このプロトコルでは、化学的発がんによって誘発される正常、腫瘍前、および扁平上皮がんの病変を表すマウスの口腔食道3Dオルガノイドを生成および特性評価するための重要なステップについて説明します。
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方法論記事
3Dオルガノイドによる口腔食道扁平上皮癌のモデリング
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
食道扁平上皮癌(ESCC)は世界中で蔓延しており、毎年すべての食道癌症例の90%を占め、すべてのヒト扁平上皮癌の中で最も致命的です。ESCCの開始と発達に伴う分子変化の定義における最近の進歩にもかかわらず、患者の予後は依然として不良です。これらの分子変化の機能アノテーションは必要な次のステップであり、ESCCの分子的特徴を捉え、機能アノテーションのために簡単かつ安価に操作できるモデルが必要です。タバコ煙模倣体4-ニトロキノリン1-オキシド(4NQO)で治療されたマウスは、予想通りESCCおよび食道前腫瘍を形成する。注目すべきことに、4NQO病変は口腔、最も一般的には舌、および前胃にも発生し、これらはすべて層状扁平上皮を共有しています。ただし、これらのマウスは、同質遺伝子マウスモデルの生成に時間とリソースを大量に消費するため、機能仮説検証のために単純に操作することはできません。ここでは、マウスESCCまたは前腫瘍細胞を ex vivoで特徴付けるために、4NQOで処理したマウスから単一細胞由来の3次元(3D)オルガノイドを生成することにより、この制限を克服します。これらのオルガノイドは、ESCCおよび食道前新生物の顕著な特徴を捉え、安価かつ迅速に活用して同質モデルを形成することができ、同系移植実験に利用することができます。正常、腫瘍前、およびSCCマウス食道組織から3Dオルガノイドを生成し、これらのオルガノイドを維持および凍結保存する方法を示します。これらの汎用性の高いオルガノイドの用途は幅広く、遺伝子操作マウスの利用、フローサイトメトリーまたは免疫組織化学によるさらなる特性評価、CRISPR技術を使用した同系オルガノイド株の生成、薬物スクリーニングまたは同系移植が含まれます。このプロトコルで実証された技術の広範な採用は、ESCCの深刻な負担と戦うためのこの分野の進歩を加速すると信じています。
概要
食道扁平上皮癌(ESCC)は、診断の遅れ、治療抵抗性、および転移のために、ヒト扁平上皮癌の中で最も致命的です1,2。ESCCは、食道の管腔表面を覆う層状扁平上皮から生じる。扁平上皮は、増殖性基底細胞と基底上細胞層内の分化細胞で構成されています。生理学的条件下では、基底細胞はp63、Sox2、サイトケラチンK5およびK14などのマーカーを発現し、分化細胞はK4、K13、およびIVLを発現します。基底細胞自体は不均一であり、K153およびCD734などのマーカーによって定義される推定幹細胞を含む。恒常性において、基底細胞は基底上細胞層内で有糸分裂後の終末分化を受けるのに対し、分化した細胞は内腔に移動して落屑し、上皮再生を完了する。ESCCは、それらの起源の細胞を彷彿とさせ、さまざまな程度で扁平上皮細胞の分化を示します。ESCCは、非定型基底細胞を含む上皮内腫瘍(IEN)または異形成として知られる多巣性組織学的前駆病変を伴うことがよくあります。上皮の変化に加えて、ESCCは上皮下コンパートメント内の組織リモデリングを示し、そこでは癌関連線維芽細胞(CAF)の活性化と免疫/炎症細胞の動員が起こり、腫瘍促進微小環境が促進されます。
ESCCの病因には、遺伝的変化と環境危険因子....
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プロトコル
マウス実験は、規制に従い、動物プロトコル#AABB1502の下で計画および実施され、コロンビア大学の施設動物管理および使用委員会によってレビューおよび承認されました。マウスは、マウスの人道的な治療を保証し、マウスに適切な獣医ケアを提供し、実験室職員に実験室安全トレーニングを提供する適切な動物飼育施設に収容されました。
1.食道IENおよびESCC病変を誘発するための4NQOによるマウスの治療(時間的考慮事項:最大28週間)
注:腫瘍性食道病変を表すMEOを生成するために、マウスは、Tangらによって前述されたように、4NQOを介した化学的発がんを受けます14。正常/非腫瘍性のMEOは、未治療のマウスから生成されます。
- マウス
- ケージごとに4〜5匹のマウスを飼育し、実験を開始する前に少なくとも1週間動物施設に順応させます。加齢に伴う障害が28週間の完全な実験の早期終了をもたらす可能性を減らすために、8週齢から16週齢のマウスから始めます。.
