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方法論記事

3Dオルガノイドによる口腔食道扁平上皮癌のモデリング

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DOI:

10.3791/64676

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2022年12月23日

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1Herbert Irving Comprehensive Cancer Center, Columbia University, 2Organoid and Cell Culture Core, Columbia University Digestive and Liver Diseases Research Center, Columbia University, 3Department of Otolaryngology, Head and Neck Surgery, Columbia University, 4Histopathology Facility, Fox Chase Cancer Center, 5Division of Digestive and Liver Diseases, Department of Medicine, Columbia University, 6Department of Genetics and Development, Columbia University, 7Section of Oral, Diagnostic and Rehabilitation Sciences, College of Dental Medicine, Columbia University

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

このプロトコルでは、化学的発がんによって誘発される正常、腫瘍前、および扁平上皮がんの病変を表すマウスの口腔食道3Dオルガノイドを生成および特性評価するための重要なステップについて説明します。

要約

食道扁平上皮癌(ESCC)は世界中で蔓延しており、毎年すべての食道癌症例の90%を占め、すべてのヒト扁平上皮癌の中で最も致命的です。ESCCの開始と発達に伴う分子変化の定義における最近の進歩にもかかわらず、患者の予後は依然として不良です。これらの分子変化の機能アノテーションは必要な次のステップであり、ESCCの分子的特徴を捉え、機能アノテーションのために簡単かつ安価に操作できるモデルが必要です。タバコ煙模倣体4-ニトロキノリン1-オキシド(4NQO)で治療されたマウスは、予想通りESCCおよび食道前腫瘍を形成する。注目すべきことに、4NQO病変は口腔、最も一般的には舌、および前胃にも発生し、これらはすべて層状扁平上皮を共有しています。ただし、これらのマウスは、同質遺伝子マウスモデルの生成に時間とリソースを大量に消費するため、機能仮説検証のために単純に操作することはできません。ここでは、マウスESCCまたは前腫瘍細胞を ex vivoで特徴付けるために、4NQOで処理したマウスから単一細胞由来の3次元(3D)オルガノイドを生成することにより、この制限を克服します。これらのオルガノイドは、ESCCおよび食道前新生物の顕著な特徴を捉え、安価かつ迅速に活用して同質モデルを形成することができ、同系移植実験に利用することができます。正常、腫瘍前、およびSCCマウス食道組織から3Dオルガノイドを生成し、これらのオルガノイドを維持および凍結保存する方法を示します。これらの汎用性の高いオルガノイドの用途は幅広く、遺伝子操作マウスの利用、フローサイトメトリーまたは免疫組織化学によるさらなる特性評価、CRISPR技術を使用した同系オルガノイド株の生成、薬物スクリーニングまたは同系移植が含まれます。このプロトコルで実証された技術の広範な採用は、ESCCの深刻な負担と戦うためのこの分野の進歩を加速すると信じています。

概要

食道扁平上皮癌(ESCC)は、診断の遅れ、治療抵抗性、および転移のために、ヒト扁平上皮癌の中で最も致命的です1,2。ESCCは、食道の管腔表面を覆う層状扁平上皮から生じる。扁平上皮は、増殖性基底細胞と基底上細胞層内の分化細胞で構成されています。生理学的条件下では、基底細胞はp63、Sox2、サイトケラチンK5およびK14などのマーカーを発現し、分化細胞はK4、K13、およびIVLを発現します。基底細胞自体は不均一であり、K153およびCD734などのマーカーによって定義される推定幹細胞を含む。恒常性において、基底細胞は基底上細胞層内で有糸分裂後の終末分化を受けるのに対し、分化した細胞は内腔に移動して落屑し、上皮再生を完了する。ESCCは、それらの起源の細胞を彷彿とさせ、さまざまな程度で扁平上皮細胞の分化を示します。ESCCは、非定型基底細胞を含む上皮内腫瘍(IEN)または異形成として知られる多巣性組織学的前駆病変を伴うことがよくあります。上皮の変化に加えて、ESCCは上皮下コンパートメント内の組織リモデリングを示し、そこでは癌関連線維芽細胞(CAF)の活性化と免疫/炎症細胞の動員が起こり、腫瘍促進微小環境が促進されます。

