方法論記事

機能性破骨細胞のヒト末梢血CD14+ 単球との鑑別

DOI：

10.3791/64698

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2023年1月27日

 ,  ,  , 
1School of Infection & Immunity, University of Glasgow

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

破骨細胞は、体内の重要な骨吸収細胞です。このプロトコルは、ヒト末梢血単球からの破骨細胞の in vitro 分化のための信頼できる方法を記載しています。この方法は、恒常性や疾患における破骨細胞の生物学をさらに理解するための重要なツールとして使用できます。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

破骨細胞(OC)は、骨格の発達と成体の骨リモデリングにおいて極めて重要な役割を果たす骨吸収細胞です。いくつかの骨障害はOCの分化と活性化の増加によって引き起こされるため、この病態生物学の阻害は重要な治療原理です。骨髄系前駆体からのOCの分化を促進する2つの重要な要因:マクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)および核因子κBリガンドの受容体活性化因子(RANKL)。ヒト循環CD14+ 単球は、in vitroでOCに分化することが長い間知られています。ただし、曝露時間とRANKLの濃度は分化効率に影響します。実際、 インビトロ でヒトOCを生成するためのプロトコルが記載されているが、それらはしばしば貧弱で長い分化プロセスをもたらす。本明細書では、機能的に活性な成熟ヒトOCを適時に生成するための堅牢で標準化されたプロトコルが提供される。CD14+ 単球は、ヒト末梢血単核細胞(PBMC)から濃縮され、M-CSFでプライミングされてRANKをアップレギュレートします。その後のRANKLへの曝露は、線量および時間依存的にOCを生成する。OCは、酒石酸耐性ホスファターゼ(TRAP)による染色および光学顕微鏡分析によって同定および定量されます。核およびF-アクチンの免疫蛍光染色は、機能的に活性なOCを同定するために使用されます。さらに、OSCAR+CD14− 成熟OCは、フローサイトメトリーの細胞選別、およびミネラル(または象牙質/骨)吸収アッセイおよびアクチン環形成によって定量化されたOC機能性によってさらに濃縮されます。最後に、既知のOC阻害剤であるロテノンが成熟OCに使用され、アデノシン三リン酸(ATP)産生がアクチン環の完全性とOC機能に不可欠であることを実証しています。結論として、多数のOCを区別するための堅牢なアッセイがこの研究で確立され、アクチンリング染色およびATPアッセイと組み合わせて、OC機能を評価し、分化プロセスを調節できる新しい治療化合物をスクリーニングするための有用な in vitro モデルを提供します。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

破骨細胞(OC)は、造血系統の多核巨細胞であり、骨を吸収する独自の能力を備えています。彼らは骨格1,2の開発と継続的な改造を担当しています。発生の骨格段階では、OCおよび組織常在マクロファージは赤血球骨髄系前駆細胞に由来し、骨ニッチおよび臓器組織にコロニーを形成する。生理学的条件では、赤血球骨髄系前駆細胞は正常な骨の発達と歯の発疹に必要ですが、循環する血液単球の骨ニッチへの流入は、OC、骨量、および骨髄腔の出生後の維持を提供します3。病理学的条件下では、単球は活発な炎症部位に動員され、病理学的骨破壊に寄与し得る4,5。

いくつかの形態の関節炎の患者は関節の炎症を経験し、OC6によって引き起こされる進行性の関節破壊につながります。たとえば、関節リウマチ(RA)では、過剰に活性化されたOCが病理学的骨侵食と関節破壊の原因であり7,8、現在の治療法では骨の損傷を改善または停止しないことがよくあります9,10,11。集団分布とトランスクリプトームおよびエピジェネティックシグネチャの両方の観点から循環単球の変化がRA患者で報告されています12,13,14。さらに、炎症刺激に対する単球応答の変化が、活動性疾患のRA患者の破骨細胞形成に影響を与えることが報告されています15,16,17。

