監視しながら、核から異なる核タンパク質を枯渇させるように適合させることができる。

概要

タイムラプス蛍光顕微鏡は、出芽酵母における減数分裂染色体分配のダイナミクスを研究するための貴重なツールです^1,2。出芽酵母細胞は、重要な栄養素の飢餓を通じて減数分裂を起こすように誘導することができます³。減数分裂の間、細胞は1ラウンドの染色体分配を受け、続いて2つの分裂を経て、胞子にパッケージ化された4つの減数分裂産物を作成します(図1)。個々の細胞は減数分裂の各段階で視覚化でき、固定細胞イメージングでは簡単に見逃すことができる空間的および時間的データを生成します。このプロトコルは、タイムラプス蛍光顕微鏡法と、以前に確立された2つの方法、誘導性NDT80システム(NDT80-in)およびアンカーアウェイ技術を組み合わせて、異なる減数分裂段階における特定のタンパク質の機能を研究する方法を示しています。

NDT80-inシステムは、中減数分裂転写因子NDT80 ^4,5の誘導発現に依存する減数分裂細胞周期同期のための強力なツールです。NDT80発現は、前期I出口^6,7に必要である。NDT80-inシステムでは、NDT80は、エストロゲン受容体(Gal4-ER)に融合したGal4転写因子を発現する細胞において、GAL1-10プロモーターの制御下にあります^4,5。Gal4-ERはβ-エストラジオールに結合した場合にのみ核に入るため、NDT80-in細胞はβ-エストラジオールの非存在下で前期Iで停止し、前期Iの細胞の同期を可能にします(図1)。β-エストラジオールの付加は、Gal4-ER転写因子の核への転座を促進し、そこでGAL1-10に結合してNDT80の発現を促進し、減数分裂への同期的な侵入をもたらします。タイムラプス顕微鏡は同期なしで実行できますが、同期を使用する利点は、細胞が減数分裂の特定の段階にある間に阻害剤または薬物を追加できることです。

アンカーアウェイ技術は、ラパマイシン⁸を添加することでタンパク質を核から枯渇させることができる誘導可能なシステムである。この技術は、酵母細胞が核膜が破壊されない閉鎖有糸分裂および減数分裂を経験するため、出芽酵母の細胞分裂中の核タンパク質の研究に理想的です。さらに、この技術は、減数分裂全体を通して複数の機能を有するタンパク質にとって非常に有用である。欠失、変異対立遺伝子、減数分裂ヌル対立遺伝子とは異なり、特定の段階で核から標的タンパク質を除去しても、初期段階での標的タンパク質活性が損なわれないため、結果をより正確に解釈できます。アンカーアウェイシステムは、リボソームの成熟時に発生する核と細胞質の間のリボソームサブユニットの往復を利用します⁸。核から標的タンパク質を枯渇させるために、リボソームサブユニットRpl13AがFKBP12でタグ付けされている株において、標的タンパク質はFKBP12-ラパマイシン結合ドメイン(FRB)でタグ付けされる。ラパマイシンがなければ、FRBとFKBP12は相互作用せず、FRBタグ付きタンパク質は核内に残る。ラパマイシンを加えると、ラパマイシンはFKBP12およびFRBと安定な複合体を形成し、複合体はRpl13Aとの相互作用により核からシャトルされます(図1)。ラパマイシン添加時の細胞死を防ぐために、細胞はTOR1遺伝子のtor1-1変異を保持している。さらに、これらの細胞には、S. cerevisiae FKBP12タンパク質のヌル対立遺伝子であるfpr1Δが含まれており、内因性Fpr1がFRBとラパマイシンの結合に関してRpl13A-FKBP12を凌駕するのを防ぎます。アンカーアウェイバックグラウンド変異であるtor1-1およびfpr1Δは、減数分裂のタイミングや染色体分配に影響を与えません²。