ESCCの病因には、遺伝的変化と環境危険因子への曝露が含まれます。主な遺伝的病変には、腫瘍抑制遺伝子TP53およびCDKN2A(p16INK4A)の不活性化、およびCCND1(サイクリンD1)およびEGFR癌遺伝子の活性化が含まれ、細胞周期チェックポイント機能の障害、異常な増殖、および環境発がん物質への曝露に関連する遺伝毒性ストレス下での生存につながります。実際、遺伝的変化は、行動的および環境的危険因子、最も一般的にはタバコおよびアルコールの使用と密接に相互作用します。タバコの煙には、アルコールの主要な代謝物でもあるアセトアルデヒドなどの人間の発がん物質が含まれています。アセトアルデヒドはDNA付加体と鎖間DNA架橋を誘導し、DNA損傷とDNA変異の蓄積と染色体不安定性を引き起こします。過剰な分裂促進刺激と癌遺伝子活性化による異常な増殖を考えると、食道上皮細胞の悪性形質転換は、抗酸化剤の活性化、オートファジー、上皮間葉転換(EMT)などの遺伝毒性ストレスに対処するメカニズムによって促進されます。興味深いことに、これらの細胞保護機能は、高いCD44(CD44H)発現を特徴とし、腫瘍の開始、浸潤、転移、および治療抵抗性の能力を有するESCC癌幹細胞(CSC)においてしばしば活性化される5、6、7。

ESCCは、細胞培養およびげっ歯類モデルでモデル化されています8,9。過去30年間で、ESCCの堅牢な遺伝子操作マウスモデルが開発されました。これらには、CCND1およびEGFRトランスジェニックマウス10、11ならびにp53ならびにp120Ctonノックアウトマウス12、13が含まれる。ただし、単一の遺伝的変化は通常、急速に発症するESCCをもたらすことはありません。この課題は、ESCC14のヒトの遺伝的病変をよく再現する食道発がん物質の使用によって克服されました。例えば、4-ニトロキノリン-1-オキシド(4NQO)は、CCND1トランスジェニックマウスにおけるESCC発生を加速する15。近年、推定される食道上皮幹細胞、前駆細胞、およびそれらのそれぞれの運命が、細胞系譜追跡可能なマウスモデルにおいて研究されている3,4。さらに、これらの細胞系譜追跡可能なマウスは、ESCCの起源の細胞を探索し、そのような細胞が従来の組織学およびオミックスベースの分子特性評価を介してCD44H CSCをどのように生成するかを探索するために利用されています7。

これらのマウスモデルに関連する新たな分野の1つは、元の組織の構造がex vivoで再現される3次元(3D)オルガノイドシステムで生きたESCCおよび前駆細胞を分析するための細胞培養技術の新しい応用です7,8,9。これらの3Dオルガノイドは、原発性および転移性腫瘍(リンパ節、肺、肝臓の病変など)を含むマウス組織から単離された単一細胞懸濁液から急速に増殖します。細胞は基底膜抽出物(BME)に包埋され、明確に定義された無血清細胞培養培地が供給されます。3Dオルガノイドは7〜10日以内に成長し、得られた球状構造は、CSCマーカー、EMT、オートファジー、増殖、分化、アポトーシス細胞死など、さまざまな細胞特性と機能を分析するための継代培養、凍結保存、およびアッセイに適しています。

これらの方法は、頭頸部粘膜(口腔、舌、咽頭、喉頭)や前胃などの層状扁平上皮組織から確立された3Dオルガノイド培養に広く適用できます。頭頸部粘膜は食道と隣接しており、2つの組織は同様の組織組織、機能、および病気に対する感受性を共有しています。頭頸部扁平上皮癌(HNSCC)とESCCの両方が、遺伝的病変と、タバコやアルコール曝露などのライフスタイル関連の環境リスク要因を共有しています。この類似性を強調すると、タバコ煙模倣体4NQOで処理されたマウスは、HNSCCとESCCの両方を容易に発症します。以下に説明するプロトコルをHNSCCのモデリングに簡単に適用できることを考慮して、これらの病変から3Dオルガノイド培養を確立するための具体的な手順が含まれています。

ここでは、4NQOで治療されたマウスで発生する正常、腫瘍前、およびESCC病変を表すマウス食道3Dオルガノイド(MEO)を生成するための詳細なプロトコルを提供します。C57BL/6などの一般的な実験株や、細胞系譜追跡可能なその他の遺伝子操作された誘導体など、さまざまなマウス系統を利用することができます。正常または罹患したマウス食道上皮の単離、単一細胞懸濁液の調製、増殖する3Dオルガノイドの培養とモニタリング、継代培養、凍結保存、形態やその他のアプリケーションを含むその後の分析のための処理など、重要なステップを強調しています。

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プロトコル

マウス実験は、規制に従い、動物プロトコル#AABB1502の下で計画および実施され、コロンビア大学の施設動物管理および使用委員会によってレビューおよび承認されました。マウスは、マウスの人道的な治療を保証し、マウスに適切な獣医ケアを提供し、実験室職員に実験室安全トレーニングを提供する適切な動物飼育施設に収容されました。

1.食道IENおよびESCC病変を誘発するための4NQOによるマウスの治療(時間的考慮事項:最大28週間)

