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方法論記事

縦断的蛍光モニタリングと嫌悪的介入のための固体培地上での個々の カエノラブディティスエレガンスの 長期培養

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DOI：

10.3791/64682

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2022年12月2日

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1Department of Molecular & Cellular Biology, University of Arizona, Tucson

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

ここでは、生涯にわたる生理学的パラメータの追跡と蛍光定量のために、単離された個々の線虫を固体培地上で培養するためのプロトコルを紹介します。この培養システムには、動物が逃げるのを防ぐために、シングルワームウェルの周りにパルミチン酸バリアが含まれており、病原菌や化学的ストレッサーなどの嫌悪的介入を使用できます。

要約

カエノラブディティスエレガンスは 、老化生物学の研究に広く使用されています。 C. elegans 老化研究の標準的な方法は、固体線虫増殖培地(NGM)上で線虫のグループを培養し、生存およびその他の生理学的表現型に関する集団レベルのデータの効率的な収集を可能にし、蛍光バイオマーカー定量のための亜集団の定期的なサンプリングを可能にします。このアプローチの限界は、(1)個々の線虫を経時的に追跡して、関心のある表現型の年齢軌跡を開発することができないこと、および(2)培養環境のコンテキストで蛍光バイオマーカーを直接監視できないことです。代替培養アプローチでは、液体培養またはマイクロフルイディクスを使用して、個々の動物を経時的にモニタリングし、場合によっては蛍光定量を含め、培養環境が固体NGMとは文脈的に異なるというトレードオフがあります。WorMotelは、固体NGM上で単離されたワームを培養するための前述の微細加工マルチウェルデバイスです。各ワームは、 C. elegansの接触忌避剤である硫酸銅で満たされた堀に囲まれた固体NGMを含むウェルに維持され、個々の動物の縦方向のモニタリングを可能にします。硫酸銅は、食事制限、病原菌、細胞ストレスを誘発する化学物質など、老化研究で一般的な嫌悪的な介入を受けた場合、ワームの逃げを防ぐには不十分であることがわかりました。マルチウェルデバイスもポリジメチルシロキサンから成形されているため、蛍光イメージングで高いバックグラウンドアーチファクトが発生します。このプロトコルは、もともとヒト白血球抗原(HLA)タイピング用に設計された市販のポリスチレンマイクロトレイを使用して、固形NGM上で単離された回虫を培養するための新しいアプローチを説明し、寿命全体にわたる生存、生理学的表現型、および蛍光の測定を可能にします。パルミチン酸バリアは、嫌悪条件が存在する場合でも、ワームが逃げるのを防ぎます。各プレートは最大96匹の動物を培養でき、食事制限、RNAi、化学添加物などのさまざまな条件に簡単に適応でき、寿命と活動データを収集するための自動システムと互換性があります。

概要

C. elegansは、実験室での培養が容易で、世代時間と寿命が短く、哺乳類と高度なタンパク質相同性を共有し、蛍光タンパク質や色素のin vivo可視化を可能にする透明な体構造を持っているため、遺伝学、細胞生物学、分子生物学の研究のための強力なモデル生物です1。発生生物学や老化を含むさまざまな分野で主要なモデルシステムとしてC.エレガンスが長年使用されてきた結果、その成長と発達はよく理解され、ゲノムは完全に配列決定され、ゲノムワイドRNAiフィードライブラリや数千の変異株やトランスジェニック株など、多くの強力な遺伝ツールが作成されています。歴史的に、C.エレガンスは固体寒天線虫増殖培地(NGM)上の集団として培養され、表現型は直接観察またはイメージングとダウンストリーム分析のいずれかによって手動で評価されています。蛍光顕微鏡は、個々のC.エレガンスの色素または遺伝子組み換え発現蛍光タグを使用して、さまざまな分子表現型をキャプチャするために使用されます。蛍光イメージングは通常、薄いアガロースパッドを含むスライド上で動物を固定または麻痺させることを含み、これは侵襲的であり、しばしば致命的です。また、レバミゾールやアジ化ナトリウムなどの化学物質の使用も含まれており、目的の分子プロセスを妨害する可能性があります2,3。これらのアプローチを組み合わせることで、広範囲の表現型にわたって横断的な集団レベルのデータを収集できますが、個々の動物を経時的に追跡することはできません。