この技術の有用性を実証するために、動原体タンパク質Ctf19は減数分裂を通して異なる時点で枯渇した。Ctf19は、有糸分裂には欠かせませんが、減数分裂における適切な染色体分配に必要な動原体の成分です⁹、^10、11、^12、13。減数分裂では、動原体は前期Iで脱落し、Ctf19は動原体再組み立てに重要です^9,14。このプロトコルでは、NDT80-inシステムと細胞を同期させ、アンカーアウェイ技術を使用して、前期Iからの放出の前後で、および減数分裂後のI染色体分配後に標的タンパク質Ctf19を核から枯渇させました(図1)。このプロトコルは、減数分裂および有糸分裂の任意の段階で目的の他のタンパク質を枯渇させるように適合させることができる。

プロトコル

1. 必要資料の準備

1. 酵母細胞の増殖と胞子形成のための試薬を準備します。
   注:出芽酵母株が ade2 -および trp1-の場合は、ステップ1.1.1〜1.1.3のすべての培地に、1%ストックから0.01%のアデニンと0.01%のトリプトファンの最終濃度を補給します。オートクレーブで培地を滅菌する場合は、試薬をオートクレーブ滅菌し、室温まで放冷した後にのみ、これらのアミノ酸を添加してください。
   1. 栄養成長のために、アミノ酸を含まない6.7 gの酵母窒素塩基、2 gの完全アミノ酸ミックス、および20 gのデキストロースを500 mLの水に溶解することにより、2x合成完全+デキストロース培地(2XSC)を調製します。121°Cで20分間オートクレーブするか、0.2 μmフィルターでろ過して、混合物を滅菌します。
   2. 胞子形成の最初のステップでは、アミノ酸を含まない酵母窒素塩基6.7 g、完全アミノ酸ミックス2 g、酢酸カリウム20 gを500 mLの水に溶解することにより、2x合成完全+酢酸培地(2XSCA)を調製します。121°Cで20分間オートクレーブするか、0.2 μmフィルターでろ過して、混合物を滅菌します。
   3. 胞子形成の最終ステップとして、5 gのKAcを500 mLの水に溶解して1%酢酸カリウム(1%KAc)を調製します。121°Cで20分間オートクレーブするか、0.2 μmフィルターでろ過して、混合物を滅菌します。
2. 顕微鏡検査、同期、およびアンカー用の薬物と試薬を準備します。
   1. タイムラプスイメージング中に細胞をカバーガラスに接着させるには、1x PBSで1 mg/mLのコンカナバリンA(ConA)を作ります。フィルターは0.2 μmフィルターを使用して滅菌し、-20°Cで少量(~10 μL)のアリコートを保存します。
   2. NDT80-inシステムを使用するには、エタノールに溶解した1 mM β-エストラジオール2 mLを作ります。0.2 μmのフィルターを使用してフィルター滅菌し、アリコート(~500 μL)を-20°Cで保存します。
   3. アンカーアウェイシステムの場合、1 mg / mLのラパマイシンをDMSOに溶解させます。フィルターは0.2 μmフィルターを使用して滅菌し、-20°Cで少量(~10 μL)のアリコートを保存します。
      注:薬物の複数の凍結融解サイクルを回避するために、ラパマイシンの小さなアリコートを準備します。
3. NDT80イン系(P GAL1,10-NDT80/P_{GAL1,10-NDT80};GAL4-ER / GAL4-ER)およびアンカー離れた遺伝的背景にFRBでタグ付けされた標的タンパク質(tor1-1 / tor1-1; fpr1Δ / fpr1Δ;Rpl13A-FKBP12/Rpl13A-FKBP12)^4,8.この研究にはCtf19-FRBが使用されました。さらに、ヒストンタンパク質Htb2の1つのコピーをmCherryでタグ付けして、減数分裂の進行とクロマチン分離のモニタリングを可能にしました。
4. タイムラプスイメージング用のチャンバーを準備する
   1. イメージングの6時間から24時間前にチャンバーの準備を開始します(図2)。加熱メスまたはその他の鋭利な刃を使用して、ピペットチップボックスインサートから18 mm x 18 mmチャンバーを切り取ります。
   2. プラスチック製のピペットチップを使用して、カバーガラスに付着するチャンバーの下端の周りにシリコンシーラントの薄層を広げます。チャンバーの端が完全に覆われるように、十分なシーラントを追加します ( 図2を参照)。
   3. チャンバーをシーラント側を下にしてカバースリップにそっと置き、チャンバーを24 mm x 50 mmのカバーガラスに接着します。チャンバーが漏れないように、シーラントに隙間がないことを確認してください。
   4. 8〜10μLのConAをカバーガラスに広げます。ConAをカバーガラスの中央に分注し、ピペットチップを使用してConAを薄い層に広げ、チャンバーに囲まれたカバーガラスの大部分を覆うようにします。
      注:プラスチックチャンバーは無期限に再利用できます。タイムラプスイメージングが完了したら、かみそりを使用してカバーガラスからチャンバーを取り外し、チャンバーからシリコーンシーラントをきれいにし、チャンバーを将来の使用のために95%エタノールに沈めたままにします。