注:腫瘍性食道病変を表すMEOを生成するために、マウスは、Tangらによって前述されたように、4NQOを介した化学的発がんを受けます14。正常/非腫瘍性のMEOは、未治療のマウスから生成されます。

  1. マウス
    1. ケージごとに4〜5匹のマウスを飼育し、実験を開始する前に少なくとも1週間動物施設に順応させます。加齢に伴う障害が28週間の完全な実験の早期終了をもたらす可能性を減らすために、8週齢から16週齢のマウスから始めます。.
      注:体重約20〜30 gのC57BL / 6マウスがこのプロトコルで利用されました。より短い実験のために、より古いマウスが使用され得る。雄または雌のマウスが許容されます。対照(無治療、セクション1.3.1を参照)マウスは、年齢および性別が一致しなければならない。
  2. 4NQOを含む飲料水の調製
    1. エチレングリコール溶液1 mg/mL 4NQOストック溶液を調製します(材料表)。シーリングフィルムで覆われた500 mLガラスビーカー内の100 mLの99.9%エチレンプロピレングリコールに100 mgの4NQOを溶解します。マグネチックスターラーを使用して室温(RT)で800rpmで30分間完全に混合します。4°Cで保存してください。
    2. 1 mg/mL 4NQO原液100 mLにオートクレーブ滅菌した脱イオン水900 mLを加え、シーリングフィルムで覆われた2 Lプラスチックメスシリンダーで転倒混合します。10%エチレングリコール中の100 μg/mL 4NQOの1 Lの容量は、500 mLの飲料ボトルを備えた2つのマウスケージに役立ちます。
      注意:注意:4NQOは、癌を引き起こす可能性のある合成化学発がん物質です。ニトリル手袋と長袖の白衣を着用し、つま先の開いた靴を履いてください。適切な目の保護、顔の保護、およびヘッドカバーを検討してください。廃棄物処理の場合、4NQOは、環境衛生と安全による有害廃棄物管理に関する制度的ガイドラインに従って、ラベルの付いた容器に入れる必要があります。
  3. 4NQOによる治療とモニタリング
    1. 飲用ボトルを取り付け、飲料水を 自由に 使用して4NQOをマウスに16週間投与します。ビヒクル(無処理)コントロールとして10%(w / v)プロピレングリコールを使用してください。
      注:IENを誘発するために、4NQO治療のより短い期間が使用される場合があります。
    2. 週に一度水を補充してください。
    3. 各マウスを実験室の天秤の上のプラスチック容器に入れて、毎週体重を量ります。
    4. 16週間の4NQO治療期間の終わりに、4NQO後の観察期間中、最大12週間マウスに定期的な飲料水を与え始めます(図1)。
    5. 苦痛の兆候(運動障害、猫背の習慣、引きこもり行動など)、嚥下障害、脱水症状がないかマウスを毎日監視します。さらに、体重または食物および液体摂取量の変化についてマウスを毎週評価します。体重が初期体重から10%以上低下した場合は、マウスに液体栄養補助食品を与えます。
      注:液体栄養補助食品に耐性のある体重の減少はESCCを示している可能性があり、体重の20%以上を失うマウスは安楽死させる必要があります。重要なことに、MEOは時期尚早に安楽死させたマウスから生成することができます。遺伝子改変のないC57BL/6マウスは、通常、4NQO後の観察期間が終了するまで、罹患率の兆候を示さず、ESCC病変が見えることに注意してください。
  4. 動物の準備
    1. CO2で満たされたCO2チャンバー内で、チャンバー容積の30%〜70%を毎分変位させる流速でマウスを安楽死させる。頸部脱臼による死亡を確認。
    2. 21 Gの針を使用して、仰臥位のマウスの手足と鼻を解剖プラットフォームに固定します。
    3. マウスの腹面を70%エタノールで消毒します。
  5. 解剖(時間考慮:0.5時間)
    1. 中腹部の毛皮と皮膚をつまんで皮膚を開き、下の内臓から確実に放出されるようにします。外科用ハサミを使用して、下腹部からあごまで頭蓋尾の腹側正中線切開を行います。
    2. 正中線切開から始めて、外科用ハサミを使用して、マウスの両側の手足まで伸びる放射状の切り込みを入れます。皮膚のフラップをはがします。
    3. 頸部気管を露出させるには、解剖ハサミを使用して正中線で唾液腺を分割します。気管は腺の奥深くにあります。
    4. 胸部気管を露出させるには、胸骨を取り除きます。
      1. 鉗子で腹膜をそっとつまんで持ち上げ、はさみを使用して腹膜を胸郭に沿って頭蓋尾側と横方向に分割します。
      2. 横隔膜の尾面から肝臓を静かに引っ込め、はさみを使用して胸骨ノッチ、特に剣状突起の背側表面で横隔膜を小さく切開します。これにより、肺と心臓が内臓胸膜から解放されます。
      3. 胸郭を胸部の内容物から分離します。横隔膜の切開部にハサミを挿入し、頸部ガードルまで頭蓋状に解剖します。この解剖中は、下の臓器への損傷を避けるために、胸骨の背側に密着してください。解剖面が気管の前方にあることを確認してください。
      4. ハサミを使用して胸骨の両側の肋骨を切り、胸骨を取り除きます。胸部の内容物が露出していることを確認してください。
    5. 腹部食道を露出させます。鉗子で前庭を持って胃を前方にそっと持ち上げます。脾臓、膵臓、腸間膜をハサミで胃と食道から解剖します。
    6. 胸部食道を露出させます(図2)。
      1. 甲状腺軟骨のすぐ尾側の気管をそっと持ち上げ、虹彩ハサミを使用して気管の背側の食道を解剖します。
      2. 甲状腺軟骨の気管を虹彩ハサミで分割します。
      3. 尾方向に慎重に解剖することにより、食道の残りの部分から気管を剥がします。
      4. 肺、心臓、胸腺を気管で まとめ て取り除きます。大動脈と大静脈を解剖して分割するときは、食道の損傷を避けるように注意してください。
    7. 幽門の胃をハサミで分けます。
    8. 鉗子で前庭を保持し、頭蓋骨を解剖することによって食道を椎骨から分離します。
    9. 食道を甲状軟骨のレベルで分割し、食道と胃を まとめて採取します(図3)。
    10. 噴門で食道を分割して胃と食道を分離します(図4、上パネル、赤線)。
    11. 食道の外面の筋膜を解剖します。組織学用のサンプルを予約するには(オプション)、食道の半分を取り除き、ハサミで縦方向に分割します。残りの無傷の食道を氷上の冷たいPBSに入れます。
    12. より大きな曲率に沿って胃を開き、PBSで十分に洗います。前胃を分離し、冷たいPBSで洗います。前胃を氷の上の冷たいPBSに入れます。
    13. 舌を収穫するには、鼻の21 G針を外し、ピンセットで舌を引き抜きます。できるだけ長く舌を切ります。氷の上の冷たいPBSに舌を置きます。