近年、単離されたC.エレガンスを培養するためのいくつかのアプローチが登場し、研究者は新しいイメージング技術を利用して動物の生理学的および分子表現型の動的な変化を経時的に捉えることができます。C.エレガンス培養アプローチの1つのカテゴリは、WormFarm4、Nemalifeチップ5、およびChronisらによる「挙動」チップ6を含むマイクロ流体デバイスであり、とりわけ様々なもの7,8,9である。これらに関連する液体ベースの培養法は、マルチウェルプレートを使用して個々のワームまたは小さな集団を経時的に特徴付けます10,11。マイクロフルイディクスとマイクロプレートシステムは、C.エレガンスから1匹までの表現型応答の優れた定量的測定を提供しますが、培養環境には重要な制限があります。 C. elegansの過去の研究の大部分は、特に老化の分野で、固体寒天ベースの培地で完了しています。液体培養は、C.エレガンスを連続的に泳がせ、基礎となる生物学を変える可能性のある明確な環境状況を表しています。例えば、液体培地で培養された動物は、寒天ベースの固体NGM12,13で培養された動物と比較して、脂肪含有量と遺伝子発現(特にストレス応答に関与する遺伝子)が大幅に変化しました。単一動物イメージング法の代替カテゴリには、ペトリプレート上のグループ培養で固体NGMで培養されたワームが経験する標準的な環境をより厳密に模倣するために、固体培地上で個々の動物を分離するポリジメチルシロキサン(PDMS)デバイスが含まれます。WorMotelは、固体培地上で個々の動物を培養するために設計された240ウェルPDMS装置です。各ウェルは、寒天の代わりに低融点アガロースを使用した修飾NGMで満たされ、バクテリアフードが播種され、ペトリプレートを使用した最も一般的な培養システムと同様の固体培地環境が作成されます。ウェルの壁は丸いため、ウェル内の場所に関係なく各動物を画像化できます(マルチウェルプレートの壁の近くに動物によって引き起こされる視覚的な不明瞭さを回避します)。各ウェルを囲む狭い堀の硫酸銅は、動物をウェルに留めておくための抑止力として使用されます14,15。このアプローチの限界は、硫酸銅は、食事制限、病原菌、または細胞ストレスを誘発する化学物質(パラコートなど)を含む嫌悪的な環境条件が存在する場合に、ワームが逃げるのを防ぐのに効果がないことです。

固体培地を使用する2番目のシステムは、ヒドロゲルを使用してスライド上の各ワームの小さな密閉環境を作成し、個別に分離された動物の長期モニタリングを可能にするWorm Corralです16。主な制限は、動物を卵として環境に密封する必要があり、繁殖を防ぐために無菌動物を使用する必要があり、薬物治療を単一の用途に制限することです。複数回投与の薬物試験は、ワームをデバイスに移す前に複数回の曝露を実施するか、実験中にウェルに局所的に薬物を追加することによって、WorMotelで達成できます。しかしながら、後者の場合、既存のウェルに追加の薬物を添加した後の実際の曝露量は正確に定量することは困難であり、そして薬物がどれだけ急速に分解するかに依存する。WorMotelとWorm Corralはどちらも、活動や動物の生理学(成長や発達など)に関連する情報をキャプチャするための明視野または暗視野イメージングに最適です。これらのシステムは蛍光のモニタリングに使用できますが、私たちの経験では、他のシングルワームイメージング技術の作成に使用されるPDMSは、マイクロバブルを形成したり、粒子を捕捉したり、不規則な蛍光アーチファクトを生成したりするその他の小さな異常が発生しやすく、特に C.elegans 研究で使用される最も一般的な蛍光色素であるGFPの発光範囲で、一貫した蛍光の視覚化と定量を妨げます。今日まで、縦方向の 様式でのC.エレガンス 個々の動物のライブ蛍光イメージングは、主にマイクロ流体デバイス17に依存している。

ここでは、嫌悪的介入と直接蛍光イメージングの両方に適合する固体培地上で個々のC.elegansを培養するための新しい方法について説明します。このアプローチは、カスタム成形されたPDMSチップが、マイクロ細胞毒性アッセイ用に開発された市販のポリスチレンマイクロトレイ(一般にテラサキトレイとも呼ばれる)に置き換えられることを除いて、他のシングルワームイメージング技術と概念が似ています18。これらのマイクロトレイは、固体培地を充填し、細菌性食品を播種できるウェルを備えており、標準的な固体NGM培養方法論の下で動物が経験する環境を厳密に模倣しています。各ウェルは、硫酸銅ではなくパルミチン酸の嫌悪バリアに囲まれています。パルミチン酸は、食事制限や化学的ストレッサーへの曝露などの嫌悪的な環境でワームが挑戦される実験で、ペトリプレート上の標準的なグループ培養を使用して、ワームが固体培地から逃げるのを防ぐために一般的に使用されます。また、マイクロトレイは最小限の一貫した蛍光バックグラウンドを生成し、培養環境で直接動物の蛍光イメージングを可能にします。この新しい単一動物の固体寒天ベースの培養システムは、生涯を通じて個々の動物を追跡し、成長、発達、活動、および寿命を監視できるだけでなく、直接蛍光顕微鏡法とも互換性があります。麻痺や固定なしに線虫を画像化できるため、培養液上に残っている個々の動物においてin vivo蛍光バイオマーカーを縦方向に定量することができ、各動物の生涯にわたる動的変化を観察することができます。この培養システムは、寿命およびその他の健康指標を追跡するための現世代の自動化システムとも互換性がある14,19。このマイクロトレイベースのシステムで個々のC.エレガンスを培養するための詳細なプロトコルを提供し、潜在的な落とし穴とトラブルシューティングについて説明し、他のシステム、特に更新および最適化されたWorMotelプロトコル15と比較した利点と制限について説明します。

