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方法論記事

微小血管断片からの血管新生熱発生脂肪組織の三次元培養

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DOI：

10.3791/64650

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2023年2月3日

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1Department of Biochemistry and Structural Biology, University of Texas Health Science Center, 2Department of Biomedical Engineering and Chemical Engineering, University of Texas at San Antonio, 3Institute of Regenerative Medicine, University of Texas at San Antonio

この記事について

サマリー

ここでは、機能的な血管新生ベージュ脂肪組織を設計するための簡単なアプローチとして、げっ歯類またはヒト脂肪組織から分離された微小血管断片の使用を概説する詳細なプロトコルを提示します。

要約

エンジニアリング熱発生脂肪組織(例えば、ベージュまたは褐色脂肪組織)は、代謝性疾患の潜在的な治療法として、または健康診断および薬物検査のための個別化された微小組織の設計のために研究されている。現在の戦略はしばしば非常に複雑であり、熱発生脂肪組織の多細胞および機能的特性を正確に完全に描写することができません。微小血管断片は、脂肪組織から単離された細動脈、細静脈、および毛細血管からなる小さな無傷の微小血管であり、血管新生および脂肪組織形成を可能にする単一の自家細胞源として機能する。この記事では、脂肪組織および培養条件から微小血管断片を分離するためのプロトコルを含む、微小血管断片から3次元、血管化、および機能的な熱発生脂肪組織を生成できるように培養条件を最適化する方法について説明します。さらに、ベストプラクティス、および操作された組織を特徴付けるための技術が議論され、げっ歯類とヒトの両方の微小血管断片からのサンプル結果が提供されます。このアプローチは、肥満や代謝性疾患の治療法の理解と開発に活用できる可能性があります。

概要

このプロトコルの目的は、単一の潜在的に自己由来の微小血管断片(MVF)から血管新生ベージュ脂肪組織を開発するためのアプローチを説明することです。茶色とベージュの脂肪組織は、代謝調節に関連する有益な特性を示すことが実証されています。ただし、成人のこれらの脂肪組織デポーの量が少ないため、特に肥満や2型糖尿病などの病状では、全身代謝への潜在的な影響が制限されます1,2,3,4,5,6,7。肥満とその併存疾患に関連する有害な代謝効果を予防するための治療標的として、茶色/ベージュ色の脂肪に大きな関心が寄せられています8,9,10,11,12。

MVFは、脂肪組織から直接単離し、培養し、長期間にわたって三次元構成で維持することができる血管構造である13、14、15。私たちのグループや他のグループからの以前の研究は、特に脂肪組織形成に関連するように、MVFの多細胞および多能性能力を利用し始めています16,17,18。この研究の積み重ねとして、私たちは最近、健康な2型糖尿病のげっ歯類モデル19およびヒト被験者(50歳以上の成人)20に由来するMVFに、熱発生またはベージュ色の脂肪組織を形成するように誘導できる細胞が含まれていることを実証しました。

本明細書は、単一ソースMVFが利用される革新的なアプローチであり、ベージュ脂肪組織だけでなく、その関連する重要な血管成分21も作成することができる。この技術の使用は、熱発生脂肪組織形成のための簡単な組織工学的アプローチを探している研究にとって非常に価値がある可能性があります。ベージュ色の脂肪組織を設計することを目指す他の方法22、23、24、25、26、27、28とは異なり、この研究に記載されているプロセスは、複数の細胞型または複雑な誘導レジメンを使用する必要はありません。血管化されたベージュおよび白色脂肪モデルは、げっ歯類およびヒト由来のMVFで作成でき、大きな翻訳の可能性を示しています。このプロトコルの最終製品は、褐色脂肪組織に匹敵する構造と代謝機能を備えた操作されたベージュの熱発生脂肪組織です。全体として、このプロトコルは、簡単にアクセスでき、おそらく自家ソースMVFが、代謝障害を研究するための価値のある治療的介入およびツールである可能性があるという考えを提示します。