2. マウス食道オルガノイド(MEO)培養の確立

注:このプロトコルは、トリプシン処理の前に舌組織を細刻するステップを追加して、マウス舌オルガノイド培養を確立するためにも使用できます。ステップ 2.2.3 の注記を参照してください。

  1. 試薬の調製
    注意: 試薬のリストは 、材料表に記載されています。特に明記されていない限り、製造元の指示に従ってストック溶液を準備して保管してください。
    1. このプロトコルで使用される基底膜マトリックス(BME)のシングルユースアリコートは、使用日まで-20°Cで保管され、その後氷上または2〜8°Cで解凍され、使用されていないときはいつでも氷上に保たれていることを確認してください。
    2. 大豆トリプシンインヒビター(STI)250mgをPBS1,000mL(ストック濃度250mg/mL)に溶解し、ろ過滅菌(0.22μm)します。50 mLのアリコートを円錐形のチューブに分注し、4°Cで最大6か月間保管します。
    3. マウスオルガノイド培地(MOM)の調製:1 mM N-アセチル-L-システイン(NAC)、2%R-スポンジンおよびノギン馴化培地(RN CM)、1x N-2サプリメント、1x B-27サプリメント、10 mM HEPES、1x抗生物質抗真菌薬、1x GlutaMAXサプリメント、および100 ng/mLマウス上皮成長因子(mEGF)をアドバンストDMEM/F12で補充します。MOMを一度に500 mLずつ準備し、50 mLアリコートに分割し、使用する準備ができるまで2〜8°Cで保管します。使用直前に0.5 μg/mLのアムホテリシンBと10 μM Y-27632を加えてください。
    4. 使用前に、MOM、0.25%トリプシン、および大豆トリプシン阻害剤(STI)を水浴またはビーズ浴で37°Cに予熱します。
  2. 解剖したマウス組織からのケラチノサイトの単離(時間的考察:2時間)
    1. 食道組織をPBS中の500 μLのディスパーゼ(合計2.5〜5単位)に移し、サーモミキサーで37°Cおよび800rpmで10分間インキュベートします。
    2. 組織を培養皿に移し、鉗子を使用して上皮から筋肉層を慎重に取り除きます(図4)。
      注:このステップは、経験豊富な研究者がディスパーゼでインキュベーションする前に実行することもできます。
    3. 上皮を500 μLの0.25%トリプシンを含むマイクロ遠心チューブに移し、サーモミキサーで37°C、800 rpmで10分間インキュベートします。
      注:出発物質が舌組織である場合は、トリプシンを加える前に、滅菌メスで組織を約1〜2 mm2 のサイズの小さな断片に細かく刻みます。
    4. 2,000 x g で5〜10秒間短時間遠心分離して、組織をペレット化します。100 μmのセルストレーナーで50 mLのコニカルチューブを準備します。組織/細胞懸濁液を、円運動を使用して広いボアチップを備えたストレーナに通します。
    5. ストレーナーを通して3 mLのSTIを加え、円運動を使用して洗浄します。
    6. 1 mLのツベルクリンシリンジプランジャーのベースでストレーナーをこすり、細胞を押し込みます。
    7. ストレーナーを3 mLのPBSで3〜5回洗浄し、洗浄の合間にシリンジのベースでストレーナーをこすります。
    8. チューブを300 x g で4°Cで10分間遠心分離し、細胞をペレット化します。
    9. 上清を取り除き、チューブに1 mLの溶液を残します。
    10. 残りの1 mLのペレットを再懸濁し、細胞懸濁液を70 μmのセルストレーナーを通して新しい50 mLコニカルチューブに移します。
    11. チューブを300 x g で4°Cで10分間遠心分離し、細胞をペレット化します。
    12. ペレットを100 μLのMOMに再懸濁します。必要に応じて音量を調整します。トリパンブルー除外による自動細胞カウントを実行します。
  3. 初期細胞懸濁液の播種(時間考慮:<1時間)
    1. 24穴細胞培養プレートを37°Cのインキュベーター内で予熱します。
    2. 5,000個の生細胞を75%(v/v)BME/MOMでプレートし、ウェルあたり50 μLの総容量でプレートします。以下の計算例に従って、播種するウェルの数を最大化し、1つの追加のウェルに対してBMEで十分なセルを準備します。
      注:凍結保存培地(FBS中の10%DMSO)中の余分な細胞を最大濃度1 x 106 細胞/mLで凍結保存します。クライオバイアルを凍結容器に入れて-80°Cで一晩保存します。 それらを気相液体窒素に移して長期保存します。
    3. 微量遠心チューブでは、まずMOMで適切な細胞希釈液を調製し、次にめっき直前にワイドボアチップを使用してBMEを追加します。
    4. 200 μLのワイドボアチップを使用して、チップとウェルの底部または側面との接触を避けながら、50 μLの液滴をウェルの中央にゆっくりと加えます(図5)。先端から液体を排出するために力を入れすぎないように注意してください、さもなければドームは平らになります。
    5. BMEを37°C、5%CO2、95%相対湿度(RH)インキュベーター内で30分間固化させます。