OCの分化は、骨髄系前駆細胞がOC前駆体への分化に関与することを含む複雑な多段階プロセスです。破骨細胞形成の間、OCは細胞間融合、不完全な細胞質分裂、および核分裂および融合と呼ばれる核リサイクルプロセスを通じて巨大で多核になります18,19,20。 in vitroでOCを区別する能力は、骨生物学の理解において大きな進歩を可能にしました21。OCは、マクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)および核因子κBリガンドの受容体活性化因子(RANKL)への曝露により、前駆体から分化します。後者は、炎症条件下でも、インビトロおよびインビボでのOCの正常な発達および機能に不可欠である6,22,23。RANKLは、骨芽細胞および骨細胞、ならびに炎症を起こしたRA滑膜2,24,25の活性化T細胞および線維芽細胞によって提示される。OC分化過程において、M-CSFに曝露された単球は、細胞膜上の核因子κB(RANK)発現の受容体活性化因子をアップレギュレートし、その後RANKLによる刺激下で、酒石酸耐性酸性ホスファターゼ(TRAP)陽性単核プレOCに分化し、次いで多核OCに分化する15,26。OCはいくつかの酵素を産生しますが、その主なものはTRAPであり、これは骨27内のリンタンパク質の分解を可能にします。OC分化の調節因子およびマーカーは、OC関連受容体(OSCAR)である。OC系統にコミットする前駆細胞の初期にアップレギュレーションされます28。成熟した巨大多核OCは、波立たせられた境界21、29、30を囲むアクチンリングからなる大きなシーリングゾーンを生成することによって骨格マトリックスを分解(吸収)することができる。OCの骨吸収能力は、細胞骨格の再編成とその結果としての分極および回旋膜の形成を必要とし、これはいわゆるフリル境界である。波立たせられた境界は、アクチンリングまたはシーリングゾーンであるF-アクチンリッチ構造の大きな円形バンドに囲まれています。アクチン環の完全性は、OCがin vitroおよびin vivoの両方で骨を吸収するために不可欠であり、波立たせられた境界形成の欠陥は、低空胞アデノシントリホスファターゼ(V-ATPase)発現に関連しています31,32,33。さらに、OCはミトコンドリアに富む細胞であり、アデノシン三リン酸(ATP)は、波立たせられた境界に局在するOCのミトコンドリア様構造と会合します31、32、33。ロテノンはミトコンドリア複合体Iの強力な阻害剤として作用し、ATP産生に影響を与えます。ロテノンはまた、OCの分化および機能を阻害することが示されている34。

このプロトコルは、ヒト末梢血サンプルからのin vitro破骨細胞形成の効率的かつ最適化された方法を記載しています。ヒト末梢血中では、CD14+単球がOC15,35,36の主な供給源です。このプロトコルでは、曝露の速度論とM-CSFおよびRANKLの濃度が最適な破骨細胞形成のために調整されています。単核球は、最初に密度勾配によって全血に存在する赤血球および顆粒球から分離されます。次に、磁気ビーズによるポジティブセレクションを使用してCD14+単球に濃縮されます。次に、単離されたCD14+単球をM-CSFとともに一晩インキュベートします。これにより、単球がRANK15,26の発現をアップレギュレートするようにプライミングされます。その後のRANKLの添加は、破骨細胞形成および多核形成を時間依存的に誘導する。活性吸収OCは、細胞膜30,32の縁部におけるF-アクチンリングの特徴的な分布およびTRAPに対する染色を示す。成熟OCは、TRAP+多核(3核以上)細胞を定量することによって分析されます。成熟OCの機能的能力は、それらの吸収、アクチン環の完全性、およびATP産生によって評価することができる。さらに、分化したCD14− OSCAR+ OCを濃縮し、ミネラル(または象牙質)吸収およびF-アクチン組織を介してOC機能に対する特定の化合物の影響を評価するために使用できます。さらに、この研究では、既知のOC阻害剤であるロテノンが、OCの機能に影響を与える化合物の例として使用されています。ロテノン下でのOC吸収活性の低下は、ATP産生の減少とアクチン環の断片化に関連しています。結論として、このプロトコルは、in vitroでのOC分化および機能のいくつかの生物学的側面を研究するための参照方法として使用できる堅牢なアッセイを確立します。

この方法論は、(1)循環単球が健康と疾患においてOCに分化する可能性、および(2)OCの分化と機能に対する治療候補の影響を評価するために使用できます。この堅牢な破骨細胞形成プロトコルにより、前駆細胞からのOC分化と成熟OCの機能の両方に対する骨標的療法の有効性とメカニズムの決定が可能になります。

プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

スコットランド国立輸血サービス(エジンバラ)から入手したバフィーコートとNHS血液移植(ニューカッスル)から入手した白血球円錐形は、完全に同意したNHS献血者から完全に匿名化された(識別できない)形式でグラスゴー大学の研究者に提供されます。バフィーコートと白血球コーンの血液成分は、スコットランドまたはイギリスのNHS献血センターで行われたNHS標準献血から製造されます。献血者は、承認された医学研究に使用される標準的なNHS臨床診療で使用されていない余剰血液について、献血時にインフォームドコンセントを与えます。NHS研究倫理委員会からの倫理的承認と、これらの献血を使用するための署名されたドナー同意書は、NHS献血サービスによって保持されます。承認された医学研究でこれらの同意された献血にアクセスして使用する承認が求められ、国立輸血サービス(スコットランド)およびNHS血液輸送(イングランド)の標準的な内部申請およびレビュープロセスを使用して取得されました。承認された医学研究に血液成分を使用するために、それ以上のNHS REC承認またはグラスゴー大学内部倫理委員会の承認は必要ありませんでした。

1. 開始前の一般的な注意事項

  1. すべての作業を慎重に血液で進めてください。サンプルに存在する可能性のあるさまざまな感染性病原体の潜在的な危険性を考慮してください。
  2. バイオセーフティ研究所では、手袋と白衣を着用しながら、無菌条件下ですべての作業を慎重に行ってください。
  3. 地域のガイドラインに従ってバイオセーフティー廃棄を実施してください。
  4. 地方自治体の規制に従って、サンプルを収集する前に適切な同意と倫理的承認を取得します。
  5. 一般に、1mLの新鮮な血液は100万PBMCを生成し、CD14 +単球はPBMCの約10%〜30%を占めます。比較すると、10 mLの白血球円錐には、5 x 10 8-15 x10 8 PBMCを含めることができます。PBMC 分離の詳細については、前のプロトコル37 を参照してください。

2.全血からの末梢血単核細胞(PBMC)の分離

  1. 健康なドナーから必要な量の新鮮な血液をリチウムヘパリン収集チューブに収集します。
    注:適切な抗凝固剤を含む他の収集チューブも使用できます(例:.、ヘパリンナトリウムチューブ)。細胞数が多い場合は、白血球コーンまたはバフィーコートを使用できます。
  2. PBMCを分離するには、血液を新しい50 mLチューブに移し、滅菌した1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で、新鮮な血液または白血球コーン/バフィーコート用にそれぞれ1:1または1:3の比率で希釈します。
  3. 反転によって細胞を数回穏やかに混合する。
  4. 3 mLの密度勾配培地を含む15 mLチューブを準備します。密度勾配培地の上部に8〜10 mLの希釈血液をゆっくりと重ね、ブレーキなしで室温(RT)で400 x g で30分間遠心分離します。
    注意: 混合を防ぐために、密度勾配媒体の上に血液を注意深く塗布します。混合すると、PBMC が失われる可能性があります。
  5. 最上層(血漿を含む)をパスツールピペットで慎重に廃棄し、PBMC(白色のリング状構造)を含む下層間層を収集し、この層を新しい50 mLチューブに移します。
  6. 滅菌した1x PBSで細胞を最大50 mLまで懸濁し、フルブレーキでRTで300 x g で10分間遠心分離して残留密度勾配培地を洗い流します。
  7. 残留血小板を除去するには、ブレーキなしでRTで10分間、200 x g でさらにゆっくりと回転させてこのプロセスを繰り返します。
  8. オプション:赤血球のキャリーオーバーを除去するには、赤血球溶解バッファー(10x、 材料表)を蒸留水で1:10に希釈し、希釈バッファー3 mLをペレットに塗布します。混合し、3分間インキュベートします。ペレットを最大50 mLの1x PBSで洗浄し、フルブレーキでRTで300 x g で10分間遠心分離します。
  9. 単離および精製されたPBMCを20 mLの1x PBSに再懸濁し、血球計算盤または他の標準的な方法に従ってカウントします。
    注:細胞希釈および細胞計数方法は、使用する細胞密度および計数装置に基づいて適宜調整する必要があります。

