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方法論記事

マウス胎児の構造的心臓欠損を特徴付けるパイプライン

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DOI:

10.3791/64582

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2022年12月16日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Developmental Biology, University of Pittsburgh, 2Department of Biological Sciences, University of Pittsburgh, 3Département de Biologie, École Normale Supérieure de Lyon, 4Department of Critical Care Medicine, University of Pittsburgh

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

この記事では、胎児心エコー検査、剖検、およびエピスコピック共焦点顕微鏡(ECM)を使用したエピスコピック蛍光画像キャプチャ(EFIC)を使用したマウス先天性心疾患(CHD)診断方法とそれに続く3次元(3D)再構成について詳しく説明します。

要約

先天性心疾患(CHD)は、米国における乳児死亡の主な原因です。1980年代以前には、中等度または重度のCHDのほとんどの患者は成人期前に死亡し、生後1週間で最大の死亡率を示しました。外科的技術、診断アプローチ、および医学的管理の目覚ましい進歩により、転帰は著しく改善されました。先天性心疾患を理解するという重要な研究ニーズに対応するために、マウスモデルは人間と心臓の解剖学的構造が非常に似ており、妊娠率が短いため、理想的な研究プラットフォームを提供してきました。遺伝子工学とハイスループット表現型ツールの組み合わせにより、構造的な心臓欠陥の複製と診断が可能になり、CHDの背後にある分子経路をさらに解明することができました。非侵襲的胎児心エコー検査を使用してマウスモデルの心臓表現型をスクリーニングし、エピスコピック共焦点顕微鏡(ECM)組織病理学と3次元(3D)再構成を使用したエピスコピック蛍光画像キャプチャ(EFIC)の高忠実度を組み合わせることで、さまざまな先天性心疾患の解剖学的構造を詳細に見ることができます。このプロトコルは、マウス先天性心疾患の正確な診断を得るためのこれらの方法の完全なワークフローを概説しています。この表現型プロトコルをモデル生物に適用することで、正確なCHD診断が可能になり、CHDのメカニズムに関する洞察が得られます。CHDの根底にあるメカニズムを特定することは、潜在的な治療法と介入の機会を提供します。

概要

先天性心疾患(CHD)は最も一般的な新生児先天性欠損症1,2であり、新生児の約0.8%〜1.7%に影響を及ぼし、重大な新生児死亡率と罹患率をもたらします3。遺伝的病因はCHD4,5で強く示されています。遺伝子改変マウスモデルは、マウスとヒトの胎児において4腔心臓と同等の心臓発達DNA配列を有するマウスに起因するCHDの複雑さとそれらを引き起こすメカニズムを理解するために広く使用されてきた6。マウス変異体の表現型を特定することは、標的遺伝子の機能を特徴付けるための基本的な最初のステップです。単一の遺伝子変異がヒトCHDを模倣する心臓欠陥のスペクトルをもたらす可能性がある遺伝子投与量効果を発現するマウスモデルは、CHDの複雑さとそれらを引き起こすメカニズムを理解するために重要です。