    6. 0.5 μg/mLのアムホテリシンBと10 μM Y-27632を添加したウェルあたり500 μLのMOMを慎重に加えます。
      注:最初の一次培養を通してすべてのMOMにアムホテリシンを追加します。Y-27632は、すべてのパッセージについて、継代当日(0日目)にのみ追加します。
    7. 3〜4日目にMOMを変更し、その後2〜3日ごとに通過する準備ができるまで交換します。
    8. 7〜10日目に、オルガノイドを画像化し、形成されたオルガノイドの数を最初に播種した細胞の数で割ることによってオルガノイド形成率(OFR)を測定する。
      計算例:
      figure-protocol-1
  4. マウス食道オルガノイド(MEO)の継代と凍結保存(時間的考察:<1.5時間)
    1. BMEを解凍して氷上に保ちます。使用前に、MOM、0.05%トリプシン、およびSTIを水またはビーズバスで37°Cに予熱します。24穴細胞培養プレートを37°Cのインキュベーター内で予熱します。
    2. 広口径マイクロピペットチップを使用して、上清とともにBMEドーム内のオルガノイドを収集します。上下にピペッティングしてBMEを混乱させます。
      注:同一のサンプルを含むウェルを1つのマイクロ遠心チューブに結合します。
    3. 2,000 x g で10〜15秒間短時間遠心分離して、オルガノイドをペレット化します。上清を取り除いて廃棄する。
    4. ペレットを静かに取り除き、ペレットを500 μLの0.05%トリプシンに再懸濁します。
    5. チューブをサーモミキサーで37°C、800rpmで10分間インキュベートします。
    6. 600 μLのSTIでトリプシンを不活化します。
    7. チューブを300 x g で4°Cで5分間遠心分離し、細胞をペレット化します。
    8. 上清を取り除いて廃棄する。細胞ペレットを100 μLのMOMに再懸濁します。トリパンブルー除外による自動細胞カウントを実行します。
      注意: 音量は必要に応じて調整できます。
    9. 75%(v/v)BME/MOMで2,000〜5,000個の生細胞を、ウェルあたり50 μLの総容量でプレートします。プレーティングするウェルの数を最大化し、前述の計算例に従って、1つの追加のウェルに対してBMEで十分なセルを準備します。
      注:凍結保存培地(FBS中の10%DMSO)中の余分な細胞を最大濃度1 x 106 細胞/mLで凍結保存します。クライオバイアルを凍結容器に入れて-80°Cで一晩保存します。 それらを気相液体窒素に移して長期保存します。
    10. 微量遠心チューブでは、まずMOMで適切な細胞希釈液を調製し、次にめっき直前にワイドボアチップを使用してBMEを追加します。
    11. 200 μLのワイドボアチップを使用して、チップとウェルの底部または側面との接触を避けながら、50 μLの液滴をウェルの中央にゆっくりと加えます。先端から液体を排出するために力を入れすぎないように注意してください、さもなければドームは平らになります。
    12. プレートを30°C、5%CO2,95%RHインキュベーター内で2分間インキュベートします。
    13. 10 μM Y-27632を添加したウェルあたり500 μLのMOMを慎重に添加します。
      注意: Y-27632は、継代当日(0日目)にのみ追加してください。メディア変更時に追加する必要はありません。アムホテリシンBを追加する必要はもうありません。
    14. 3〜4日目にMOMを変更し、その後2〜3日ごとに通過する準備ができるまで交換します。
    15. 7〜10日目に、オルガノイドを画像化し、OFRを測定します。
  5. マウス食道オルガノイド(MEO)の融解と回収(時間的考察:<1時間)
    1. BMEを解凍して氷上に保ちます。24穴細胞培養プレートを37°Cのインキュベーター内で予熱します。
    2. 15 mLのコニカルチューブで10 mLのコールドまたはRT MOMまたはPBSを準備します。
    3. クライオバイアルを37°Cの水浴またはビーズ浴で約30秒から1分間、または小さな氷ペレットが残るまで解凍します。
    4. 予め湿らせたピペットチップを使用して、細胞懸濁液をMOMまたはPBSを含むチューブに滴下してゆっくりと移します。
    5. チューブを300 x g 、4°Cで5分間遠心分離して、細胞をペレット化します。
    6. 上清を取り除いて廃棄する。細胞ペレットを100 μLのMOMに再懸濁します。必要に応じて音量を調整します。トリパンブルー除外による自動細胞カウントを実行します。
    7. 75%(v/v)BME/MOMで5,000〜10,000個の生細胞をプレートし、ウェルあたり50 μLの総容量を使用します。プレーティングするウェルの数を最大化し、前述の計算例に従って、1つの追加のウェルに対してBMEで十分なセルを準備します。
    8. マウス食道オルガノイド(MEO)の継代および凍結保存のためのプロトコルの残りのステップを続行します(ステップ2.4.11を参照)。

