この論文では、新しく設計された3Dプリントインサートを共培養のモデルとして提示し、内皮細胞とケラチノサイト間のパラクリン細胞間コミュニケーションの研究を通じて検証します。
このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。
この記事について
サマリー
要約
異なる細胞タイプ間の間接的なコミュニケーションの古典的な分析では、馴化培地を使用する必要があります。さらに、馴化培地の製造は依然として時間がかかり、生理学的および病理学的状態からはほど遠い。共培養のいくつかのモデルが市販されていますが、それらは特定のアッセイに限定されたままであり、主に2種類の細胞用です。
ここでは、多数の機能アッセイに適合する3Dプリントインサートが使用されています。インサートにより、6ウェルプレートの1ウェルを4つのコンパートメントに分離できます。幅広い組み合わせを設定できます。さらに、コンパートメントの各壁に窓が設計されているため、各コンパートメント間の潜在的な細胞間コミュニケーションが培地内で体積依存的に可能です。例えば、パラクリンの細胞間コミュニケーションは、単層、3D(スフェロイド)、または両方を組み合わせることによって、4つの細胞タイプ間で研究することができます。さらに、異なる細胞タイプのミックスを2Dまたは3D(オルガノイド)フォーマットで同じコンパートメントに播種することができます。3Dプリントされたインサートに底がないため、プレート上の通常の培養条件、インサートを含むプレートへのコーティング、および光学顕微鏡による直接可視化が可能になります。複数のコンパートメントにより、異なる細胞タイプを個別に収集したり、各コンパートメントでRNAまたはタンパク質抽出に異なる試薬を使用したりすることができます。この研究では、新しい3Dプリントインサートを共培養システムとして使用するための詳細な方法論を提供します。この柔軟でシンプルなモデルのいくつかの能力を実証するために、以前に公開された細胞コミュニケーションの機能アッセイが新しい3Dプリントインサートで実行され、再現性があることが実証されました。3Dプリントされたインサートと、馴化培地を使用した従来の細胞培養でも、同様の結果が得られました。結論として、3Dプリントインサートは、接着細胞タイプとの共培養の多数のモデルに適応できるシンプルなデバイスです。
概要
生体内では、細胞は直接的(細胞接触)または間接的(分子の分泌による)のいずれかで互いに通信します。細胞コミュニケーションを研究するために、直接共培養(異なる細胞タイプが同じウェル内で直接相互作用する)や区画化共培養(異なる細胞タイプが培養システムの異なるコンパートメントで間接的に相互作用する)1など、さまざまな共培養モデルを開発できます。さらに、馴化培地は共培養系に使用でき、エフェクター細胞タイプの馴化培地に含まれる分泌分子がレスポンダー細胞タイプ1に移されることによって間接的な相互作用が可能になります。
パラクリン細胞コミュニケーション研究の場合、間接共培養システムは、in vivoでの細胞相互作用を強く反映するモデルを提供します。間接共培養システムが開発・実用化され、間接共培養モデルの確立が可能となった2,3。残念ながら、ほとんどの間接共培養システムは2つのコンパートメントしか提供しません。他の間接共培養システムは複数のコンパートメントを提供しますが、本稿で報告されているシステムと比較して拡張性が低くなります。それらのいくつかは顕微鏡下での古典的な視覚化を可能にしません、そしてそれらはしばしば特定の適用方法を提示します。いくつ....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
プロトコル
注:3Dインサート(図1A)は商業的に調達され、細胞培養およびオートクレーブと生体適合性のあるフォトポリマー樹脂を使用して印刷されます( 材料表を参照)。このセクションでは、インサートによる共培養モデルを確立するための詳細なプロトコルについて説明します( 図1Bを参照)。アプリケーションの例もいくつか提供されています。
1. 滅菌済みインサートの6ウェルプレートへの配置
- キットに含まれている2つの成分( 材料の表を参照)、食品シリコン(試薬A)と触媒(試薬B)を、製造元の指示に従って10:1(v / v)の比率で混合します。(図1Ba)。70%エタノール滅菌スパチュラを使用して、2つの成分を混合します。
注意: 準備するシリコン混合物の量は、固定するインサートの数によって異なります。触媒が過剰になると、シリコン混合物の固化が速すぎる可能性があります。 - ピンセットを使用してシリコンミックスにインサートを適用し、混合物がインサートの下端に均一に分布するようにします(図1Bb)。インサートを6ウェルプ....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
結果
本研究では、馴化培地を使用して、従来の方法に匹敵する堅牢で信頼性が高く、有意なデータを取得するために、最適化された共培養システムについて説明しました。3Dプリントされたインサートは、実験における上流のコンディショニング培地の困難さと時間のかかる生産を克服することにより、相互作用における異なる細胞タイプのin vivo微小環境条件を模倣します。毛包に存在する2つの細胞タイプ、ヒト微小血管内皮細胞(HDMEC)とヒト外根鞘(KORS)間の間接的な相互作用を分析するために、以前に発表された研究が再実施されました8。ここでは、HDMECとKORS間の間接的な相互作用を調査するために馴化培地を使用する従来の方法と比較して、3D印刷されたインサートを使用して得られた結果の再現性が実証されました。研究8で前述した細胞培養条件は、本研究と同じであった。それらは、3Dプリントされたインサートの寸法を考慮して調整されました(プロトコルを参照)。まず、表現型と細胞生存率は、すべての細胞タイプについて、2つの条件(馴化培地と.3D印刷インサート)の.......