この記事では、マウスモデルにおける心臓表現型を特徴付けるためのパイプラインの概要を説明します。適用された方法は、胎児心エコー図7、続いて剖検およびECM組織病理学7,8を利用し、発達中のマウス心臓表現型の詳細な解剖学的構造を表示できます。胎児心エコー図は、合理的な画像解像度で複数の胚を直接視覚化できる非侵襲的なモダリティです。さらに、胎児心エコー図は、同腹仔の胚の総数、それらの発達段階、および子宮角の相対的な向きと位置を迅速に決定します。スペクトルドップラー/カラーフローを使用して、構造、血行動態障害、成長制限、または水腫の発生に基づいて異常な胚を特定できます。胎児心エコー図検査は非侵襲的な技術であるため、数日間スキャンし、血行動態や心臓形態の変化を観察するために使用できます。胎児心エコー図の高品質な画像を取得するには、経験と知識が不足しているために特定の心臓の欠陥が見逃される可能性があるため、練習とスキルが必要です。このため、剖検とECM組織病理学の組み合わせにより、心臓形態のより明確な分析が得られる可能性があります。剖検は、アーチ構造、大動脈と肺動脈の相対的な関係、心室と心房のサイズ、胸部に対する心臓の位置、および気管支肺構造を直接視覚化します。ただし、心臓弁や壁の厚さなどの内部の特徴は、剖検だけでは評価が難しい場合があります。したがって、ECM組織病理学は決定的な診断に推奨されます。ECM組織病理学は、画像スタック9の2Dおよび3D再構成の両方を可能にする高解像度の視覚化技術である。これらの画像は、パラフィン包埋サンプルを自動ミクロトームによって一定の間隔で薄く切片化した連続エピスコピック蛍光イメージングによって得られます。古典的な組織学とは異なり、画像はブロックから切り取られる前にセクションとしてキャプチャされ、すべての画像が同じ参照フレーム内でキャプチャされます。このため、ECM組織病理学によって生成された2D画像スタックは、容易かつ確実に3次元で再構築することができます。これは、DICOMビューアを使用して行われ、コロナ、矢状、横の3つの解剖学的平面の画像を3D視覚化できます。これらの高解像度3D再構成から、決定的な心臓診断が行われる可能性があります。これら3つの異なる視覚化モダリティを個別または組み合わせて適用することで、マウス胚の構造的心臓欠陥の正確な特性評価を提供できます。

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プロトコル

マウスはヒトCHDを模倣できる4室の心臓を持っているため、これらの研究にマウスを使用する必要があります。 マウスは獣医ケアを受け、施設の実験動物管理評価認定協会(AAALAC)認定の動物飼育施設に収容されました。マウスの不快感、ストレス、痛み、および怪我を最小限に抑えるために、厳格なプロトコルに従いました。マウスは、安楽死に関する米国獣医師会ガイドラインに従って小型げっ歯類に許容されるCO2 ガスを使用して安楽死させた。この原稿のマウスに関する研究は、ピッツバーグ大学で承認されたIACUCプロトコルを使用して実施されました。

1.胎児心エコー図

注:心エコー図は、マウスの心血管奇形と心臓外障害を特定するための強力なツールです。マウス胚のサイズが小さいため(妊娠中期に約1〜2 mm、出生時に3.5 mm)、超音波生体顕微鏡(UBM)を備えた超高周波心エコー検査装置が必要です。UBMは、一度に1匹のマウス胎児を視覚化するための解像度(軸方向30 μm x 68 μm)を提供する小さなイメージングウィンドウ(15 mm x 14 mm)を備えたさまざまな高周波(30〜50 MHz)プローブを提供します。40 MHzトランスデューサは、心血管表現型を識別するための高解像度画像を提供します7。

  1. 心エコー検査装置の電源を入れ、プログラム 心臓病学を選択します。
    注:次のプロトコルは、胎児の日(E)14.5から19.5までの任意のマウスバックグラウンドに使用できます。
  2. 麻酔導入チャンバーで目的のマウスを麻酔します。4%のイソフルランと医療用酸素の濃度を1 L / minの流量で麻酔を誘発し、維持のために2%〜3%に減らします。
  3. マウスをイメージングプラットフォームにすばやく置きます。イメージングプラットフォームは、処置中にマウスを暖かく保つためにスチールを加熱しています。マウスの口と鼻を麻酔鼻コーンに入れます。動きを避けるために手足をテープで固定します。心拍数を監視して、400〜450bpmの間にとどまるようにします。
  4. 直腸温度計プローブを使用して温度を監視し、37°C±0.5°Cにあることを確認します。 低酸素を避けるために呼吸を監視します。危害を防ぐために、プローブに穏やかな力をかけてください。
    注意: ヒートランプをマウスの上に設定して、麻酔下での低体温を防ぎ、麻酔から回復することができます。ワセリン眼科用軟膏は、ドライアイを避けるための潤滑剤として使用することができます。
  5. 脱毛クリームを使用して胸部と腹部から毛皮を取り除きます。クリームを塗り、3分待ってから取り出します。70%エタノールでその領域をきれいにします。エタノールはシェービング潤滑剤として水よりも効果的です。
  6. 超音波ゲルを通常の体温に温めます。超音波ゲルをたっぷりと塗布し、トランスデューサーを腹部に配置して水平面に向け、画面上の膀胱を識別します。膀胱が特定されたら、膀胱から頭蓋をスキャンして胎児を探します。クラウンからランプまでの長さを測定して、在胎週数10 を決定します(図 1および 表1)。
    メモ: 探触子の位置を変更して、横方向の4チャンバー、矢状、正面/冠状のイメージング面など、さまざまな面を視覚化します7 (図1)。
  7. カラードップラーを使用して、心臓からの血流を分析します。
  8. 胚が意図した段階に達していない場合は、マウスをケージに戻します。それ以外の場合は、マウスを収穫用に準備します。
    注意: マウスをケージに戻す前に、マウスがすでに目を覚まし、麻酔から十分に回復していることを確認してください。
  9. イソフルランと酸素をオフにし、作業領域を清掃し、機械の電源を切ります。
    注意: 探触子からゲルを取り除くことが重要です。