3. パラフィン包埋用オルガノイドの調製(時間考慮:<1時間[試薬調製用プラス1.5時間])

  1. ワイドボアマイクロピペットチップを使用して、マイクロ遠心チューブごとに3つのウェルを収集します。上清と一緒にBMEドームにオルガノイドを収集します。上下にピペッティングしてBMEを混乱させます。
  2. 2,000 x g で10〜15秒間短時間遠心分離して、オルガノイドをペレット化します。上清を取り除いて廃棄する。
  3. ペレットを静かに取り除き、300 μLの4%パラホルムアルデヒド(PFA)にペレットを再懸濁します。
  4. オルガノイドを4°Cで一晩固定します。
  5. 2,000 x g で10〜15秒間短時間遠心分離して、オルガノイドをペレット化します。できるだけ多くのPFAを取り外して廃棄します。
  6. ペレットを静かに取り除き、ペレットを500 μLのPBSに再懸濁します。
    注:固定オルガノイドは、次のステップに進む前に、4°Cで最大2週間保存できます。
  7. 50 mLの寒天ゲル(2%寒天と2.5%ゼラチン)を準備します。
    注:インキュベーション時間のために寒天ゲルストックを事前に準備し、その後オートクレーブサイクルを実施します。
    1. 1 gのバクト寒天と1.25 gのゼラチンを50 mLの水に150 mLのオートクレーブ可能なガラスビーカーに再懸濁します。
    2. サスペンションを回転させ、RTで30〜60分間放置します。
    3. オートクレーブを121°Cで20分間行います。
    4. 少し冷まして、15 mLのコニカルチューブに5 mLのアリコートを分注します。.
    5. RTで最大6か月間保管してください。
  8. 微小遠心チューブラックを反転させ、その表面をシーリングフィルムのシートで覆って埋め込み面を準備します。対応するオルガノイドIDでラベル付けします。
  9. チューブを300 x g で5分間遠心分離し、オルガノイドをペレット化します。上清を取り除いて廃棄する。
  10. 一方、寒天ゲルを含む15 mLのコニカルチューブを100 mLの水を入れた150 mLのガラスビーカーに入れ、最高出力設定で1〜2分間、または水が沸騰し始めて寒天ゲルが液体状態になるまで電子レンジで加熱することにより、寒天ゲルを液化します。
    注意: 電子レンジで加熱する前に、寒天ゲルを含む円錐管のキャップを緩めてください。
  11. オルガノイドペレットを入れた微小遠心チューブを、マイクロ遠心チューブに水を導入することなく、温水に部分的に沈めます。
  12. チューブの側面に50 μLの寒天を加えて、オルガノイドペレットを注意深く重ねます。
  13. ペレットを乱すことなく(再懸濁せず、ペレットを無傷のままにしておく)、寒天ゲル液滴中のペレットを包埋面上のシールフィルムに移す。
  14. ステップ3.12とステップ3.13を繰り返し、さらに50 μLの液体寒天ゲルを追加して残りのオルガノイドペレットを収集し、同じゲル液滴に注意深く加えます。
  15. オルガノイドペレットを含む液滴を4°Cで45分間インキュベートします。
  16. 鉗子を使用して、オルガノイドペレットを含む液滴を標識された病理カセットに注意深く移します。
  17. カセットを70%エタノールに4°Cで最大1か月間保管します。
  18. 日常的な組織学的処理を介してパラフィン包埋を進め、パラフィンブロックを調製します。