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プロトコル

本研究は、動物愛護法および動物愛護規則施行規則に準拠して、実験動物の飼養及び利用に関する手引きの原則に従って実施された。すべての動物の手順は、テキサス大学サンアントニオ校の施設動物管理および使用委員会によって承認されました。

注:以下に説明する手順では、オスのルイスラットが使用されます。雌およびマウス微小血管断片(MVF)コレクションについては、わずかなプロトコル調整を行う必要があります29。ヒトMVF(h-MVF)を使用するプロトコルの場合、必要なステップは、メーカーのプロトコルに従ったh-MVFの再懸濁、増殖培地の調製(1.3)、フィブリンヒドロゲルの形成(5)、および培養(6)のみです。プロトコルの概要については、 図 1 を参照してください。

MVF形成図;試薬調製、脂肪単離、フィブリンヒドロゲル、MVF培養プロセス。
図1:実験の概要。 MVFを用いた熱発生脂肪組織形成のための分析前の6つの重要なステップの内訳。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

1. 試薬調製

注:以下の試薬は、1匹のラットに対応し、計量してバイオフード内で製造しました。

  1. ウシ血清アルブミン(BSA)をPBSで調製します。
    1. 洗浄ステップ(1 mg/mL、0.1%)および消化(4 mg/mL、0.4%)のために希釈するPBS中の10 mg/mL(1.0%)BSAを調製します。
    2. ステップ1.1.1-1.1.5に従って、ステップ1.1.1で述べたように、異なる濃度のBSAを準備します。
    3. 10 mg/mL の BSA を PBS 溶液中に (1% の BSA を PBS 溶液中で)
      1. 500 mgのBSAと500 mLのPBSを50 mLのコニカルチューブに加え、溶液をボルテックスしてBSAを溶解します。
      2. 過剰な気泡が形成された場合は、溶液を350 x g で2分間遠心分離します。フィルター 0.22μmのナイロンネットフィルターで溶液を滅菌します。
    4. 1 mg/mL の BSA を PBS 溶液中で (0.1% BSA を PBS 溶液中)
      1. 500 mL滅菌ボトルで15 mLの10 mg/mL BSAをPBS中の135 mLのPBSに加え、15 mLの10 mg/mL BSAをPBSで1:10に希釈し、ボトルを静かに振って均一な混合物を確保します。
    5. 4 mg/mL の PBS 溶液中の BSA (PBS 中の 0.4% BSA)
      1. 100 mL滅菌ボトルに35 mLの10 mg / mL BSAをPBSで10 mL + 57.5 mLのPBSを加えて、35 mLの10 mg / mL BSAをPBSで1:2.5で希釈し、ボトルを静かに振って均一な混合物を確保します。
  2. ミンチ脂肪パッドの消化のためにBSAでコラゲナーゼを準備します。
    1. 6 mg/mL のコラゲナーゼを準備します。
      1. 50 mLのコニカルチューブで、72 mgのコラゲナーゼを量ります(「エピ用」のラベル)。
      2. 3本の50 mLコニカルチューブに、それぞれ144 mgのコラゲナーゼ(「Ing 1用」、「Ing 2用」、および「SubQ用」のラベル)を量ります。
      3. 秤量したコラゲナーゼは使用時まで4°Cで保存する。
        注:消化直前までBSA / PBSを追加しないでください。
      4. 72 mgのコラゲナーゼを含むチューブに、PBS中の4 mg/mL BSAを12 mL加えます。
      5. 144 mgのコラゲナーゼを含むチューブに、PBS中の4 mg/mL BSAを24 mL加えます。
      6. チューブを振って均一な溶液を確保し、0.22μmのナイロンネットフィルターで溶液をろ過滅菌します。
  3. アミノカプロン酸(ACA)を添加した増殖培地を準備して、単離されたMVFをフィード/分化させます。