2.剖検

注:胎児心エコー検査を使用して異常な心臓表現型が疑われると、胎児を収集し、固定液(10%緩衝ホルマリンリン酸または4%パラホルムアルデヒド(PFA)のいずれか) に全身を 浸して固定します。サンプルの外部および内部の形態を検査し、巨視的な解剖学的異常または奇形を探します。

  1. マウスを準備します。
    1. マウスが成体の場合、標準のCO2 プロトコルを使用してマウスを安楽死させます。鉗子または解剖ハサミを使用して外側胸部と腹部を切開(約3 cm)し、固定液を内臓に浸透させます。
      注:胚がE24より古い場合、サンプルは剖検前に少なくとも14.5時間固定する必要があります。
  2. 体の外側を分析します。
    1. サンプルの識別、顕微鏡の倍率、画像の内容など、名前を付けて画像を保存するようにソフトウェアを設定します。
      注:1.0倍から3.2倍の倍率は、E14.5マウス以上のほとんどの構造をイメージングするのに十分なはずです。
    2. 実体顕微鏡レンズの下のプレートにマウスを置きます。プレートにリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を充填してサンプルを完全に覆い、写真の脱水や反射を防ぎます。画面に胚全体が含まれるように倍率を調整してから、胚の左側と右側の両方を撮影します。
      注意: プレートの底部は、ピン留めを容易にするために、パラフィン、シリコン、または別のそのような基板でコーティングする必要があります。
    3. サンプルを上向きにして喉にピンで留め、別の写真を撮ります。
      注意: ピンを少し上に向けて、胸腔の重要な構造に穴が開いていないことを確認します。
  3. 胸を分析します。
    1. 鉗子で首の真ん中の皮膚を持ち上げながら、ハサミで両方の脇の下に向かって皮膚を切り、中央軸に沿って尾に向かって皮膚を切ります。次に、臍から脚まで皮膚を切ります。手首と足首にサンプルを固定します。
      注意: 皮膚だけを切るように注意してください。はさみの刃を水平に保持するか、上向きに角度を付けることをお勧めします。
    2. 結合組織を切り離すには、一方の鉗子で皮膚を持ち上げ、もう一方のペアで下にある組織を所定の位置に保持します。サンプルを皮膚にピンで留めて、胸部と腹部を露出させます(図2)。
      注意: ピン留め、切断、またはこすっているときに伸ばしすぎると、組織が損傷する可能性があります。
    3. 露出した筋肉の写真を撮り、筋肉をそっとこすり落として肋骨を露出させます。
    4. 露出した肋骨の写真を撮ります。リブをダイヤフラムから分離し、両側のリブを首に向かって横軸上で可能な限りカットします。
    5. 切り取られた肋骨を取り除いて心臓を露出させます。心臓の写真を撮ります。
    6. 胸腺を1対の鉗子で剥がして取り除きます。もう一方の鉗子を使用して胸腺の基部を安定させ、下にある血管を引き裂かないようにします。心臓と大きな血管の写真を撮ります。
      注:ピンを使用して隣接する構造を引き伸ばすと、より良いイメージングビューが得られる場合があります。さらに、大動脈、心臓、およびその他の関心のある構造に焦点を当てた別々の写真を撮ります。
  4. 腹部を分析します。
    1. 横隔膜を引っ張って取り外し、肝臓を露出させます。写真を撮ります。
    2. 肝臓をピンで留めて、胃と膵臓を露出させます。写真を撮ります。
    3. 食道を切る。結腸と腸を鉗子で引き抜いて取り除きます。肝臓のすぐ上を切り、それを取り除くと腎臓と副腎が現れます。写真を撮ります。
      注:除去した臓器は固定液に保管してください。
  5. ECM分析のために胸郭を分離します。
    1. 肝臓と肺の間の直線に沿って下胸部を切ります。頸動脈の枝を切らないように十分に高く頭を切り落とします。
    2. 背肋骨と背骨を維持しながら、外側肋骨をそっと取り外します。背側の脂肪をはがしてこすり落とします。
    3. 胸部を体の他の部分から切り離し、10%緩衝リン酸ホルマリン溶液に入れます。