各シングルワーム培養環境は、カスタム3Dプリントアダプターを使用して標準のシングルウェルトレイ内に取り付けられたマイクロトレイで構成されています(図1A)。ウェルは低融点アガロース線虫増殖培地(lmNGM)で満たされ、食物源として濃縮細菌が播種され、ワームが逃げるのを防ぐためにパルミチン酸コーティングで囲まれています(図1B)。マイクロトレイとシングルウェルプレートの壁の間のスペースは、湿度を維持するために飽和水結晶で満たされています(図1B)。結露を防ぐために、トレイの蓋には洗剤コーティングが施されています。各ウェルに1つのワームを追加し、1つのウェルトレイをパラフィルムで密封して水分を維持し、酸素交換を可能にします。最大6つのマイクロトレイは、1人の実践的な研究者によって合理的に並行して準備することができます。

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プロトコル

1. レシピ

注意: マイクロトレイプレートの準備を開始する前に、ストック溶液を準備してください。

  1. 低融点アガロース線虫増殖培地(lmNGM)用のストックソリューション
    1. 1 Lボトル中の1 Lの滅菌脱イオン水に174.18 gのK 2 HPO4を溶解することにより、1 M K2HPO4を調製します。溶液を121°C、15psiで30分間オートクレーブし、室温(RT)で保存します。
    2. 1 Lボトル内の1 Lの滅菌脱イオン水に136.09 gのKH2HPO4を溶解することにより、1 M KPi(pH 6.0)を調製します。溶液を1 M K2HPO4で滴定して、pH 6.0を達成します。溶液を121°C、15psigで30分間オートクレーブし、RTで保存します。
    3. 73.5 gのCaCl2を500 mLの滅菌脱イオン水に500 mLのボトルに溶解することにより、1 M CaCl2を調製します。溶液を121°C、15 psigで30分間オートクレーブし、RTで保存します。
    4. 123.25 gのMgSO 4を500 mLの滅菌脱イオン水に500 mLのボトルに溶解して、1 M MgSO4を調製します。溶液を121°C、15psigで30分間オートクレーブし、RTで保存します。
    5. lmNGM用の3 M NaClを調製する:清潔な100 mLボトルに、100 mLの超純水と18.20 gのNaClを混ぜ合わせます。オートクレーブを 121 °C、15 psig、30 分間処理します。
    6. 500 mLの琥珀色のボトルに2.5 gのコレステロール、275 mLの100%エタノール、および25 mLの滅菌脱イオン水を組み合わせて、5 mg / mLのコレステロールを準備します。溶液を121°C、15psigで30分間オートクレーブし、RTで保存します。
    7. 0.1231 gのFUdRを15 mLのコニカルチューブ内の10 mLの滅菌脱イオン水に溶解することにより、50 mMフルオロデオキシウリジン(FUdR)を調製します。10 mLシリンジと0.22 μmフィルターを使用して溶液を滅菌します。1 mLの溶液をそれぞれ10本の微量遠心チューブに分注し、-20°Cで保存します。
    8. 500 mgのカルベニシリンを15 mLのコニカルチューブ内の10 mLの滅菌脱イオン水に溶解して、50 mg / mLのカルベニシリンを調製します。10 mLシリンジと0.22 μmフィルターを使用して溶液を滅菌します。1 mLの溶液をそれぞれ10本の微量遠心チューブに分注し、-20°Cで保存します。
    9. 15 mLのコニカルチューブ内の10 mLの滅菌脱イオン水に2.38 gのIPTGを溶解することにより、1 mMイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド(IPTG)を調製します。10 mLシリンジと0.22 μmフィルターを使用して溶液を滅菌します。1 mLの溶液をそれぞれ10本の微量遠心チューブに分注し、-20°Cで保存します。
    10. 15 mLのコニカルチューブ内の10 mLの滅菌脱イオン水に1 gのアンピシリンを溶解して、100 mg / mLのアンピシリンを調製します。10 mLシリンジと0.22 μmフィルターを使用して溶液を滅菌します。100 mg/mLのアンピシリン溶液1 mLを10本の微量遠心チューブに分注し、チューブを-20°Cで保管します。
  2. 一般的な C.エレガンス 維持のための線虫増殖培地(NGM)の調製
    1. 50枚のプレートを作るには、1Lフラスコ内の486mLの超純水にバクト寒天培地10g、NaCl1.5g、バクトペプトン1.25gを溶解します。培地を121°C、15 psigの液体サイクルで少なくとも30分間オートクレーブ滅菌します。
    2. オートクレーブ後、培地を55°Cまで冷却します。 次に、1 M KP i12.5 mL、1 M MgSO4 500 μL、1 M CaCl2 500 μL、および5 mg/mLコレステロール500 μLを溶液に加えます。
    3. 滅菌技術を使用して、ステップ1.2.2で調製した培地10 mLを各60 mmプレート(合計50)に注ぎます。プレートを培地と一緒に少なくとも30分間放置して固化させます。一晩増殖させた細菌培養物300 μLをプレートの中央にピペットで入れ、プレートをベンチに置いておきます。培養物を乾燥させ、1〜2日間厚くします。これらのNGMプレートを細菌と一緒に4°Cで保存します。
  3. lmNGMプレミックスの調製
    1. 250 mLの三角フラスコに、2 gの低融点アガロース、0.25 gのペプトン、1 mLの3 M NaCl、および99 mLの超純水を混ぜ合わせます。溶液を121°C、15psig、30分間オートクレーブします。
    2. 10 mLのlmNGMを試験管に分注し、パラフィルムで覆い、液体の損失を防ぎます。チューブに蓋をして、冷却して固化させます。
  4. 細菌性食品用に85 mM NaClを調製する:100 mLボトルに515.61 mgのNaClを混ぜ合わせ、最大100 mLの超純水を充填します。オートクレーブを 121 °C、15 psig、30 分間処理します。
  5. オートクレーブ可能なスクイーズボトル内の超純水150mLにタイプS高吸水性樹脂1gを溶解して吸水性ポリアクリルアミド結晶を調製する。適切なディスペンスサイズを確保するためにチップをカットします。オートクレーブを121°C、15psig、30分間、錫箔でキャップし、振とうして結晶を混合した。
  6. 15 mLのコニカルバイアルに3 mLの100%Tween-20と7 mLの超純水を組み合わせて、洗剤溶液を調製します。
  7. 500 mLボトルに2.5 gのコレステロール、275 mLの100%EtOH、25 mLの超純水を組み合わせて、5 mg/mLのコレステロールを調製します。
  8. パルミチン酸作業溶液を調製する
    1. 乳鉢と乳棒で500 mgの固体パルミチン酸を粉砕し、50 mLの円錐形バイアルで15 mLのTween-20と混ぜ合わせます。ボルテックスで混合し、できるだけ多くの結晶を溶解します。
    2. 17.5 mLの100%エタノールを加え、溶液をボルテックスしてできるだけ多くのパルミチン酸を溶解します。
    3. 17.5mLの超純水を加え、厳密にボルテックスします。パルミチン酸が完全に溶解するまで、80°Cのビーズバスで溶液を穏やかに加熱します。一部のパルミチン酸は、冷却中に沈殿することがあります。
  9. 1L以上のビーカーで1Lの脱イオン水に20gのLB粉末を混合して、溶解性培養液(LB)を調製します。500 mLのブロスを2つの500 mLビーカーに分注します。ブロスを121°C、15psig、30分間オートクレーブします。準備したブロスをRTに保管してください。
  10. リソゲンブロス(LB)寒天プレートの調製
    1. LB粉末10 gとバクト寒天培地7.5 gを1 Lフラスコ内の脱イオン水500 μLに混合します。溶液を121°C、15 psig、30分間の液体サイクルでオートクレーブします。
    2. 必要に応じて、オートクレーブ処理した培地を55°Cに冷却した後、オプションの抗生物質(100 μg/mLアンピシリン500 μL)を追加します。 滅菌技術を使用して、各100 mmプレート(合計25)に20 mLの培地を注ぎ、LB寒天プレートを作成します。プレートは4°Cで保管してください。