2.酵母細胞の胞子形成

1. 減数分裂プログラムを誘導するために酵母細胞の飢餓のために以下のステップを実行する。
   注:これらの手順は、酵母のW303株の胞子形成のためのものです。他の株は、異なるプロトコル¹⁵を必要とし得る。胞子形成効率はラボ株間で大きく異なり、W303は~60%の胞子形成効率を示します^16,17,18。
   1. プレートから適切な二倍体酵母株の単一コロニーを取り出し、2 mLの2XSCを接種し、ローラードラム上で30°Cで12〜24時間増殖させて飽和させます。
   2. ステップ2.1.1の培養液80 μLを2 mLの2XSCAに追加して、飽和培養液を2XSCAに希釈します。ローラードラム上で30°Cで12〜16時間成長させます。細胞が病気になったり、自己蛍光したりする可能性があるため、2XSCAに16時間以上放置しないでください。
   3. 培養液を800 x g で室温(25°C)で1分間スピンダウンし、液体を廃棄し、ペレットを2 mLの滅菌蒸留水に再懸濁して、2回の洗浄を行います。
   4. 2回目の洗浄後、液体を取り除き、ペレットを1%KAcの2mLに再懸濁し、ローラードラム上で25°Cで8〜12時間増殖させます。減数分裂に入った細胞は、前期Iのパキテンで停止します。
2. 前期I.放出システム
   1. β-エストラジオールを胞子形成培養液に直接最終濃度1 μMまで添加し、培養チューブを素早くボルテックスします。β-エストラジオールは前期Iから細胞を放出します。

3. アンカーアウェイ法による核からの標的タンパク質の枯渇

1. ラパマイシンを細胞に加え、特定の段階で核からFRBタグ付きタンパク質を枯渇させます。
   1. 前期I出口で核からタンパク質を枯渇させるには、β-エストラジオール添加と同時に、ラパマイシンを最終濃度1μg/mLまで胞子形成培養チューブに加えます。
   2. 減数分裂の特定の段階で核からタンパク質を枯渇させるには、β-エストラジオール添加後60分から始まる細胞周期段階をモニターします。20分ごとに、培養液5 μLを24 mm x 40 mmのカバーガラスにピペットで移し、細胞を18 mm x 18 mmのカバーガラスで覆います。ローラードラム上で培養物を回転させ、時点間で25°Cに保ちます。
   3. A594/mCherryフィルターと蛍光顕微鏡の60倍対物レンズを使用して細胞を画像化します。透過率を 2% に設定し、露光時間を 250 ms に設定します。1つ、2つ、または4つのDNA塊の存在は、細胞が進行した減数分裂段階を示します。目的の減数分裂段階でラパマイシンを最終濃度1μg/ mLまで添加します。
2. イメージングの準備が整うまで、ローラードラム上で細胞を25°C回転させ続けます。標的タンパク質の核枯渇は、ラパマイシン添加^2,8の30〜45分後に起こる。