3. 埋め込み

  1. 固定液を適切な有害廃棄物ボトルにデカントします。サンプルを1x PBSで15分間3回洗浄します。
  2. 濃度を上げるエタノールとキシレンを使用して、サンプルを脱水します。以下のすべてのステップの期間は、胚の段階によって異なります。詳細については、 表2 を参照してください。
    注意: サンプルの損傷を避けるために、溶液を変更するときは注意が必要です。サンプル処理に最適なパラメータは、経験的に調整できます。キシレンは特定のプラスチックを溶解します。ガラス器具と容器を使用する必要があります。
  3. キシレンをパラフィンと交換して、希望の期間使用します。ボトルを65°Cのインキュベーターに適切な時間放置します(表2)。
  4. 新鮮なパラフィンを使用して、サンプルを目的の位置に埋め込みます。
    注意: サンプルをパラフィンブロックの中央に向け、背側を上に向けて、後側をブロックの前面に向けることをお勧めします。サンプルの向きを決めるときは、ブロックを逆さまにしてサンプルが埋め込まれていることに注意してください。

4. エピスコピック共焦点顕微鏡(ECM)

注:適切な埋め込みの後、胚は組織病理学分析のためにECM を介して 連続的に画像収集を受けます。個々のスライドは、さらなる研究のためにミクロトームから回収することができます。

  1. -20°Cの冷凍庫からパラフィンブロックを取り出し、金型を取り出します。
  2. かみそりの刃を使用して、カセットの端と背面のワックスをトリミングします。カセットに取り付けられたワックスの小さな正方形に包まれるまで、サンプルを囲むワックスをカットします。
    注意: ブレードを取り扱うときは細心の注意を払ってください。
  3. 金属製のレバーを使用して、パラフィンブロックをミクロトームのスライスステージに固定します。実行モードでMAN(手動)機能を選択し、パラフィンの表面をブレードに近づけ、数回スライドを実行して、ブレードがパラフィンブロックに接触することを確認します。
  4. LAS AFアプリケーションを開き、マトリックススクリーナーを選択します。[単一の通常の行列] を選択し、以前に保存した適切なテンプレートを読み込みます。クイックLUTボタンをクリックして、白とオレンジのオンブルに切り替えます。
  5. [ジョブの設定]を選択し、405nmの可視レーザーを最大までドラッグします。スペクトルブロックの左端を405 nmの線に合わせ、右端を800 nmの線にドラッグします。ピンホールオプションをマークして、ライブビューを開始します。
  6. レーザー投影の位置を調整して標本を画面の中央に配置し、 ズーム ノブを~20倍に調整します。解像度を最適化するには、ゲインを1,250 Vに設定し、フォーカスノブを使用して青色の領域を最大化します。次に、イメージングのためにゲインを約750Vにリセットします。
    注:具体的な値は、胚の状態によって異なる場合があります。
  7. 切断方法を Autoに切り替え、厚さを50μm前後に設定して、スライドを実行します。肺と気道が見えたら切断を停止します。
  8. 8〜10μmの切断厚さを選択し、 ライブ を停止します view. ミクロトームコミュニケーター を開いてイメージングを開始します。画像を収集する前に、一時ストレージフォルダが空であることを確認してください。
  9. 追加の心臓構造が視覚化されていない場合は、切断を停止します。 Microtome Communicator アプリケーションを終了し、後で3D再構成するために画像処理ソフトウェア を介して 一時ファイルを1つの.tiff画像シリーズにエクスポートします。