2.年齢同期ワームの集団の準備

  1. 幼虫ステージ4(L4)でマイクロトレイに追加する準備ができている年齢同期ワームの集団を準備します。あるいは、任意のライフステージのワームを追加することができます(発生停止を防ぐために、L4よりも早い発生段階でワームを追加する場合は、FUdRをマイクロトレイメディアから除外する必要があります)。
    注:実験開始時のターゲットライフステージがL4の場合、この手順はマイクロトレイにワームを追加する2日前に完了する必要があります。同期のタイミングは、ワームが目的のライフステージに到達できるように調整できます。
  2. 温度は寿命に影響を与える可能性があります。一貫した結果を得るには、標準のNGMプレート(セクション1を参照)を使用して C.エレガンスを 20°Cに維持し、バクテリアフードが不足している場合はワームを新しいプレートに移します。
  3. 多くの若年成虫のストックプレートから、標準的なアプローチを使用して、年齢同期した集団を生成し、最も一般的には20 または時限産卵21を生成します。
  4. 卵を分離し、細菌斑点のあるNGMプレートに追加します。野生型の C.エレガンスを使用する場合、卵は孵化してワームを形成し、2日でL4幼虫期に達します。

3.細菌培養の準備

  1. 実験開始の前日に、所望の細菌性食物源を接種する。プレートあたり~5 mLの細菌培養を準備します。
    注:細菌の縞は、1か月前までに調製し、 大腸菌 の食料源用に4°Cで保存できます。
    1. 凍結グリセロールストックからLB寒天プレート上に単一コロニー用の細菌をストリークする。
    2. 培養物を37°Cで一晩増殖させる。
    3. 液体LBブロスに接種ごとに単一のコロニーを接種する。
    4. ~250rpm、37°Cで12〜16時間振とうします。

4.マイクロトレイにパルミチン酸コーティングを施す

注:パルミチン酸は、個々の井戸から動物が逃げるのを防ぐための嫌悪バリアとして機能します。コーティングは、ウェルの内面を除いて、マイクロトレイの底面全体に塗布される。ナイスタチンは、真菌汚染を軽減するためにパルミチン酸に添加される。このステップは、必要に応じて実験開始の1日前に完了することができます。