4. タイムラプス蛍光顕微鏡

1. イメージング用の細胞の単層を作成するために使用される寒天パッドを作成します(ステップ4.2を参照)。
   1. キャップと1.5 mLマイクロフュージチューブの底部1/3を切り取り、廃棄してシリンダーを作成します。シリンダーは寒天パッドの型として機能します。寒天が最初のもので適切に重合しない場合に備えて、余分なシリンダーを持つために2つのシリンダーを作ります。
   2. カットしたマイクロフュージチューブシリンダーをきれいなガラススライドの上に置き、チューブの上部を逆さまにしてスライドに置きます。
   3. 50 mLビーカーに6 mLの5%寒天溶液(溶媒として1%KAcを使用)を作り、寒天が完全に溶解するまで電子レンジで加熱します。
      注意: 寒天は電子レンジで簡単に沸騰します。寒天を見て、寒天が沸騰し始めたら電子レンジを開始および停止します ビーカーを渦巻かせます。寒天を完全に溶解するために電子レンジを数回開始および停止します。寒天溶液は、寒天が完全に溶解することを確実にするために必要な量を超えて作られる。
   4. ピペットの先端を切り取って開口部を大きくし、~500μLの溶融寒天を各マイクロフュージチューブシリンダーにピペットで入れます。寒天が固まるまで(~10-12分)室温で放置します。
2. イメージングのための酵母細胞の準備
   1. ステップ3.2の胞子形成培養液200 μLを800 x g で1 mLの微量遠心チューブで2分間スピンダウンします。180 μLの上清を除去して廃棄します。チューブを旋回させてフリックすることにより、残りの上清にペレットを再懸濁します。
   2. ステップ1.4で作ったチャンバーの中央にあるカバーガラスの上に6μLの濃縮細胞をピペットします。
   3. 手順4.1で作成した寒天パッドでシリンダーを持ち、スライドガラスから慎重にスライドさせます。寒天の底部が完全に平らであることを確認し、ピペットチップの底部を使用して、寒天パッドがチューブの境界の少し上に押し出されるように、マイクロフュージ型にわずかな圧力を加えます。
   4. 寒天パッドがチャンバーに向かって下を向くように金型を反転させます。
   5. 鉗子を使用して、寒天パッド(まだ微量遠心管型内)を細胞の上にそっと置きます。ピペットチップを使用して、寒天パッドをチャンバーの周りに10〜20回静かにスライドさせ、カバーガラス上に単層の細胞を作成します。
   6. 寒天パッドをチャンバー内に12〜15分間放置します。このステップにより、セルがカバーガラスのConAに接着できるようになります。
   7. ステップ3.2の胞子形成培養液2 mLを2本の微量遠心チューブに移し、15,700 x g で2分間スピンします。上清をきれいな微量遠心チューブに移し、15,700 x g で2分間再び回転させます。上清を次工程で使用する洗浄用微量遠心管に移す。
      注:効率的な胞子形成と目的のタンパク質の継続的な枯渇を確実にするために、β-エストラジオールおよびラパマイシンとともに事前に調整されたKAc上清を使用することが重要です。
   8. 寒天パッドをチャンバー内に12〜15分間置いた後、イメージングする前に寒天パッドを浮かせて取り外します。これを行うには、ステップ4.2.7の上清2 mLをチャンバーに滴下します。液体がチャンバーの上部に到達すると、寒天パッドはおそらく浮遊します。
      注意: 寒天パッドが自動的に浮かばない場合は、1〜2分待ちます。それでも寒天パッドが浮かない場合は、鉗子でそっと取り除きます。理想的には、寒天パッドは、浮遊する前にそれを取り除くと細胞の除去につながる可能性があるため、それ自体で浮遊するであろう。