5. 3次元(3D)再構成

注:3D再構成の目的は、ECMイメージングからの2D画像スタックを冠状、矢状、および横方向の3Dビデオに処理し、サンプルの構造的および解剖学的異常の診断に3Dビデオを使用することです。

  1. 画像処理ソフトウェアでECM画像スタックを開きます。
    1. ファイルを画像処理ソフトウェアにドラッグアンドドロップします。ECM 画像を水平方向に反転するには、メニューバーで [ 画像>変換] > [水平方向に反転 ] を選択します。
    2. 反転した画像を保存し、画像処理ソフトウェアを閉じます。
  2. DICOM表示ソフトウェアにECM画像スタックをインポートします。
    1. 水平方向に反転したECM画像をDICOM表示ソフトウェアにドラッグアンドドロップします。サンプルリストの周囲に水色の境界線があるか、既存のサンプルフォルダに画像が追加されていることを確認してください。
    2. ポップアップウィンドウが表示されたら、データベースにコピーするリンクまたはファイルを選択します。DICOM表示ソフトウェアにコピーされたファイルと同じ名前の新しいサンプルがサンプルリストに表示されます。
    3. 新しく追加したファイルをクリックして開きます。
  3. 3D 再構築を実行します。
    1. ファイルを開いたら、ツールバーの [2D / 3D再構築ツール ]メニューをクリックし、[ 3D MPR]を選択します。
    2. ピクセル X 解像度と ピクセルY解像度は、ECMイメージング中に使用するズームを指定して画像解像度を入力します。スライス間隔には、ECMイメージング中にカットに使用する スライスの厚さを入力します。
      注意: カメラの解像度はカメラのズームによって変化し、カメラごとに異なる場合があります。
  4. 左側の[ ツール ]タブのさまざまなツールを使用して、必要に応じて画像スタックを調整します。
    1. WW / WLツールを使用して、ウィンドウ幅とウィンドウレベルを調整します。画像上のツールをクリックして上方向にドラッグすると画像の明るさが下がり、下向きにドラッグすると画像の明るさが上がります。画像のツールをクリックして右にドラッグすると画像のコントラストが下がり、左にドラッグするとコントラストが上がります。
      注意: ある構造に最適なWW / WL設定が、別の構造では最適ではない場合があります。このため、異なる構造を表示するために別々のビデオを作成することをお勧めします。
    2. パンツールを使用して、画像を目的の位置にドラッグします。ズームツールを使用して画像を必要に応じて拡大または縮小し、回転ツールを使用して画像を必要に応じて回転させます。
      注意: 画像を拡大すると、画質が低下する場合があります。画像を回転させると軸が反転する可能性があるため、注意してください。
  5. 最初のパネルの色付き軸をクリックしてドラッグします。この軸を回転させると、他の 2 つのパネルの向きがどのように変化するかに注目してください。3つのパネルがサンプルのコロナ、矢状、および横方向のビューを表すまで、3つのパネルの軸を回転させます。
    注意: サンプルの向きを変えるときは、正しい前後の向きを維持してください。
  6. ビデオを生成します。
    1. 3つのパネルすべてを適切に配置、向き、明るくしたら、コロナビューを表すパネルをクリックします。
    2. メニューバーの右側にある [ムービーのエクスポート ]をクリックします。 [バッチ] をクリックし、[ 開始 ] スライダーと [終了 ] スライダーをドラッグして、対象領域全体を囲みます。 [間隔]で、[ 厚さと同じ ]オプションを選択します。ビューの向きを示すビデオを保存します。
    3. ビデオを確認して、関心のある構造を適切に識別できるかどうかを確認します。そうでない場合は、ツール(手順5.4)を使用して、必要に応じてビデオを再調整し、ビデオを再保存します。
  7. 横方向と矢状ビューに対して手順 5.6 を繰り返します。再構築されたビデオを使用してサンプルを診断します。
    注意: 各向きのビデオを注意深く見て、サンプルが解剖学的異常または疾患表現型を示すかどうかを完全に評価します(図3)。

