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方法論記事

フローサイトメトリー法 による 日本脳炎ワクチン接種小児における多機能性T細胞の検出

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DOI：

10.3791/64671

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2022年9月23日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Beijing Key Laboratory of Pediatric Respiratory Infectious Diseases, Key Laboratory of Major Diseases in Children, Ministry of Education, National Clinical Research Center for Respiratory Diseases, Laboratory of Infection and Virology, Beijing Pediatric Research Institute, Beijing Children’s Hospital, Capital Medical University, National Center for Children’s Health, 2Research Unit of Critical Infection in Children, 2019RU016, Chinese Academy of Medical Sciences, 3Department of Pediatric Rehabilitation, Beijing Boai Hospital, School of Rehabilitation Medicine, Capital Medical University, China Rehabilitation Research Center, 4Center of Excellence (Beijing), Becton Dickinson Medical Devices (Shanghai) Co Ltd

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

本プロトコルは、 ex vivo 刺激とフローサイトメトリーを組み合わせて、日本脳炎ウイルス(JEV)ワクチン接種小児内の末梢血単核球(PBMC)の多機能T細胞(TFP)プロファイルを分析します。JEV特異的TPFの検出方法とフローサイトメトリーの配色を試験し、同様の研究の参考資料を提供しました。

要約

T細胞媒介免疫は、ワクチン接種後または自然感染後のフラビウイルス感染の制御に重要な役割を果たします。T細胞の「品質」は機能によって評価する必要があり、より高い機能はより強力な免疫防御と関連しています。単一細胞レベルで2つ以上のサイトカインまたはケモカインを同時に産生できるT細胞は、多機能性T細胞(TFPs)と呼ばれ、さまざまな分子メカニズムを介して免疫応答を仲介し、脱顆粒マーカー(CD107a)を発現し、インターフェロン(IFN)-γ、腫瘍壊死因子(TNF)-α、インターロイキン(IL)-2、またはマクロファージ炎症タンパク質(MIP)-1αを分泌します。TFPは長期的な免疫記憶と保護の維持に密接に関連しており、その割合の増加は防御免疫の重要なマーカーであり、ウイルス感染と再活性化の効果的な制御に重要であるという証拠が増えています。この評価は、特異的免疫応答だけでなく、交差反応性免疫応答の評価にも適用されます。ここでは、日本脳炎ウイルス(JEV)を例にとり、日本脳炎の予防接種を受けた小児の末梢血単核球によって産生されるJEV特異的TFPsの検出方法およびフローサイトメトリーの配色を試験し、同様の研究の参考とした。

概要

日本脳炎ウイルス(JEV)は、フラビウイルス科1に属するフラビウイルス属に属する重要な蚊媒介性ウイルスです。多くのアジア太平洋諸国は、日本脳炎(JE)によって引き起こされる莫大な病気の負担のために長い間大きな公衆衛生上の課題に直面してきましたが、これはさまざまな種類の予防接種の利用可能性の増加とともに劇的に改善されました2。自然感染またはワクチン接種によって引き起こされる適応防御免疫応答は、予防および抗ウイルス調節に寄与する。体液性免疫と細胞性免疫は獲得免疫に分類され、前者の誘導は、過去3では比較的限られた理解しかありませんでしたが、ワクチン設計における重要な戦略として常に見なされてきました。しかし、フラビウイルスの蔓延とウイルスクリアランスを制限する上でのT細胞媒介免疫の役割はますます注目され、広く研究されています4。さらに、T細胞免疫は、JEV特異的抗ウイルス反応に不可欠であるだけでなく、以前の研究で実証されている異種フラビウイルスによる二次感染からの交差防御においても重要な役割を果たしています5。この効果は、感染症における潜在的な抗体媒介増強効果を回避する可能性があると推測されています5。注目すべきことに、このような交差反応性T細胞免疫は、特にフラビウイルスに対するワクチンおよび抗ウイルス薬が存在しない場合に重要である。CD4+およびCD8+ T細胞に関してJEV感染におけるT細胞の寄与を決定するために多くの研究が行われてきたが6,7、サイトカインを分泌するそれぞれの系統とその機能多様化は未定のままであり、これはヘルパーおよびキラーT細胞の正確な機能の解明が妨げられていることを意味する。