   9. 寒天パッドが浮いたら、鉗子でそっと取り除き、廃棄します。イメージング中の蒸発を防ぐために、チャンバーの上部に24 mm x 50 mmのカバーガラスを置きます。
3. 顕微鏡で動画を設定する
   注意: 以下の手順は、24 mm x 50 mmのカバーガラスを収容するスライドホルダーを備えた倒立顕微鏡用です(顕微鏡、カメラ、およびソフトウェアの詳細については、 材料の表 を参照してください)。画像取得には、60倍の油浸対物レンズが使用されます。このプロトコルは、他の顕微鏡または他のスライドホルダーを使用する場合に変更する必要があるかもしれません。ステップ4.3.2からステップ4.3.16を実行するための正確な手順は、使用する顕微鏡およびイメージングソフトウェアによって異なります。別の顕微鏡の手順については、セクション4.4を参照してください。
   1. カバーガラスをスライドホルダーの内側に取り付けます。成形粘土をカバーガラスの側面に接着して、スライドホルダーにしっかりと固定します。
   2. 画像取得ソフトウェアを開きます。コースと微調整ノブを使用して、DICまたは明視野を使用してセルに焦点を合わせます。
   3. 画像取得ソフトウェアのメインメニューで、[ ファイル]>[取得(3Dの解決)]をクリックします。3つのウィンドウがポップアップします。
   4. [3Dを解決]という名前のウィンドウで、 三角フラスコ アイコンをクリックします。これにより、[ 実験の設計/実行]というタイトルのウィンドウが開き、タイムラプスムービーを設定するための実験を設定するためのコントロールが含まれています。
   5. [ デザイン ]タブで、[ セクショニング]というラベルの付いたタブに移動します。 [Z 断面]の横にあるボックスを選択します。zスタックを次のように設定します:光学セクション間隔= 1 μm、光学セクションの数= 5、サンプル厚さ= 5.0 μm。
   6. [チャンネル]タブで、[+]アイコンをクリックして、1つのチャンネルオプションを表示します。適切なチャンネルを選択します。この実験では、mCherryの画像化に使用されるA594を選択します。[参照画像] の横にあるボックスを選択し、ドロップダウン メニューから Z 位置をサンプルの中央に設定します。
   7. %TとExp.の横にあるドロップダウンメニューから値を選択して、透過率と露光時間をそれぞれ設定します。この実験では、A594 チャネルで 2% の透過率と 250 ミリ秒の露光時間を使用し、明視野に 10% の透過率と 500 ミリ秒の露光時間を使用します。
      注:露光時間と透過率は顕微鏡によって異なります。過剰露光を避けるために、目的のタンパク質を適切に可視化できるように、可能な限り低い透過率と最短の露光時間を使用してください。
   8. [タイムラプス]タブで、[タイムラプス]の横にあるボックスを選択します。表示される表で、タイムラプス行の最小列に 10 を入力し、合計時間行の時間列に 10 を入力します。これにより、10分ごとに10時間画像を撮影するタイムコースが実行されます。
   9. 「 究極のフォーカスでフォーカスを維持 」の横にあるボックスを選択して、ムービー中のステージドリフトを防ぎます。[ ポイント ]タブで、[ ポイント リストを訪問]の横にあるボックスを選択します。
   10. メインメニューで、[ ポイントリストを表示]>をクリックします。ポイントリストというウィンドウがポップアップ表示されます。細胞の単層を示すチャンバーの領域にステージを移動します。ポイントリストウィンドウで ポイントマーク をクリックします。
   11. ステージを移動して、セルの露出オーバーを避けるために、オーバーラップせずに25〜30ポイントを選択します。各フィールドは、各タイム コース中に画像化されます。