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結果

このプロトコルは、飲料水中で16週間の4NQO投与からなる特定の治療レジメンに従って、4NQO処置マウスからの正常な食道組織またはESCC腫瘍組織からマウス食道オルガノイド(MEO)を生成するプロセスを説明し、続いて10週間から12週間の観察期間を投与する(図1)。次に、マウスを安楽死させて舌または食道組織の解剖を行います(図2 および 図3)。その後の単一細胞単離に利用される無傷の食道から上皮層を単離する方法(図4)について説明します。食道由来の上皮細胞は、基底膜マトリックス中の細胞を含む50 μLの液滴に1ウェルあたり5,000細胞で最初に播種され、十分に特徴付けられた無血清細胞培養培地(図5)、平均7〜10日間にわたってオルガノイドを形成させます。マウス食道オルガノイド、舌オルガノイド、前胃オルガノイドは、位相差/明視野イメージングによ...

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ディスカッション

ここで説明するプロトコルでは、MEO の生成と分析に関するいくつかの重要な手順と考慮事項があります。MEO実験の再現性と厳密性を確保するには、生物学的複製と技術的複製の両方が重要です。生物学的複製の場合、ESCCを有する2〜3匹の独立したマウスは、一般に、実験条件ごとに十分である。ただし、生物学的反復の適切な数は、個々の研究でテストするパラメーターによって異なる場合があります。例えば、肉眼的に見える病変または組織学的IENおよびESCC病変のない4NQO処理マウスから腫瘍性オルガノイドがどのくらい早期かつどのくらいの頻度で検出されるかは現在不明です。4NQOは様々なマウス系統において食道病変を誘導するが14、MEOはC57BL/6マウスのみから作製されている。ESCCの発生と進行は、Trp53の喪失やサイクリンD1の過剰発現などの遺伝子操作された遺伝的病変を持つマウスで加速されます7,14,15。このよう...

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開示事項

著者は利益相反を宣言しません。

謝辞

コロンビア大学のハーバート・アーヴィング総合がんセンターの共有リソース(Flow Cytometry、Molecular Pathology、Confocal & Specialized Microscopy)の技術サポートに感謝する。Alan Diehl博士、Adam J. Bass博士、Kwok-Kin Wong博士(NCI P01食道発がんのメカニズム)とRustgi研究室とNakakawa研究室のメンバーに有益な議論をしていただき感謝します。この研究は、次のNIH助成金によってサポートされました:P01CA098101(H.N.およびA.K.R.)、R01DK114436(H.N.)、R01AA026297(H.N.)、L30CA264714(F.F.F.)、DE031112-01(F.M.H.)、KL2TR001874(F.M.H.)、3R01CA255298-01S1(J.G.)、2L30DK126621-02