それらの抗ウイルス防御の規模は、T細胞応答の質を決定する。サイトカイン分泌および脱顆粒を含む2つ以上の機能を相溶的に付与することができるCD4+またはCD8+ T細胞は、単一細胞レベルでの特異的刺激に対して多機能性T細胞(TFs)として特徴付けられる8。単一または複数のサイトカインを産生するCD4+ T細胞は、さまざまな効果と免疫記憶を持っている可能性があります。例えば、IL-2+ IFN-γ+ CD4+ T細胞は、IL-2+ CD4+ T細胞よりも長期的に有効な防御応答を形成する可能性が高く、ワクチン接種効果を評価する際の重要なパラメータとして使用できます。IL-2+ IFN-γ+ CD4+ T細胞の頻度は、後天性免疫不全症候群(AIDS)の長期非進行の患者で増加しますが、エイズ進行患者のCD4+ T細胞は、T細胞増殖に対するIL-2の促進効果により、IFN-γ単独で産生する傾向があります10。さらに、IL-2+ IFN-γ+ TNF-α+のサブセットは、in vivoで長期間生存し、殺傷機能を相乗的に促進することが示されました11。CD8+ T細胞は細胞傷害活性を示す可能性が高いが、一部のCD4+ T細胞は、表面CD107a分子の発現を間接的に検出する12として細胞傷害活性も備えている。さらに、特定のT細胞サブセットはケモカインMIP-1αを発現し、これはT細胞媒介好中球動員に関与するために単球によって分泌されることが多い13。同様に、CD8+ TPFsは、上記のマーカーの汎用性を特徴付けるためにも使用できます。研究によると、プライムブースト戦略は、ワクチン接種によって誘発される保護を強化することができるTf保護効果13の長期間を効果的に誘発することができます。免疫系を調べる際の中心的な特徴は、記憶T細胞がナイーブT細胞よりも二次的なウイルスの課題に対してより強く、より速く、より効果的な応答を促進する能力です。エフェクターメモリーT細胞(TEM)および中枢メモリーT細胞(TCM)は、CD27/CD45ROまたはCCR7/CD45RAの複合発現によってしばしば分化される重要なT細胞サブセットである14。TCM(CD27+ CD45RO+またはCCR7+ CD45RA-)は二次リンパ組織に局在する傾向があり、TEM(CD27-CD45RO+またはCCR7-CD45RA-)はリンパ系および末梢組織に局在する15,16。TEMは即時の、しかし持続的ではない防御を提供するのに対し、TCMは、二次リンパ器官で増殖し、新しいエフェクターを生成することによって応答を維持する17。したがって、メモリセルがウイルスに対する特異的で効率的な想起応答を媒介できることを考えると、この多関数のサブセットの寄与について疑問が生じます。

フローサイトメトリー技術の発展に伴い、10を超えるクラスター、表現型、分化抗原のマーカーを同時に検出することが一般的になり、個々のT細胞の機能的免疫学的特徴をより豊富にアノテーションして、T細胞の表現型の誤解や理解の難しさを減らすのに役立ちます。この研究では、 ex vivo 刺激とフローサイトメトリーを使用して、JEVワクチン接種を受けた子供の末梢血単核細胞(PBMC)のTFP プロファイルを分析しました。このアプローチを適用することで、ワクチン接種によって誘導される短期および長期のJEV特異的、さらには交差反応性T細胞免疫の理解が拡大されます。

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プロトコル

本研究の倫理的承認は、首都医科大学北京小児病院の倫理委員会によって取得されました(承認番号:2020-k-85)。ボランティアは首都医科大学北京小児病院から募集されました。末梢静脈血サンプルは、以前に半年未満の弱毒生JE SA14-14-2ワクチンによるプライムおよびブーストワクチン接種を受けたことがある明らかに健康な子供(2歳)から取得されました(JEワクチン接種の子供、n = 5)およびワクチン未接種の子供(生後6か月、n = 5)。ヒト被験者のインフォームドコンセントは、臨床的にテストされた後の残留サンプルのみがこの研究で使用されたため、放棄されました。ボランティアのプライバシーを保護するために、すべてのデータは完全に匿名化され、匿名化されました。