   12. ポイント リスト ウィンドウで、[すべてキャリブレーション]を選択して、各ポイントの最終的なフォーカスを設定します。[設計/実験の実行]ウィンドウの[設計]タブで、[ポイント リストを表示]の横にあるボックスにポイント値の範囲(ポイント リスト ウィンドウから取得)を入力します。[ファイル名を指定して実行] タブで、コンピューター上の適切な保存先にファイルを保存します。[実験の計画/実行] ウィンドウで、[再生] ボタン (緑色の三角形のアイコン) を選択してムービーを開始します。
4. オプションの方法:顕微鏡で動画を設定する
   注:これらの説明書は、24 mm x 50 mmのカバーガラスを収容できるスライドホルダーを備えた倒立顕微鏡用です。使用する顕微鏡、カメラ、およびイメージングソフトウェアの仕様については、 材料表 を参照してください。画像取得には、60倍の油浸対物レンズが使用されます。
   1. カバーガラスをスライドホルダーの内側に取り付けます。画像取得ソフトウェアを開きます。コースノブと微調整ノブを使用して、DICまたは明視野を使用してセルに焦点を合わせます。ソフトウェアの開いているウィンドウを右クリックします。ドロップダウンメニューが表示されます。
   2. [ 取得コントロール] > [取得] をクリックします。[ アプリケーション] をクリックし> [実験を定義/実行] をクリックします。これにより、[ ND取得]というラベルの付いたウィンドウが開きます。
   3. 開いたウィンドウで、[ XY]の横にあるチェックボックスをオンにします。ステージを目的の位置に移動し、[ ポイント名 ] の下のボックスをクリックして、その位置をポイントとして選択します。セルの露出オーバーを避けるために、25〜30ポイントがオーバーラップせずに選択されるまでこれを繰り返します。各フィールドは、各タイム コース中に画像化されます。
   4. 蛍光チャンネルごとに透過率を設定します。菌株はHtb2-mCherryを生成するため、ここではmCherryフィルターを使用します。手順 4.3.3 で開いた [取得] ウィンドウで、[555 nm] ボタンに移動します。555 nmボタンの下のスライドスケールを5%になるまで調整して、透過率を5%に設定します。
   5. 蛍光チャンネルごとに露光時間を設定します。 [取得 ]ウィンドウで、[露出]ドロップダウンメニューから 200ミリ秒 を選択します。
      注:露光時間と透過率は顕微鏡によって異なります。過剰露光を避けるために、目的のタンパク質を適切に可視化できるように、可能な限り低い透過率と最短の露光時間を使用してください。
   6. ND集録ウィンドウのZの横にあるボックスをクリックします。1.2 μM離れた酵母細胞のzスタックを5つセットします。
   7. λの横にあるボックスをクリックします。実験に使用する適切なチャネルを選択します。DICの場合は、Z位置の下のドロップダウンメニューから[ホーム]が選択されていることを確認します。mCherryの場合は、Z位置の下のドロップダウンメニューから[すべて]が選択されていることを確認します。これにより、1 つのセクション (z スタックの中央) のみが DIC 用に取得されます。
   8. [ND集録]ウィンドウで[時間]の横にあるボックスを選択します。[フェーズ] の下のボックスを選択します。[間隔] の下のドロップダウン メニューで、[10 分] を選択します。[期間] で [10 時間 (s)] を選択します。これにより、画像が10分ごとに10時間撮影されるようにタイムコースが実行されます。