  1. ビーズバスを80°Cに設定して、予熱する時間を確保します。
  2. 使用直前に、マイクロトレイあたり1 mLのパルミチン酸作業溶液を別の滅菌容器(通常は15 mLのコニカルバイアル)に分注し、加熱前にパルミチン酸溶液1 mLあたり4 μLの10,000ユニット/ mLナイスタチンを追加します。.
  3. マイクロトレイの内側と外側にエタノール(70%以上)を飽和状態になるまでスプレーし、余分なエタノールを振り落とします。
    注:残留エタノールは、UV架橋での処理中に蒸発する必要があります(ステップ4.4)。
  4. UV架橋剤を使用してマイクロトレイを滅菌します(以下の指示は、この研究で使用されるUV架橋剤用です)。
    1. マイクロトレイと蓋をUV架橋剤に別々に配置します(つまり、UVはプラスチックに浸透しないため、プレートに蓋を置かないでください)。
    2. ドアを閉め、UV架橋剤をオンにします。
    3. [時間] を押し、20 分と入力して、[開始] を押します。
    4. 20分後、プレートと蓋を裏返し、手順4.2.2〜4.2.3を繰り返します。
    5. 手袋を着用した状態で、滅菌後の汚染を防ぐためにマイクロトレイに蓋をしてください。
  5. パルミチン酸作業溶液をボルテックスと反転によって完全に混合します。
  6. パルミチン酸作業溶液を入れた15 mLのコニカルバイアルをビーズバスに入れ、目に見える結晶を完全に溶解させてから使用してください。
  7. 蓋をした状態でビーズバスを囲む棚にマイクロトレイを置き、~2分間ウォームアップします。
  8. マイクロトレイの蓋を取り外します。マイクロトレイの後壁(長辺)に200 μLのパルミチン酸作動溶液をゆっくりと加えます。蓋を元に戻し、マイクロトレイをビーズバスに2〜3分間置いて、パルミチン酸溶液がマイクロトレイの底部に沈殿するようにします。
    注意: マイクロトレイの底部全体がステップ4.10まで完全にコーティングされることはありませんが、溶液は底面の半分以上に均等に広がる必要があります。パルミチン酸溶液が均一に広がっていない場合は、マイクロトレイの近くにある渦または振動モーターをオンにします。これにより、パルミチン酸溶液がより簡単に広がるのに役立つ少量の振動が提供されます。汚染を軽減するために、マイクロトレイの蓋を所定の位置に保ちます。
  9. 手順 4.8 を繰り返します。
    注意: マイクロトレイの底の約半分以上は、液体パルミチン酸で目に見えて覆われている必要があります。
  10. マイクロトレイを180°回転させ、トレイの反対側で手順4.8と4.9を繰り返します。
    注意: テラサキトレイの底は、合計ボリューム全体を両側に追加した後にのみ、パルミチン酸溶液の薄層で覆われます(手順4.9および4.10)。多かれ少なかれパルミチン酸混合物は、混合物の調製、温度、および他の要因に応じて必要とされるかもしれない。一般に、400〜800μLのパルミチン酸混合物は、マイクロトレイの底部全体をコーティングするのに十分であろう。マイクロトレイの底部が目に見えて覆われたらすぐに、ウェルを汚染する可能性があるため、パルミチン酸を追加しないでください。
  11. トレイを滅菌乾燥ボックスまたは層流フードで少なくとも1時間乾燥させます。または、プレートをロードする前日にこのステップを完了し(セクション5)、蓋をした状態でマイクロトレイをRTで少なくとも16時間乾燥させます。

5.マイクロトレイに低メルト線虫増殖培地(lmNGM)をロードします

注:この方法では、通常の寒天の代わりに低メルトアガロースと混合した標準NGMを使用します。寒天は45°Cでゲル化し始めることができます。 マイクロトレイウェルの充填に必要な少量で作業する場合、寒天ベースのNGMは、急速なゲル化によりピペットチップを詰まらせたり、ウェル表面が不均一になったりすることがよくあります。低融点アガロースを使用したNGMは、~28°Cでゲル化を開始するため、溶融媒体を簡単にピペットで移動でき、一貫して平坦なウェル表面を形成します。ワームをマイクロトレイに配置するのと同じ日にlmNGMを準備します。lmNGMでマイクロトレイを準備し、細菌を播種し、 C.エレガンス をすべて同じ日にロードする場合は、この一連の手順を開始する前に、動物が希望の年齢またはそれに近い年齢であることを確認してください。