マウス脂肪組織解剖図;鼠径部、精巣上体、および後部脂肪の位置。




  30. 50 mLのコニカルチューブ内の平均サンプル濃度を計算するための式。

ペレット、上清の分離、およびろ過のセットアップ手順を含む遠心分離プロセス図。



      1. 比率式 \( \frac{2}{7} = \frac{X_1}{1500 \, \mu L} \)、実験セットアップでの計算。

      2. 希釈計算式、方程式;5/7 = X<sub>2</sub>/1500 μL、教育化学図


        1. 化学実験室の計算で使用される希釈式 2/7=X1/250μL を示す式。

        2. 希釈計算に使用される比例式、5/7=X2/250μL。教育用の公式。

フィブリンヒドロゲル形成図におけるトロンビン活性化 ピペッティングフィブリノーゲン,MVF,37°C設定

血管新生と脂肪生成のタイムライン図:GM、WAM、BAMの14日間のプロセス比較。

GMおよびWAM / BAMの誘導と成熟を詳述した血管新生と脂肪生成のタイムライン図。

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結果

ベージュ/褐色脂肪組織のいくつかの重要な表現型の形態学的特徴があります:それは多房性であり、小さな脂肪滴を含み、多数のミトコンドリアを所有し(生体内でその特徴的に「茶色がかった」外観の理由)、それに応じて高い酸素消費率/ミトコンドリア生体エネルギーを有し、高度に血管新生され、脂肪分解/インスリン刺激グルコース取り込みを増加させ、そして最も悪名高い、 熱発生呼吸に関与するミトコンドリアタンパク質である脱共役タンパク質1(UCP1)を高レベルで発現する19,30。

そこで、MVFのベージュ色の脂肪組織への分化能を特徴づけるにあたり、MVFの形質転換を可視化(図7、図8)、遺伝子確認(図9、図10)、機能測定(図11)...

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ディスカッション

ブラウン/ベージュの脂肪組織工学の分野は、ほとんど未成熟であり22,23,24,25,26,27,28であり、脂肪モデルの大部分は白色脂肪組織用に開発されています8,22,31.操作された茶色/ベージュ色の微小組織は、典型的には、天然の褐色脂肪組織の表現型特性のサブセットを得るための複数の細胞源または遺伝的変化からなる8,11,32