1.末梢静脈血からのPBMCの分離

  1. 標準的な静脈穿刺技術18によって、EDTA-K 2抗凝固チューブ(材料の表を参照)でJEワクチン接種および未接種の子供から末梢静脈血サンプル(2 mL)を収集します。
  2. 2 mLのリン酸緩衝生理食塩水(1x PBS)を加えて末梢血を希釈します。.
    注:このプロセスは、最大の存続可能性を維持するためにできるだけ早く処理されます。
  3. 4 mLの密度勾配培地( 材料の表を参照)を15 mLの遠沈管に加え、希釈した血液を分離媒体の上層にゆっくりと移します。
    注意: 血液を分離媒体と混合したり、2つの液体によって形成された接触面を破壊したりしないでください。そうしないと、分離効果が得られません。
  4. 室温で800 × g で20分間遠心分離します。遠心分離後の重要な層を観察します。
  5. PBMC(中間層)を別の15 mL遠心チューブに移し、10%ウシ胎児血清を含む10 mLのRPMI-1640培地でPBMCを洗浄します(FBS、 材料の表を参照)。
  6. 室温で800 × g で10分間遠心分離し、上清をピペットで慎重に廃棄します。
  7. 10%FBSを含む1 mLのRPMI-1640培地でPBMCを再懸濁し、トリパンブルーベースの自動カウンターで細胞をカウントします(材料の表を参照)。

2. 不活化JEV粒子によるPBMCのサイトカイン発現誘導

  1. JEV刺激群と対照群の2つのサブグループを、JEワクチン接種サンプルと非ワクチン接種サンプルにそれぞれ設定します。
  2. 10% FBSを含むRPMI-1640培地でPBMCの数を2×10 6細胞/mLに調整し、PBMCを24ウェルプレート(ウェルあたり2×106細胞/ 1 mL培地)に播種します。各グループに3つのウェルを接種します。
  3. モノクローナル抗体CD28(1 μg/mL, 1:1,000)およびCD49d(1 μg/mL)、ゴルジプラグ(1 μg/mL、1:1,000)、およびモネンシン(1 μg/mL、1:1,000)の存在下で、濃縮不活化JEV粒子5(2 ×10 5 PFU)でJEV刺激群のPBMCを37°Cで16時間刺激します。表面染色には、BV605-抗CD107a(1 μg/mL、1:1,000)を使用してください(材料表を参照)。
    注:JEVは、前述のようにUV照射によって不活性化されました19。
  4. モノクローナル抗体CD28(1 μg/mL、1:1,000)およびCD49d(1 μg/mL、1:1,000)、ゴルジプラグ(1 μg/mL、1:1,000)、およびモネンシン(1 μg/mL、1:1,000)の存在下で、濃縮ウイルス粒子なしで対照群のPBMCを37°Cで16時間刺激します。BV605-抗CD107a(1 μg/mL、1:1,000)で表面を染色します。

3. 生体外 細胞内染色

  1. 各群の細胞懸濁液を1.5 mLの微量遠心チューブに集め、室温で5分間500 × g で遠心分離し、ピペットで上清を除去します。
  2. 細胞を1 mLの1x PBSに再懸濁し、固定可能な生存率色素(1 μL/mL、1:1,000、 材料の表を参照)を細胞懸濁液に加え、暗所で室温で10分間インキュベートします。500 × g (室温)で5分間遠心分離し、上清を除去します。
  3. 細胞を1 mLの1x PBSに再懸濁します。500 × g (室温)で5分間遠心分離します。上清は慎重に捨ててください。
  4. 細胞表面マーカー染色を行います。
    1. 細胞を100 μLの1x PBSに再懸濁し、各表面マーカー抗体(BV650-抗CD3、BUV395-抗CD4、BV421-抗CD8、BUV737-抗CD27、およびBV480-抗CD45RO、希釈係数:1:50、 材料の表を参照)を各チューブの細胞懸濁液に2 μL加えます。
      注:カラー蛍光抗体染色プロトコルを 表1に示します。
    2. チューブを室温で30分間インキュベートし(ステップ3.4.1)、光から保護します。500 × g で5分間遠心分離し、上清を除去します。
      注:BUV737-抗CD27およびBV480-抗CD45ROの抗体は、メモリーT細胞のアノテーションとしてBUV737-抗CCR7およびBV480-抗CD45RAに置き換えることができます。
  5. 細胞を1 mLの1x PBSに再懸濁します。室温で500 × g で5分間遠心分離します。上清は慎重に捨ててください。
  6. 固定と膜破壊を行います。
    1. 細胞を500 μLの膜破壊固定液( 材料の表を参照)で再懸濁し、室温で暗所で20分間細胞を固定します。500 × g で5分間遠心分離し、上清を除去します。
  7. 細胞を1 mLの1x PBSに再懸濁します。室温で500× g で5分間遠心分離し、上清を注意深く除去する。
  8. 細胞内サイトカイン染色を行う。
    1. 細胞を100 μLの1x PBSに再懸濁し、各サイトカイン抗体(FITC-抗IFN-γ、PE-抗TNF-α、BV785-抗IL-2、およびAPC-抗MIP-1α、希釈係数:1:50、 材料の表を参照)を各チューブの細胞懸濁液に2 μL加えます。
      注:蛍光色素標識抗体の量と情報を 表1に示します。
    2. チューブを暗所で室温で30分間インキュベートします(ステップ3.8.1)。500 × g で5分間遠心分離し、上清を除去します。
  9. 細胞を1 mLの1x PBSに再懸濁します。室温で500× g で5分間遠心分離し、上清を注意深く除去する。500 μLの1x PBSを加えて、細胞を再懸濁します。