  1. ピペット洗面器を80°Cのビーズバスに入れて温めます。
  2. 調製するマイクロトレイごとに1つの10 mL lmNGMプレ混合物を電子レンジで1つ(ステップ1.1)~30-45秒間溶かします。
    1. lmNGMプレミックス試験管を200 mLビーカーに入れ、転倒しないように蓋をします。
    2. ~10-15秒後、またはlmNGMプレ混合物が泡立ち始めたら、電子レンジを一時停止し、lmNGMプレ混合物を滅菌済みの200 mLビーカーに注ぎ、電子レンジを再開します。
    3. 沸騰しないように必要に応じて一時停止し、渦巻いて混ぜます。
    4. すべてのlmNGMがチャンクのない液体に変わったら、電子レンジを停止します。
      注:合計192ウェル(2つのマイクロトレイ)を満たすには、10 mLのアリコート1つで十分です。
  3. 以下の成分を温かい低融点アガロースにリストされた順序で添加してlmNGMを調製します(容量は低融解アガロース10 mLあたりです):25 mM KPi(pH 6)250 μL、1 M CaCl2 10 μL、1 M MgSO4 10 μL、および5 mg/mLコレステロール10 μL
    1. 研究者が成体動物を経時的に検査する予定があり、繁殖を防ぐ必要がある場合は、50 mM FUdRを10 μL追加します。
    2. 一般的なHT115 RNAi 大腸菌 株および関連するRNAiプラスミドを用いてRNAiフィーディング実験を行う場合は、50 mg/mLのカルベニシリン(RNAiプラスミドを選択するため)を5 μL、1 mM IPTG(RNAiプラスミドから二本鎖RNAの発現を誘導するため)を12 μL添加します。
      注:目的の食料源に必要な選択的抗生物質やその他の化学物質に応じて、追加の添加物を含めることができます。この段階で、薬物または化学的ストレッサーもlmNGMに追加できます。NGMとlmNGMは、同じ最終濃度のNaClを含んでいますが、NaClが培地に添加される方法が異なります。NGMの場合、培地調製中にすべてのNaClが追加されます(ステップ1.2)。lmNGMの場合、NaClの一部は培地調製中(ステップ5.3)および一部は細菌性食品中(セクション6)に添加される。この変更の理由は、各マイクロトレイウェルのメディア容量が小さいためです。LBに懸濁した5 μLの濃縮細菌を20 μLの培地を含むウェルに加えると、培地の栄養組成が大幅に変化します(LBの成分を同等の容量で添加することにより)。これを避けるために、細菌をNaClの溶液に再懸濁して、細菌への浸透圧ストレスを防ぎながらLB成分を除去します。培地に添加されたNaClは、細菌に添加された塩を説明するためにそれに応じて減少する。
  4. 温めたピペット洗面器にlmNGMを注ぎます。
  5. マイクロトレイをベンチトップに置き、20 μLのlmNGMを各マイクロトレイにピペットで入れます。汚染を最小限に抑えるために、ピペットを補充するときはマイクロトレイを覆います。
    注意: この手順は、電動リピートピペットを使用すると簡単です。

6.マイクロトレイウェルにバクテリアフードを播種する

注:一晩接種された培養物からの5μLの10倍濃縮食品は、その寿命全体にわたって単一の C.エレガンス を養うのに十分です。

  1. 細菌を一晩培養から50 mLのコニカルバイアルに移します。
  2. ~3,500 x g で20分間遠心分離します。
  3. 上清を取り除きます。細菌培養物を10倍の濃度(元の培養物の1/10容量)で85 mM NaCl溶液で再懸濁します。
  4. ウェルにバクテリアを加える前に、マイクロトレイを目視検査して、固体lmNGMが各ウェル内に完全に含まれていることを確認します。ウェルの側面からlmNGMがぶら下がっている場合は、ピペットチップで余分なlmNGMをこすり落とします。この過剰な培地は、クリアしないと食品がパルミチン酸に流れ込む原因となる可能性があります。
  5. 5 μLの10倍濃縮細菌培養物を各ウェルのlmNGMの表面に慎重にピペットで貼り付けます。バクテリア培養物が井戸の側面を越えてパルミチン酸に流れ込むのを許さないようにしてください、これはワームを引き付けて井戸を離れます。
  6. マイクロトレイを滅菌乾燥ボックスまたは層流フードで~35分間乾燥させます。~5分ごとにチェックし、過度に乾燥させないように注意してください。線虫が添加されている間、ウェルはさらに乾燥するため、いくつかのウェルが目に見えてわずかに濡れているときに取り外します。

7. 各マイクロトレイをシングルウェルプレート内に封入

注:このセクションでは、マイクロトレイは、カスタム3Dプリントインサートを使用して標準のシングルウェルプレート内に取り付けられ、吸水性結晶で囲まれています。次に、シングルウェルプレートを閉じ、パラフィルムで密封します。これにより、汚染を防ぎ、数週間の実験の過程でlmNGMが乾燥するのを防ぐために十分な湿度を維持しながら、酸素交換が可能になります(寿命を延ばす突然変異や環境条件を調べる場合、ワームの寿命実験は6〜8週間続く可能性があります)。準備中は、細菌や真菌の汚染を最小限に抑えるために、何かが積極的に追加されていないときはいつでもプレートを覆うようにしてください。

  1. シングルウェルプレートと3Dプリントされたアダプターと蓋を、それぞれ10%漂白剤溶液に浸して滅菌します。滅菌DI水で十分にすすいでください。タスクワイプで拭いて乾かします。
  2. シングルウェルプレートと3Dプリントアダプター、および蓋に70%以上のエタノール溶液をスプレーし、タスクワイプできれいに拭きます。残留エタノールを風乾させます。
    注:UV放射は、上記のステップ4.4で説明したように、マイクロトレイと同じパラメーターで漂白剤とエタノールの後に使用することもできます。
  3. 滅菌3Dプリントインサートを滅菌シングルウェルプレートに入れます。
  4. 準備したマイクロトレイの外側に70%エタノールをスプレーして滅菌します。
  5. マイクロトレイをシングルウェルプレートの3Dプリントアダプターに入れます。
  6. マイクロトレイの蓋は廃棄します。
  7. マイクロトレイの外壁とシングルウェルプレートの内壁の間の3Dプリントインサートの上に水晶を自由に分配します。
  8. すぐにワームを追加するか(セクション8)、翌日使用するマイクロトレイを密封します。トレイの蓋を閉め、1枚のパラフィルムを使用して4つの側面すべてを包み、マイクロトレイを密封します。パラフィルムでシールステップをさらに2回繰り返し、合計3層にします。
  9. マイクロトレイを密封した後、ワームを追加する前に、RTのベンチに最大4日間置いておきます(セクション8)。