注:体重約20〜30 gのC57BL / 6マウスがこのプロトコルで利用されました。より短い実験のために、より古いマウスが使用され得る。雄または雌のマウスが許容されます。対照(無治療、セクション1.3.1を参照)マウスは、年齢および性別が一致しなければならない。
- ケージごとに4〜5匹のマウスを飼育し、実験を開始する前に少なくとも1週間動物施設に順応させます。加齢に伴う障害が28週間の完全な実験の早期終了をもたらす可能性を減らすために、8週齢から16週齢のマウスから始めます。.
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結果
このプロトコルは、飲料水中で16週間の4NQO投与からなる特定の治療レジメンに従って、4NQO処置マウスからの正常な食道組織またはESCC腫瘍組織からマウス食道オルガノイド(MEO)を生成するプロセスを説明し、続いて10週間から12週間の観察期間を投与する(図1)。次に、マウスを安楽死させて舌または食道組織の解剖を行います(図2 および 図3)。その後の単一細胞単離に利用される無傷の食道から上皮層を単離する方法(図4)について説明します。食道由来の上皮細胞は、基底膜マトリックス中の細胞を含む50 μLの液滴に1ウェルあたり5,000細胞で最初に播種され、十分に特徴付けられた無血清細胞培養培地(図5)、平均7〜10日間にわたってオルガノイドを形成させます。マウス食道オルガノイド、舌オルガノイド、前胃オルガノイドは、位相差/明視野イメージングによ.......
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ディスカッション
ここで説明するプロトコルでは、MEO の生成と分析に関するいくつかの重要な手順と考慮事項があります。MEO実験の再現性と厳密性を確保するには、生物学的複製と技術的複製の両方が重要です。生物学的複製の場合、ESCCを有する2〜3匹の独立したマウスは、一般に、実験条件ごとに十分である。ただし、生物学的反復の適切な数は、個々の研究でテストするパラメーターによって異なる場合があります。例えば、肉眼的に見える病変または組織学的IENおよびESCC病変のない4NQO処理マウスから腫瘍性オルガノイドがどのくらい早期かつどのくらいの頻度で検出されるかは現在不明です。4NQOは様々なマウス系統において食道病変を誘導するが14、MEOはC57BL/6マウスのみから作製されている。ESCCの発生と進行は、Trp53の喪失やサイクリンD1の過剰発現などの遺伝子操作された遺伝的病変を持つマウスで加速されます7,14,15。このよう.......
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開示事項
著者は利益相反を宣言しません。
謝辞
コロンビア大学のハーバート・アーヴィング総合がんセンターの共有リソース(Flow Cytometry、Molecular Pathology、Confocal & Specialized Microscopy)の技術サポートに感謝する。Alan Diehl博士、Adam J. Bass博士、Kwok-Kin Wong博士(NCI P01食道発がんのメカニズム)とRustgi研究室とNakakawa研究室のメンバーに有益な議論をしていただき感謝します。この研究は、次のNIH助成金によってサポートされました:P01CA098101(H.N.およびA.K.R.)、R01DK114436(H.N.)、R01AA026297(H.N.)、L30CA264714(F.F.F.)、DE031112-01(F.M.H.)、KL2TR001874(F.M.H.)、3R01CA255298-01S1(J.G.)、2L30DK126621-02
(J.G.)R01CA266978 (C.L.)、R01DK132251 (C.L.)、R01DE031873 (C.L.)、P30DK132710 (C.M. および H.N.)、および P30CA013696 (別名)。H.N.とC.L.は、コロンビア大学ハーバートアーヴィング総合がんセンターMulti-PIパイロット賞を受賞しています。H.N.はファンコニ貧血研究基金賞を受賞しています。F.M.H.は、The Mark Foundation for ....