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
ディスカッション
間接的な細胞コミュニケーションは、一般的に馴化培地または共培養システムデバイスを使用して調査されます。馴化培地の調製は実験の上流に時間がかかり、この方法は片側効果分析に限定されています。Colin-Pierreらによる以前の研究 。馴 化培地を用いて8、2つの細胞型(HDMECsおよびKORS)間の間接的な細胞間通信を行った。この先行研究のデータは、HDMEC増殖に対するKORS馴化培地の効果と、HDMEC遊走、偽管形成、およびGPC1発現に対するKORS馴化培地の効果を示しました8。本研究では、間接的な細胞コミュニケーションを調べるためのより簡単で迅速な方法が説明されています。実際、3Dプリントされたインサートは、実験計画と細胞培養の複数の組み合わせに柔軟性をもたらします。これらの3Dプリントされたインサートを共培養のモデルとして検証するために、細胞増殖と細胞移動を分析し、馴化培地を使用した以前の研究と比較しました8。両方の研究において、創傷治癒アッセイは、インサートを含むま.......
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
開示事項
著者は、競合する金銭的利益を宣言していません。
謝辞
この調査は、BASFビューティーケアソリューションズと共同で行われました。チャーリー・コリン・ピエールは、BASF/CNRSが資金提供する博士号フェローです。
3Dプリントされたインサートの構想について、Mehdi Sellami氏に感謝します。
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| オートクレーブ | Getinge | APHP | ソリッドサイクル、121 °C for 20 min |
| Biomed Clear | Formlabs | RS-F2-BMCL-01 | 3D-Morphoz社(フランス、ランス) |
| による印象細胞培養洗剤 | Tounett | A18590/0116 | |
| Cell Proliferation Reagent WST-1 | Roche | 11,64,48,07,001 | |
| カウンティングスライド | NanoEnTek | EVE-050 | |
| Culture-Insert 2 Well in μ-Dish 35 mm | Ibidi | 80206 | two-migration chambers device. |
| 内皮細胞培地 | ScienCell | 1001 | 基礎培地 +/- 25 mL のウシ胎児血清 (FBS, 0025)、5 mL の内皮細胞増殖サプリメント (ECGS, 1052)、5 mL のペニシリン/ストレプトマイシン溶液 (P/S, 0503)。 |
| EVE 自動セルカウンター | NanoEnTek | NESCT-EVE-001E | |
| EVOS XL Core | Fisher Scientific | AMEX1200 | 10倍の倍率 |
| 食品 シリコン試薬および触媒キット | Artificina | RTV 3428 A and B | (10:1) |
| FORM 3B プリンタ | Formlabs | PKG-F3B-WSVC-DSP-BASIC | 3D-Morphoz 社による印象 |
| Human Dermal Microvascular Endothelial Cells (HDMEC) | ScienCell | 2000 | |
| Keratinocytes of Outer Root Sheath (KORS) | ScienCell | 2420 | |
| Macro Wound Healing Tool Software | ImageJ | 覆われていない表面の測定に使用するソフトウェア遊走アッセイ) | |
| 間葉系幹細胞培地 | ScienCell | 7501 | 基礎培地 +/-25 mL のウシ胎児血清 (FBS, 0025)、5 mL の間葉系幹細胞増殖サプリメント (MSCGS, 7552)、5 mL のペニシリン/ストレプトマイシン溶液 (P/S, 0503) |
| マイクロプレートリーダー SPECTRO star NANO | BMG Labtech | BMG LABTECH ソフトウェア | |
| PBS | Promocell | C-40232 | Ca2+ / Mg2+ |
| Trypan Blue Stain なし | NanoEnTek | EBT-001 | |
| トリプシン / EDTA | プロモセル | C-41020 | 37°でのKORSのインキュベーション;Cを5%CO2で5分間HDMECsを室温で5分間インキュベーション |
| 96ウェルプレート Nunclon Delta Surface | Thermoscientific | 167008 |
参考文献
- Regier, M. C., Alarid, E. T., Beebe, D. J. Progress towards understanding heterotypic interactions in multi-culture models of breast cancer. Integrative Biology. 8 (6), 684-692 (2016).
- Doğan, A., Demirci, S., Apdik, H., Apdik, E. A., Şahin, F.
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
再版と許可