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結果

重大な血行動態障害を有するマウス胚は、胚致死であることが指摘された。さまざまなビューを使用した高出力の非侵襲的胎児心エコー図により、さまざまなCHDを特定できます(図1)。

中隔欠損症:最も一般的なCHDは、心室中隔欠損症(VSD)、房室中隔欠損症(AVSD)、心房中隔欠損症(ASD)などの中隔欠損症です1。VSDまたはAVSDは、2D画像とカラーフロー画像を使用して簡単に視覚化できます。心室を横切る、または心房と心室の間の血流を簡単に識別できます(図3)。ASDは、胎児の卵円孔開存症と区別することは困難です。

流出路の異常:図3に示すように、主肺動脈における流れは、正常胚における上行大動脈流を横切る。右心室の二重出口(DORV)を有す...

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ディスカッション

遺伝子改変マウスは、先天性心疾患の病態メカニズムを理解するために使用されています。この研究で提供するプロトコルは、マウス胎児の心臓の欠陥を評価するプロセスを合理化および標準化しようとしています。ただし、プロトコル中に注意すべき重要な手順があります。マウスの胚は妊娠の各日に有意に成長し、胎児の心エコー図を正確に行うことでマウスを採取する正確な時期を決定することができます。胎児心エコー図は、胎児の心血管病理をスクリーニングするために使用できます。2D画像は、血流を調べ、心臓の腔または異常な流出と流入路の間の通信を検出するためにカラードップラーの助けを借りて、異常な解剖学的構造と心機能の識別を可能にします。CHD診断を決定するために、胎児は、流出路中隔および心腔形成が完了した胚の日E14.5からスキャンされる。初期段階でのスキャンは、発達の遅れを反映している可能性があります。

組織病理学は、ミクロトームとそれに続く光学顕微鏡の視覚化を使用してCHD8を特徴付けるための標準です。標準的な方法の主な欠点は、診断のための心血管構造の直感的な3D表...

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開示事項

著者は、この原稿で利益相反を宣言しません。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1x リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)、PH7.4Sigma AldrichP3813
1.5 mL Eppendorf チューブ (または組織保存用の優先バイアル)SealRite1615-5599
10% 緩衝ホルマリンリン酸溶液Fisher ChemicalSF100-4
100% EthanolDecon Laboratories2701
16% パラホルムアルデヒド (PFA)固定剤 ThermoScientific289084% 使用濃度 1x PBS で新たに調製 4 °C;C
50 mLチューブFalcon352070
6–12ウェルプレートまたは20mLバイアル 胚保存用Falcon353046
Dissecting microscope ライカMDG36
解剖ピン (A1 または A2 グレード)F.S.T26002-15
解剖プレート F.S.TFB0875713パラフィンベースのペトリ皿
埋め込み型さくら4133
極細ハサミ (10.5 cm)F.S.T14088-101–2ペア 
フィジーアプリケーション/画像JNIHFiji.sc
細い先端 (0.05 mm x 0.01 mm) 解剖鉗子 (11 cm)F.S.T11252-002 ペア
ホット鉗子 F.S.T11252-00胚の向き
ワックスブロック用工業用マーカー Sharpie2003898ラボ用にフォーマット済み
Jenoptik ProgRes C14plus 顕微鏡カメラ イエナオプティック017953-650-26
イエナオプティック ProgRess CapturePro 取得ソフトウェアイエナオプティックjenoptik.com
大型ガラスビーカー フィッシャーサイエンティフィックS111053パラフィン溶解用
ライカ M165 FC 双眼顕微鏡 (16.5:1 ズーム光学系)ライカM165 FC
OsiriX MD バージョン 12.0OsiriXosirix-viewer.com 
パラプラスト埋め込みパラフィンワックスミリポアシグマ1003230215
小さなガラスビーカーフィッシャーサイエンティフィックS111045
小さな穴あきスプーン(14.5 cm)F.S.T10370-17
ストレートバンナスハサミ(4–8 mm)F.S.T15018-10Aペア
Vevo2100 超高周波超音波バイオマイクロスコープ富士フイルムビジュアルソニックスVevo2100
キシレンフィッシャーケミカルUN1307

参考文献

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