4. フローサイトメトリーのセットアップ

  1. ステップ1で説明されている手順に従って、PBMCサンプルのみをコントロールサンプルとして分離します。下記のように、細胞懸濁液を1.5 mLマイクロ遠心チューブ(100 μL /チューブ)で12等分します。
    1. 非染色、APC-Cy7-生/死固定染色、BV650-抗CD3単一染色、BUV395-抗CD4単一染色、BV421-抗CD8単一染色、BUV737-抗CD27単一染色、BV480-抗CD45RO染色、BV605-抗CD107a、FITC抗IFN-γ染色、PE-抗TNF-α単一染色、BV785-抗IL-2単一染色、およびAPC-抗MIP-1α単一染色サンプルを設定します。
  2. ステップ3に記載されているように細胞表面マーカーおよび細胞内サイトカイン染色を追加します。単一染色サンプルごとに、染色ステップの蛍光色素を1つだけ追加します。500 μLの1x PBSを添加して、細胞とボルテックスを低速で再懸濁します。
  3. 染色されていないサンプルを使用して、前方散乱(FSC)、側方散乱(SSC)、および異なる蛍光色素電圧を調整します。
    注:本研究では、以下の電圧を設定しました。FSC: 440 V, SSC: 233 V, BV650: 575 V, APC-Cy7: 449 V, BUV395: 500 V, BV421: 402 V, BUV737: 585 V, BV480: 444 V, BV605: 457 V, FITC: 475 V, PE: 469 V, APC: 623 V, and BV785: 725 V.
  4. 単一染色サンプルを使用して、フローサイトメトリー補正を調整し、異なる蛍光色素間のコンタミネーションシグナルを排除します。
    メモ: 補正パラメータを 表 2 に示します。

5. ゲーティング戦略とデータ分析

注:本研究では、この解析のために、CD27+ CD45RO+またはCCR7+ CD45RA-としてCD8+またはCD4+ T細胞のセントラルメモリーT細胞(TCM)をCD27-CD45RO+またはCCR7-CD45RA-としてCD8+またはCD4+ T細胞のエフェクターメモリーT細胞(TM)をそれぞれ定義した16。

  1. FSCエリア(FSC-A)/SSCエリア(SSC-A)ドットプロットを通るポリゴンゲートを描画し、破片を除外しながら無傷のリンパ球集団を選択します(図1A)。
  2. FSC-A/FSC-幅(FSC-W)ドットプロットを通して長方形のゲートを描画し、単一セルを選択します(図1B)。
  3. 生/死/SSC-Aドットプロットに長方形のゲートを描き、生細胞を選択します(図1C)。
  4. CD3/SSC-Aドットプロットに長方形のゲートを描き、CD3+ T細胞を特定します(図1D)。
  5. CD4/CD8ドットプロットを通してクワッドゲートを描画し、CD4+ またはCD8+ T細胞を特定します(図1E)。
  6. CD45RO/CD27ドットプロットを通してクワッドゲートを描き、CD4+またはCD8+ T細胞をTCM(CD27+ CD45RO+)とTEM(CD27- CD45RO+)に細分化します(図1F-I)。
  7. CD8+またはCD4+ T細胞のTCMまたはTEMからCD107a、IFN-γ、TNF-α、IL-2、およびMIP-1αのゲートを描画して、それぞれ異なる応答パターンの頻度を決定します。
  8. サンプルをサイトメトリーに順次ロードします。停止ゲート20 を使用して、1×106 リンパ球を獲得する。
    注:個々のユーザーは、10個の6セル ×1個以上を収集できます。この数値は、意味のある結果を提供するのに十分なセルの収集にかかる時間との間の妥協点でした。

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結果

図1は、CD8+またはCD4+ T細胞のTCMまたはTMをJEワクチン接種小児の代表的なJEV刺激群から分割するために用いられるゲーティング戦略を示す。 FSC-A/SSC-Aドットプロットはリンパ球の同定に使用され、FSC-A/FSC-Wドットプロットは単一細胞の同定に使用されます。生細胞は、生/死/SSC-Aドットプロットで選択されます。CD3/SSC-Aドットプロットは、CD3+ T細胞を識別するために使用されます。CD4/CD8ドットプロットは、それぞれCD3+ CD4+およびCD3+ CD8+ T細胞を識別するために使用されます。CD8+またはCD4+ T細胞のTCM(CD27+ CD45RO+)およびTEM(CD27- CD45RO...