3. PBMC由来のCD14+ 単球の濃縮

  1. メーカーのプロトコル(材料表)に従って、ヒトCD14+選択キットを使用してPBMCからCD14+単球を分離します。
    注:古典的なCD14 + CD16− 単球は、OC前駆体35の主な供給源です。代替精製方法を検討することができる。
  2. 1 x 107 PBMCSを適切なポリスチレン丸底チューブ(つまり、選択キットマグネットに適合する)に移し、セルを300 x g で5分間ペレット化します。
  3. 上清を廃棄し、細胞ペレットを細胞分離バッファー(PBS、2%ウシ胎児血清[FBS]、1 mMエチレンジアミン四酢酸[EDTA])に最終濃度1 x 108 細胞/mLまで再懸濁し、蓋をした状態で100 μLあたり10 μLの抗体カクテルで10分間インキュベートします。
    注:細胞は1 x 108 細胞/ mLで再懸濁されます。それに応じて音量を調整します。
  4. インキュベーション後、100 μLあたり10 μLの磁性ナノ粒子ビーズを添加し、蓋をした状態で3分間インキュベートします。
    注:抗体カクテルと磁気ビーズの容量を調整して、10 μL/mLの濃度を取得します。
  5. 細胞分離バッファーで容量を2.5 mLに補充し、チューブを磁石(蓋なし)に入れ、3分間インキュベートします。負の細胞集団を、チューブがまだ磁石内にある間に反転によって1つの連続移動によって破棄します。
    注意: >2 x 108 PBMCとより大きな磁石を使用する場合は、製造元の指示に従って、細胞分離バッファーを最大5 mLまたは10 mLまで補充します。
  6. チューブを磁石から取り外し、磁気ビーズに付着した濃縮CD14+ 単球を2.5 mLの細胞分離バッファーに再懸濁して洗浄します。前と同じように磁石の中で3分間インキュベートし、負の画分を捨てて、もう一度繰り返します。
  7. 採取したすべての細胞を300 x g で5分間遠心分離し、上清を廃棄し、細胞を5 mLのアルファ最小必須培地(α-MEM; 資料表




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結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CD14+単球からのOC生成
この方法は、多数のOCをヒト末梢血CD14+ 単球からin vitroで、典型的には1週間 で容易に区別することを目的としていました。まず、以前に報告されたように、CD14+ 単球をPBMCから濃縮し、M-CSFで一晩プライミングしてRANKをアップレギュレートしました15。単球プライミング後、OCの分化と成熟に最適なRANKL濃度を決定するために、1 ng/mL、25 ng/mL、50 ng/mL、および100 ng / mLのRANKL濃度と25ng / mL M-CSFを使用しました。RANKLの添加により、用量依存的に大きなTRAP陽性多核OCの数が増加し、これをTRAP染色を用いて評価した。成熟OCは、複数の核(典型的には3つ以上;図 2A、B および 補足図1)。さらに、単球からのOC分化の動態を、2〜14日間の培養期間にわたってTRAP染色および光学顕微鏡を用いて調べた。この場合、50 ng/mLの中間濃度のRANKLを使用したOC分化を選択し、OCが培養中でどれだけ速く分化するかを評価しました。これらの培養条件では、5日目以降に多核OCが見られ、7日目には最適な分化に達しました(図2C)。プラスチック上での培養の10日を超える長期インキュベーションは、異常に巨大な融合細胞をもたらしました。このプロトコルでは、通常、6〜8日目がOC生成の最適なエンドポイントとして使用されます。OCは定量することも、ダウンストリームアッセイに使用することもできます。

差別化されたOCの機能評価
生成されたOCの機能活性を決定するために、鉱化表面上のOCを微分することによってそれらの吸収活性を調べました。大きなOCは7日間の培養期間の後にのみ生成され、ミネラル基質を再吸収するのに十分な時間を確保するために、培養は10日目まで維持されました。丸い穴、または吸収ピットの形成は、M-CSFとRANKLの両方で処理された細胞を含むウェルの石灰化表面でのみ観察されました(図3)。したがって、溶解した鉱化表面(吸収ピット)の割合は、OC吸収能力を決定することを可能にする。さらに、このプロトコルに従って7日目まで分化したOCは、プラスチックチャンバースライドとガラスチャンバースライドの両方で、免疫蛍光染色によって視覚化できるよく組織化されたアクチンリング構造を示しました(補足図2)。

成熟OC機能に対する阻害剤の効果
上記の培養条件は、公知のOC阻害剤であるロテノン34の存在下でin vitroで生成されたOCsの機能能力を決定するために利用された。OCは6〜8日間分化し、CD14−OSCAR+ OCおよびOC前駆体はフローサイトメトリーを介して濃縮されました(図4)。次に、濃縮細胞を破骨細胞形成促進培地(25 ng/mL M-CSFおよびRANKL)でミネラルコーティングした96ウェルプレートに1ウェルあたり50,000細胞で3日間播種しました。ロテノンによる処理(図5A、B)は、以前の研究と一致して、未処理の対照ウェルと比較して、石灰化表面の吸収を用量依存的に阻害した34。さらに、OC機能はATP産生とアクチン環形成を介して評価されました。OC吸収のロテノン依存性阻害は、ATP産生の阻害と関連していた(図5C)。吸収OCは、細胞骨格の組織化を促進することによって吸収能力を調節する高度に分極された細胞です。Alexa fluor 647コンジュゲートファロイジンを使用して、ロテノンの存在下または非存在下で培養した成熟OCのF-アクチン細胞骨格を標識しました。ロテノンは、成熟OCのRANKL由来のアクチン環の断片化を引き起こした(図5D)。