8.マイクロトレイへのワームの追加

注:プラチナピックを使用して年齢同期ワーム集団(セクション2)から動物を移すことにより、各ウェルに1つのワームを手動で追加できます。希望するライフステージでのみ動物を移してください。移送プロセスに1時間以上かかる場合、マイクロトレイウェル内のlmNGMは乾燥する可能性があります。一度に10〜20匹のワームのグループを移すと、このステップを早めることができますが、ウェルごとに1匹の動物だけを一貫して放流するには、ある程度の練習が必要です。

  1. 目的のライフステージに達したら、ウェルごとに1つの線虫を追加します。
  2. ソースプレートからワームをピッキングするときは、汚染を最小限に抑えるために、蓋をマイクロトレイに戻します。

9.長期使用のための培養環境の準備を終える

注意: 以下の手順は、マイクロトレイ内のメディアとワームが実験期間中ハイドレートされたままであることを確認するために実行されます。

  1. シングルウェルプレートの蓋に~40 μLの洗剤溶液を加え、タスクワイプを使用して蓋を均一にコーティングします。このコーティングは、プレートが密封された後の時間の経過に伴う結露を防ぎます。追加のタスクワイプを使用して、蓋からの視界が歪まなくなるまで洗剤溶液を広げます(これには通常、約2回のタスクワイプが必要です)。
  2. 水の結晶を調べて、マイクロトレイの上端と同じ高さで、オーバーフローしていないことを確認します。必要に応じて、プレートに水の結晶を追加または削除します。
  3. 次のアプローチを使用して、トレイをパラフィルム(合計3個)で包み、パラフィルムシールが長期間続くようにします。
    1. パラフィルムの最初の部分を少し伸ばして、トレイの両側を覆います。
    2. パラフィルムの2番目の部分を少し伸ばし、トレイの残りの側面を覆います。
    3. パラフィルムの最後の部分を伸ばし、トレイの4つの側面すべてを完全に包み、パラフィルムの最初と2番目の部分を覆います。適切に密封されたマイクロトレイは、~2ヶ月間水分補給されたままにすることができます。
      注:実験中は1〜2週間ごとにパラフィルムの完全性を監視し、必要に応じて交換します。
    4. トレイの上部をタスクワイプで拭き、70%エタノールで湿らせて指紋を取り除きます。
  4. テープを使用してシングルウェルプレートにラベルを付けます。これで、マイクロトレイは、ワームを経時的に監視するためのイメージングと長期保存の準備が整いました。イメージングセッションの合間に、トレイを20°Cに保ちます。 マイクロトレイは、薬物投与やその他の手順のために複数回開いて再シールすることができますが、汚染や水分の損失を防ぐために最小限に抑える必要があります。

10.マイクロトレイウェル内の個々のワームのイメージング

注:このプロトコルの目的は、マイクロトレイ培養環境の準備方法の詳細な説明を提供することです。マイクロトレイシングルワーム培養環境は、一旦調製され、一旦、ペトリプレート上での標準的な培養用に確立された技術を用いて、多くの表現型を縦断的にモニタリングするために使用することができる。次のセクションでは、いくつかの一般的な表現型を測定するための基本的な手順について説明します。蛍光イメージングは正立顕微鏡で行う必要があります。テラサキトレイを通る光の屈折は、暗い部屋で最小限に抑えられます。

  1. 寿命:プレートの側面または上部を軽くたたくか、プレートに明るい青色の光を当てて各動物を観察して、寿命を測定します。動物が数秒以内に動かない場合は、動物を「死んでいる」とスコアを付けます。すべてのワームが死ぬまで、1〜3日ごとにこの作業を繰り返します。
    注:マイクロトレイ培養環境は、寿命推定のための画像収集と分析を自動化するシステムと互換性があります14,19。
  2. 標準顕微鏡:高解像度カメラまたはスキャナーを使用して、個々のウェルまたはトレイ全体で明視野(または暗視野)イメージングを実行します。この画像データは、動物サイズ22、23、24、発達25、活動14、19、および寿命を含む様々な表現型に使用することができる。
  3. 蛍光顕微鏡:手動または電動プラットフォームシステムを使用して、単一のウェルで蛍光イメージングを実行します。シングルウェルトレイは、標準のマルチウェルプレートアダプターと互換性があります。装置を黒壁の箱に入れると、信号対雑音比が最小限に抑えられます。
    注:ワームは自由にクロールしながらイメージングされるため、この培養システムは、全身の蛍光や蛍光色素の粗い組織局在を捉えるための低解像度イメージングに適しています。高解像度および高倍率のイメージングでは、通常、動きを防ぐために動物を固定する必要があります。麻痺剤(アジ化ナトリウムやレバミゾールなど)を各ウェルに局所的に塗布し、高解像度のイメージングを進めることは可能でなければなりませんが、これにより、後の時点で同じワームを繰り返し測定できなくなります。培養系は、記載されたように、倒立されることを意図しておらず、これは倒立顕微鏡系の使用を妨げる。
    1. 明視野が寿命の測定に利用されておらず、蛍光のみがキャプチャされている場合は、寿命を手動で測定します。ワームに青い光(GFP励起に使用)を5秒間放置すると、動物が動くようになります。動物が5秒以内に動かなかった場合は、動物が死んだと見なします。