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ディスカッション

このプロトコルは、JEVワクチンSA14-14-2を接種した小児のPBMCにおけるTFP プロファイルの実行可能なフローサイトメトリーベースの検出方法を表しています。この研究では、ワクチン接種を受けた子供と予防接種を受けていない子供の両方の静脈血PBMCを研究資料として使用しました。JEV抗原によるPBMCの刺激により、増幅された抗原特異的TFPsは、多色フローサイトメトリー抗体染色によって特徴付けることができる。フローサイトメトリーは、従来の酵素結合イムノスポットアッセイ法と比較して、PBMCの機能的特徴を単一細胞レベルで可能な限り多様に提示し、検出に必要なPBMCの数を減らすことができ、特に子供に適しています。

明確なワクチン接種歴、維持された細胞生存率、刺激装置のT細胞免疫原性、および互換性のあるカラーマッチング戦略は、このプロトコルの重要なステップです。中国は、2008年以来、JEV SA14-14-2のワクチン接種を国家拡大予防接種プログラムに組み込み、ワクチン接種履歴を統合管理に含めており、ワクチン履歴へのアクセスが可能になり...

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開示事項

著者は開示するものは何もありません。

謝辞

R.W.は、中国国家自然科学基金会(82002130)、中国北京自然科学基金会(7222059)の支援を受けました。ZD.X.は、CAMSイノベーション・ファンド・フォー・メディカルサイエンス(2019-I2M-5-026)の支援を受けました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
抗ヒトCD28レジェンド302934抗体
抗ヒトCD49dバイオレジェンド304339抗体
APC抗ヒトMIP-1&α;BD551533蛍光抗体 
自動セルカウンターBIO RADTC20細胞数
BD FACSymphony A5BDA5flow Cytometry
BUV395 anti-human CD4BD563550蛍光抗体 
BUV737 抗ヒトCCR7BD741786蛍光抗体 
BUV737 抗ヒト CD27BD612829蛍光抗体 
BV421 抗ヒトCD8Biolegend344748蛍光抗体 
BV480 抗ヒト CD45RABD566114蛍光抗体 
BV480 抗ヒト CD45ROBD566143蛍光抗体 
BV605 抗ヒトCD107aBiolegend328634蛍光抗体 
BV650 抗ヒト CD3BD563999蛍光抗体 
BV785 抗ヒトIL-2Biolegend500348蛍光抗体 
遠心分離管BD FalconBD-3520971515 mL 遠心分離管
Cytofix/Cytoperm 固定/透過化 溶液キットBD554714細胞固定および透過化
密度勾配培地DakeweDKW-KLSH-0100Ficoll-Paque、ヒトリンパ球分離培地
FITC 抗ヒト IFN-&γ;Biolegend502506蛍光抗体 
Gibco ウシ胎児血清サーモフィッシャーサイエンティフィック16000-044ウシ胎児血清
ギブコ RPMI-1640 培地サーモフィッシャーサイエンティフィック22400089細胞培養培地
高速 遠心分離機Sigma 15 mL遠心分離管用
 遠心分離機Eppendorf5424R1.5 mL Eppendorf (EP) tube用細胞遠心分離
微量遠心チューブAxygenMCT-150-C1.5 mL 微量遠心チューブ
PE 抗ヒト TNF-αBiolegend502909蛍光抗体 
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)BI02-024-1ACSPBS
タンパク質輸送阻害剤(ブレフェルジンA、GolgiPlugを含む)BD555029内タンパク質輸送プロセスをブロック
タンパク質輸送阻害剤(モネンシンを含む)554724BD細胞内タンパク質輸送プロセスをブロック
丸底試験管BDファルコン3522355 mL試験管
トリパンブルー染色細胞生存率アッセイキットBeyotimeC0011パンブルー染色
ゾンビNIR固定生存率染料レジェンド423106死細胞染色
バイオ3K15細胞遠心分離高速細胞しますはします トリバイオ

参考文献

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フローサイトメトリー法 による 日本脳炎ワクチン接種小児における多機能性T細胞の検出
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