5. クロマチン分配の解析

1. フィジーソフトウェアを開きます。一度に 1 つの視野を開きます: フィールドごとに、DIC チャンネルと mCherry チャンネルを開きます。
2. 単一の画像を得るためにmCherryチャンネルの最大強度投影を取ります: Zプロジェクト>画像>スタックをクリックし、 ドロップダウンメニューから 最大強度 を選択します。
3. DICチャンネルとmCherryチャンネルを1つの画像にマージする: 画像>カラー>チャンネルをマージをクリックします。
4. 減数分裂を通して単一の細胞をたどります。減数分裂IIの完了後、DNA質量の数を記録します。

結果

クロマチン分離をモニターするために、ヒストンタンパク質Htb2をmCherryでタグ付けした。前期Iでは、クロマチンは単一のHtb2塊として現れる。相同染色体が最初の減数分裂で分離した後、クロマチンは2つの異なる塊として現れます(図3A)。姉妹染色分体が分離した後、クロマチンは4つの塊として現れる。一部の染色体が紡錘体微小管に付着しない場合、減数分裂Iまたは減数分裂IIの後に追加の腫瘤が見られます。

上記の方法は、出芽酵母減数分裂における適切な染色体分配を確実にする上での動原体成分Ctf19の役割を研究するために使用された。FRBでタグ付けされたCtf19を発現するアンカーアウェイ酵母株を、NDT80-inシステム(tor1-1;fpr1Δ;RPL13A-FKBP12;CTF19-FRB;GAL1-10はNDT80をプロモートしました。GAL4-ER)。対照として、アンカーアウェイ株をバックグラウンドでFRBタグ付きタンパク質を含まないNDT8...

ディスカッション

このプロトコルは、細胞を同期させるNDT80-inシステム、核からタンパク質を枯渇させるアンカーアウェイ技術、および減数分裂中の出芽酵母細胞を画像化する蛍光タイムラプス顕微鏡を組み合わせたものです。NDT80-inシステムは、前期Iの停止と放出を利用する減数分裂細胞周期同期のための方法です^4,8。個々の細胞は、その後の減数分裂の各段階で費やされる時間量がわずかに異なりますが、ほとんどの細胞は減数分裂全体を通して高度な同期を維持します。

アンカーアウェイ技術は、有糸分裂および減数分裂研究に適応可能なツールです。ラパマイシン添加のアンカーアウェイ標的タンパク質および時間を変更することにより、この方法は、出芽酵母減数分裂の任意の段階における様々なタンパク質を研究するように適合させることができる。出芽酵母有糸分裂を研究するために条件付き変異体を作製するための一般的な方法は、減数分裂研究に必ずしも適していない。例えば、抑制可能なプロモーター...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
β-estradiol	Millipore Σ	E8875	95% EtOH
0.22 uM Threaded Bottle-top Filter Millipore	Sigma	S2GPT02REΣ 100
% EtOH	Fisher Scientific	22-032-601
10X PBS	Fisher Scientific	BP399500	の溶剤として使用するために1:10を希釈
	します。北米	48393241
25 mm x 75 mm 顕微鏡スライド	VWR 北米	48300-026
アデニン半硫酸塩	ミリポアシグマ	A9126	SC、SCA、および1% Kac
Bacto 寒天培	BD	214030
コンカナビアリン A	ムリポア シグマ	C2010	カメラで 1mg/mL として製造
		セクション4.3	測光
D-グル	コース フィッシャーサイエンティフィック	D16-10
ディフコ酵母 窒素塩基 アミノ酸なし	BD	291920
ジメチルスルホキシド(DMSO)	ミリポアシグマ	D5879
エクリプス Ti2 倒立対物レンズ マイクロスコープ	ニコン		セクション4.4で使用
フィジー	NIH		https://fiji.sc/
GEパーソナルデルタビジョン顕微鏡	4.3	応用精度
L-トリプトファン	ミリポアシグマ	T0254	SC、SCA、および1%Kac
モデリングクレイ	クレヨラ	2302880000	スライドホルダーにカバースリップを固定するには
NIS-Elements AR 5.30.04 イメージングソフトウェア	コン		セクション4.4で使用
ORCA-Fustion BTカメラ	浜松	C15440-20UP	セクション4で使用
プラスチックピペットチップホルダー	ドットサイエンティフィック	LTS1000-HR	本製品のラック部分の4角×4角を切り取ります。
Pottassium Acetate	Fisher Scientific	BP264
Rapamycin	Fisher Scientific	BP29631	1mg/mL のストックを作成します
			。
SoftWorx7.0.0 セクション	4.3で使用された	精密
合成完全混合物(カイザー)	フォーミディアム	DSCK2500
タイプN浸漬油	ニコン	MXA22166