(J.G.)R01CA266978 (C.L.)、R01DK132251 (C.L.)、R01DE031873 (C.L.)、P30DK132710 (C.M. および H.N.)、および P30CA013696 (別名)。H.N.とC.L.は、コロンビア大学ハーバートアーヴィング総合がんセンターMulti-PIパイロット賞を受賞しています。H.N.はファンコニ貧血研究基金賞を受賞しています。F.M.H.は、The Mark Foundation for Cancer Research Award(20-60-51-MOME)およびAmerican Association for Cancer Research Awardを受賞しています。J.G.は、米国消化器病学会(AGA)賞を受賞しています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.05% トリプシン-EDTAサーモフィッシャーサイエンティフィック25-300-120
0.25% トリプシン-EDTAサーモフィッシャーサイエンティフィック25-200-114
0.4% トリパンブルーサーモフィッシャーサイエンティフィックT10282
針なし1 mLツベルクリンシリンジBD309659
1.5 mL 微量遠心チューブサーモフィッシャーサイエンティフィック05-408-129
100 & マイクロm細胞ストレーナーサーモフィッシャーサイエンティフィック22363549
15 mL コニカルチューブサーモフィッシャーサイエンティフィック14-959-53A
200 & マイクロ;L ワイドボアマイクロピペットチップサーモフィッシャーサイエンティフィ212361A
21 G ニードルBD305167
24 ウェルプレートサーモフィッシャーサイエンティフィック12-556-006
4-ニトロキノリン-1-オキシド (4NQO)東京化学工業NO250
50 mL コニカルチューブサーモフィッシャーサイエンティフィック12-565-270
6 ウェルプレートサーモフィッシャーサイエンティフィック12556004
70 & マイクロ;m セルストレーナーサーモフィッシャーサイエンティフィック22363548
99.9% エチレンプロピレングリコールSK picglobal
Advanced DMEM/F12サーモフィッシャーサイエンティフィック12634028
アムホテリシン BGibco, サーモフィッシャーサイエンティフィック15290018ストック濃度 250 & マイクロ;g/mL、最終濃度0.5 µg/mL
抗生物質-抗真菌剤サーモフィッシャーサイエンティフィック15240062ストック濃度 100x、最終濃度 1x
B-27 サプリメントサーモフィッシャーサイエンティフィック17504044ストック濃度 50x、最終濃度 1x
バクト寒天BD214010
CO2 インキュベーター、例:Heracell 150iサーモフィッシャーサイエンティフィック51026406同等の
Countess II FL 自動セルカウンターサーモフィッシャーサイエンティフィックAMQAX1000または同等の
クライオバイアルサーモフィッシャーサイエンティフィック03-337-7D
DietGel 76Aクリア H2O72-07-5022
ジメチルスルホキシド (DMSO)MilliporeSigmaD4540
ディスパーゼコーニング354235ストック濃度50 U / mL、最終濃度2.5–5 U/mL
解剖ハサミVWR25870-002
ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水 (PBS)サーモフィッシャーサイエンティフィック14190250ストック濃度 1x
ウシ胎児血清 (FBS)HyCloneSH30071.03
鉗子VWR82027-386
冷凍容器コーニング432002または同等の
ゼラチンサーモフィッシャーサイエンティフィックG7-500
GlutaMAXサーモフィッシャーサイエンティフィック35050061ストック濃度 100倍、最終濃度 1x
HEPESサーモフィッシャーサイエンティフィック15630080ストック濃度 1 M、最終濃度 10 mM
ホットプレート/スターラーコーニングPC-420Dまたは同等の
ラボアーマービーズバス(またはウォーターバス)VWR89409-222または同等の
ラボバランスOhaus71142841または同等の
マトリゲル基底膜抽出物(BME)コーニング354234
遠心分離機MinispinEppendorf22620100または同等の
マイクロ遠心チューブラックSouthern Labware0061
N-2 サプリメントサーモフィッシャーサイエンティフィック17502048ストック濃度 100x、最終濃度 1x
N-アセチルシステイン (NAC)Sigma-AldrichA9165ストック濃度 0.5 M、最終濃度 1 mM
パラフィルム M ラップサーモフィッシャーサイエンティフィックS37440
パラホルムアルデヒド (PFA)ミリポアシグマ158127-500G
病理学カセットサーモフィッシャーサイエンティフィック22-272416
位相差顕微鏡ニコンまたは同等の
組換えマウス上皮成長因子 (mEGF)Peprotech315-09-1mgストック濃度 500 ng/µL、最終濃度 100 ng/mL
R-Spondin1 および Noggin を発現する RN 細胞馴染培地 (RN CM)N/AN/Aご要望に応じてオルガノイドおよび細胞培養コアを通じて入手可能、最終濃度 2%
Sorval ST 16R 遠心分離機サーモフィッシャーサイエンティフィック75004380または同等の
大豆トリプシン阻害剤 (STI)MilliporeSigmaT9128ストック濃度 250 & マイクロ;g/mL
ThermoMixer CThermo Fisher Scientific14-285-562 PMまたは同等の
Y-27632Selleck ChemicalsS1049ストック濃度 10 mM、最終濃度 10 & micro;メートル
ック またはマイクロ

参考文献

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