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 0.05% トリプシン-EDTA | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 25-300-120 | |
| 0.25% トリプシン-EDTA | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 25-200-114 | |
| 0.4% トリパンブルー | サーモフィッシャーサイエンティフィック | T10282 | |
| 針なし1 mLツベルクリンシリンジ | BD | 309659 | |
| 1.5 mL 微量遠心チューブ | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 05-408-129 | |
| 100 & マイクロm細胞ストレーナー | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 22363549 | |
| 15 mL コニカルチューブ | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 14-959-53A | |
| 200 & マイクロ;L ワイドボアマイクロピペットチップ | サーモフィッシャーサイエンティフィ | 212361A | |
| 21 G ニードル | BD | 305167 | |
| 24 ウェルプレート | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 12-556-006 | |
| 4-ニトロキノリン-1-オキシド (4NQO) | 東京化学工業 | NO250 | |
| 50 mL コニカルチューブ | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 12-565-270 | |
| 6 ウェルプレート | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 12556004 | |
| 70 & マイクロ;m セルストレーナー | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 22363548 | |
| 99.9% エチレンプロピレングリコール | SK picglobal | ||
| Advanced DMEM/F12 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 12634028 | |
| アムホテリシン B | Gibco, サーモフィッシャーサイエンティフィック | 15290018 | ストック濃度 250 & マイクロ;g/mL、最終濃度0.5 µg/mL |
| 抗生物質-抗真菌剤 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 15240062 | ストック濃度 100x、最終濃度 1x |
| B-27 サプリメント | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 17504044 | ストック濃度 50x、最終濃度 1x |
| バクト寒天 | BD | 214010 | |
| CO2 インキュベーター、例:Heracell 150i | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 51026406 | 同等の |
| Countess II FL 自動セルカウンター | サーモフィッシャーサイエンティフィック | AMQAX1000 | または同等の |
| クライオバイアル | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 03-337-7D | |
| DietGel 76A | クリア H2O | 72-07-5022 | |
| ジメチルスルホキシド (DMSO) | MilliporeSigma | D4540 | |
| ディスパーゼ | コーニング | 354235 | ストック濃度50 U / mL、最終濃度2.5–5 U/mL |
| 解剖ハサミ | VWR | 25870-002 | |
| ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 14190250 | ストック濃度 1x |
| ウシ胎児血清 (FBS) | HyClone | SH30071.03 | |
| 鉗子 | VWR | 82027-386 | |
| 冷凍容器 | コーニング | 432002 | または同等の |
| ゼラチン | サーモフィッシャーサイエンティフィック | G7-500 | |
| GlutaMAX | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 35050061 | ストック濃度 100倍、最終濃度 1x |
| HEPES | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 15630080 | ストック濃度 1 M、最終濃度 10 mM |
| ホットプレート/スターラー | コーニング | PC-420D | または同等の |
| ラボアーマービーズバス(またはウォーターバス) | VWR | 89409-222 | または同等の |
| ラボバランス | Ohaus | 71142841 | または同等の |
| マトリゲル基底膜抽出物(BME) | コーニング | 354234 | |
| 遠心分離機Minispin | Eppendorf | 22620100 | または同等の |
| マイクロ遠心チューブラック | Southern Labware | 0061 | |
| N-2 サプリメント | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 17502048 | ストック濃度 100x、最終濃度 1x |
| N-アセチルシステイン (NAC) | Sigma-Aldrich | A9165 | ストック濃度 0.5 M、最終濃度 1 mM |
| パラフィルム M ラップ | サーモフィッシャーサイエンティフィック | S37440 | |
| パラホルムアルデヒド (PFA) | ミリポアシグマ | 158127-500G | |
| 病理学カセット | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 22-272416 | |
| 位相差顕微鏡 | ニコン | または同等の | |
| 組換えマウス上皮成長因子 (mEGF) | Peprotech | 315-09-1mg | ストック濃度 500 ng/µL、最終濃度 100 ng/mL |
| R-Spondin1 および Noggin を発現する RN 細胞馴染培地 (RN CM) | N/A | N/A | ご要望に応じてオルガノイドおよび細胞培養コアを通じて入手可能、最終濃度 2% |
| Sorval ST 16R 遠心分離機 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 75004380 | または同等の |
| 大豆トリプシン阻害剤 (STI) | MilliporeSigma | T9128 | ストック濃度 250 & マイクロ;g/mL |
| ThermoMixer C | Thermo Fisher Scientific | 14-285-562 PM | または同等の |
| Y-27632 | Selleck Chemicals | S1049 | ストック濃度 10 mM、最終濃度 10 & micro;メートル |
参考文献
- Rustgi, A. K., El-Serag, H. B. Esophageal carcinoma. The New England Journal of Medicine. 371 (26), 2499-2509 (2014).
- Dotto, G. P., Rustgi, A. K. Squamous cell cancers: A unified perspective on biology and genetics. Cancer Cell. 29 (5), 622-637 (2016).
- Giroux, V., <....
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再版と許可