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開示事項

著者らは、この研究は、潜在的な利益相反と解釈される可能性のある商業的または金銭的関係がない状態で実施されたと宣言しています。

謝辞

アコスタ博士は、国立衛生研究所の助成金CA148724およびTL1TR002647によってサポートされています。ゴンザレス・ポラス博士は、国立衛生研究所の国立糖尿病・消化器・腎臓病研究所の支援を受けており、賞番号F32-0DK122754で報告されています。この研究は、国立衛生研究所(5SC1DK122578)とテキサス大学サンアントニオ校の生物医学工学科によって部分的にサポートされました。内容は著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。図は部分的に Biorender.com で作成されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
アミノカプロン酸シグマ アルドリッチA2504-100GDMEMに1 mg/mLの濃度で添加
鈍い先端はさみフィッシャー12-000-172オートクレーブで滅菌
ボビン血清アルブミン (BSA)ミリポア126575-10GMPBSで4 mg/mLおよび1 mg/mLに希釈
ラゲナーゼ1型フィッシャー科学NC9633623BSA 4 mg/mLで6 mg/mLに希釈、ミンチ脂肪の消化
デキサメタゾンThermo ScientificAC230302500エタノールで2mg/mlのストック濃度で希釈
使い捨てアンダーパッドフィッシャーサイエンティフィ23-666-062手術中の体液吸収用
解剖ハサミフィッシャーサイエンティフィ08-951-5オートクレーブ
で滅菌ダルベッコ&プライム;sモディファイドイーグル&プライム;s ミディアム (DMEM)フィッシャー サイエンティフィ11885092
ダルベッコ&プライム;sモディファイドイーグル&プライム;S Medium/Nutrient Mixture F-12 ハム (DMEM/F12)Sigma AldrichD8062
ウシ胎児血清 フィッシャー科学16140089DMEMで20%v/vに添加
フィブリノーゲン シグマAldrichF8630-25G20 mg/mLの濃度でDMEMに可溶化、血漿およびハイドロゲルフラスコの主成分に含まれるタンパク質
、250 mLフィッシャー科学FB500250大きな表面積を使用して脂肪の消化を可能にする
鉗子フィッシャー科学50-264-21オートクレーブで滅菌、組織およびフィルターの取り扱い用
フォルスコリングマアルドリッチF6886エタノールで10 mMのストック濃度で希釈
Human MVFAdvanced Solutions Life Scienes, LLChttps://www.advancedsolutions.com/microvessels本研究では、3人の患者(52歳、54歳、56歳の女性)から単離されたヒトMVF(hMVF)を使用しました。 
インドメタシン Sigma AldrichI7378エタノールで 12.5 mM ストック濃度で希釈
ブタ膵臓由来インスリンSigma AldrichI55230.01 N HCl で希釈、ストック濃度 5 mg/ml
MycoZapフィッシャー 科学NC9023832DMEM で 0.2% w/v、マイコプラズマ 予防 
ペニシリン/ストレプトマイシン (10,000 U/mL)フィッシャー科学15140122DMEMに1% v/vに添加。
シャーレ、ポリスチレン(100 mm x 15 mm)。フィッシャー科学351029の除去とミンチ、8(蓋)はスクリーンのプレソーキング用、8(皿)は500または37&マイクロでろ過するときに使用します。M
ペトリ皿、ポリスチレン(35 mm x 10 mm)をスクリーニングします。フィッシャーサイエンティフィ50-202-036フラグメントをカウントするため
リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)フィッシャーサイエンティフィ14-190-250滅菌脱イオン水で1倍に希釈。
ラットクリッパー(Andwinミニアルコペットトリマー)フィッシャー科学NC0854141
ロシグリタゾンフィッシャー科学R0106200MGDMSOで10mMのストック濃度で希釈は
さみファインサイエンスツール14059-11切開用1個、精巣上体切開用1個、先端クリッピング用1
画面  37 & マイクロ;M カロライナバイオロジカルサプライカンパニー652222R3インチの丸みを帯びた正方形にカットし、エチレンオキシドで滅菌、フラグメントの閉じ込めと非常に小さなフラグメント/単一細胞と破片の除去
500µM カロライナ生物供給会社652222Fは、3インチの丸みを帯びた正方形にカットし、エチレンオキシドで滅菌し、より大きな破片/破片を除去し
鋸歯状止血フィッシャー科学12-000-171クレーブで滅菌し、切開前の皮膚のクランプ用
Steriflipフィルター0.22μm ミリポアSE1M179M6
トロンビンフィッシャー科学6051601KUイオン水で10 U / mLに希釈され、フィブリノーゲンをフィブリン
甲状腺ホルモン(T3)Sigma AldrichT28770.02 mMストック濃度で1N NaOHで希釈
Zucker糖尿病性脂肪(ZDF)ラット - 肥満(FA / FA)または痩せた(FA / +)男性 チャールズ川https://www.criver.com/products-services/find-model/zdf-rat-lean-fa?region=3611
https://www.criver.com/products-services/find-model/zdf-rat-obese?region=3611		チャールズ川(マサチューセッツ州ウィルミントン)から取得。ラットは4週齢で取得され、安楽死(15〜19週齢)までピュリナ5008を給餌しました。グルコースレベル(外側伏在静脈からの血液)は、研究で使用されたすべてのFA / FAラットで300 mg / dLを超えていました。.すべての動物は、12時間の明暗サイクルを備えた温度制御された環境に収容され、自由に給餌されました。
科学 コック ック ック 。シ 3は血管はック ック 初期個 スクリーンますオート脱に変える凝固剤として使用されます

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