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結果

ここで説明するマイクロトレイベースのシングルワーム培養環境は、寿命と健康寿命、活動と動き、体型とクロール形状、個々の動物におけるトランスジェニック発現蛍光バイオマーカーの発現など、さまざまな表現型を経時的に監視するために使用できます。マイクロトレイ培養システムは、手動スコアリングまたは画像収集およびダウンストリームイメージング分析のいずれかによる寿命分析と互換性があります。ペトリプレート21上の標準的な培養と同様に、ワームは、刺激(例えば、プレートを叩くか、または青色光への曝露)に続く動きに基づいて、死んでいるか生きているかを手動でスコアリングすることができる。画像ベースの寿命分析では、刺激が適用された後に撮影された画像間のフレーム間の違いの比較を使用して、各ワームがいつ動きを停止するかを決定します。これは、自動画像収集および分析システムと互換性があり、各時点での個々の動物の活動レベルの形で追加データを提供します。この情報は、寿命(運動の停止)だけでなく、健康寿命(活動の低下の閾値、複数の定義が提案されている)を推定するためにも使用できます。これらの画像から、追加のパラメータ(体のサイズ、...

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ディスカッション

ここでは、もともとヒト白血球抗原組織タイピングアッセイ用に開発されたマイクロトレイを適応させ、C.エレガンス研究の標準である寒天ベースのNGMと文脈的に類似した固体培地環境で、単一のC.エレガンスの分離と特性評価を経時的に可能にする新しい培養システムについて説明します。このシステムは、食事制限、外因性薬物治療、化学的または環境的ストレッサーへの挑戦、RNAiなど、さまざまな介入と互換性があります。さらに、個々の動物におけるin vivoでの蛍光バイオマーカーの縦断的モニタリングを可能にします。集団内の個々の動物を追跡する能力により、行動、病因、ストレスの多い状態への反応、健康状態の低下など、明確な時間的要素を持つ表現型について、集団内の個体内変動性を評価できます。また、集団内で異なる幼少期の特徴を、寿命や健康などの晩年期の結果と結びつけることができます。他のシングルワームイメージング技術と同様に、このマイクロトレイベースの培養システムは、ワームが液体環境で培養されるときに発生するストレス応答経路の活性化などの潜在的な交絡因子を回避しながら、個々の動物を生涯を通じて複数の時点で監視する...

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開示事項

著者らは、開示すべき利益相反はないと述べています。

謝辞

この研究は、NIH R35GM133588からGLS、NIHT32GM008659トレーニング助成金、GLSへの米国医学アカデミー触媒賞、およびアリゾナ州理事会が管理するアリゾナ州技術研究イニシアチブ基金によってサポートされました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
3Dプリントテラサキインサートカスタム印刷会社Robot_Terasaki_tray_insert_10-20
-2021.STL		FDM印刷、ノズルサイズ0.6 mm、標準PLAプラスフィラメントを使用
AirCleanシステムAC624LF垂直層流ヒュームフードフィッシャーサイエンティフィック36-100-4376
バクトペプトンサーモサイエンティフィック211677
CaCl2Acros organics349615000
Caenorhabditis elegans N2Caenorhabditis Genetics Center (CGC)N2野生型株
カルベニシリンGoldbioC-103-25
コレステロールICN Biomedicals Inc101380
Escherichia coli OP50 Caenorhabditis Genetics Center (CGC)OP50C. elegans
エタノールミリポアex0276-4
Fisher Vortex Genie 2Fisher ScientificG-560
FUdR Research Products InternationalF10705-1.0
ハイドレーティングウォータークリスタル M2 Polymer TechnologiesType SType S 高吸水性ポリマー
Isopropyl ß-D-1-チオガラクトピラノシド (IPTG)GoldBioI2481C100
K2HPO4Fisher ChemicalP288-500
KimwipesKimTech34155Task
wipes LB Broth, LennoxBD Difco240230
ライカ K5 sCMOS モノクロカメラライカマイクロシステムズ11547112
ライカ M205 FCA 蛍光体顕微鏡ライカマイクロシステムズ10450826
低溶融アガロース研究製品 国際A20070-250.0
MgSO4 フィッシャーケミカルM-8900
NaClフィッシャーバイオ試薬BP358-1
Nunc OmniTray シングルウェルプレートサーモサイエンティフィック264728
ナイスタチンシグマN1538
パルミチン酸アクロス有機物129700010
ペーパータオルコーストワイドプロフェッショナル365374
パラフィルムMパラフィルム16-101
Stratagene UV Stratalinker 2400Stratagene400075UV 架橋機
寺崎トレー(ラムダ)ラムダ151431
1個 サーモリン Dri-bathサーモリンDB28125
Tween サーモサイエンティフィックJ20605-AP
のための標準的な実験室食品

参考文献

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