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図2:CD14+ 単球前駆体から効率的に分化するOC。 CD14+ 単球を磁気的に濃縮し、96ウェルプレートに1 x 105 細胞/ウェルで播種し、25 ng/mL M-CSFで一晩インキュベートしました。(A)M-CSFプライミング単球をRANKL(1 ng / mL、25 ng / mL、50 ng / mL、および100 ng / mL)の濃度を上げて刺激し、固定し、7日目にTRAPについて染色しました。画像を取得し、TRAP+ 多核細胞(MNC)をカウントしました。TRAP染色の代表的な画像を 補足図1に示す。エラーバーは平均±SD(n = 3)を示します。データは、一元配置分散分析とHolm-Sidakの対応のあるデータの多重比較検定で分析されました。* P ≤ 0.05 および ** P ≤ 0.005(B)96ウェルプレートのTRAP染色ウェルの代表的な画像は、7日目のM-CSF由来マクロファージと比較して、予想されるOC/ウェルの典型的な量と25 ng/mL RANK-L下での形態を示しています。スケールバー:1000 μm。 (C)2日目から14日目までのTRAP染色 によって 評価された50 ng/mL RANKL下でのOC形成の代表的な画像。OC は 5 日目以降に表示されます。巨大な異常融合OCは10日後に存在します。スケールバー:200μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図3:CD14+ 単球から分化した吸収性OC。 PBMCから単離したCD14+ 細胞を、ミネラルアッセイ表面(骨アッセイ)プレート上で25 ng/mL M-CSF(M)およびRANKL(R)の存在下で10日間OCに分化させました。(A)10日目の吸収を分析するために10倍の倍率で撮影された代表的な再構成井戸の画像(灰色の鉱物基質、白色の吸収ピット)。スケールバー:1000μm。 (B)吸収面積の割合の定量化。吸収データをウィルコクソン対分析で分析した。エラーバーは平均±SDを示します(n = 7)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図4:CD14−OSCAR+ OCのフローサイトメトリー濃縮。CD14+単球はPBMCから濃縮され、OCは前述のように分化した。付着したOC培養物をアキュターゼで剥離し、フローサイトメトリーのために染色した。(A-C)8日目のOCは、CD14とオスカーの表現に基づいてソートされました。(A)代表的なソートゲーティング戦略。細胞は一重項としてゲーティングされ、デッド染色は陰性であり、CD14+ OSCAR+(赤)およびCD14− OSCAR+(青)サブセットをソーティングした。(B)RANKL由来OC(シアン)とコントロールM-CSF由来マクロファージ(オレンジ色)の重複するOSCAR染色を示す代表的なプロット。赤色は、RANKL由来のOCのオスカーアイソタイプ染色コントロールです。(C)選別した集団をプラスチックに播種し、pro-OC培地(25 ng/mL M-CSFおよび50 ng/mL RANKL)で2時間接着させた後、TRAP染色と可視化を行った。代表的な画像は、CD14+サブセット(赤)のTRAP+細胞の欠如と、CD14−サブセット(青)の単核および多核のTRAP+プレOCおよびOCの欠如を示しています。スケールバー:200μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図5:成熟OCの機能を評価するためのアッセイ。 成熟OCの機能を評価するために、PBMCから単離したCD14+ 細胞をM-CSF(M)単独またはRANKL(R)と組み合わせて7日間培養し、フローサイトメトリーでOCを濃縮し、その後OCを阻害剤ロテノン で 24時間処理した。 (A)成熟OCをフローサイトメトリー ( CD14−OSCAR+)をロテノンの存在下または非存在下でミネラルアッセイ表面上で3日間培養し、その後、細胞を漂白し、10倍で画像化して、再吸収領域(白色の再吸収ピット)を明らかにした。(A)井戸の代表的な再構成画像。スケールバー:1000μm。 (B)吸収面積の割合の定量化。(B)のデータは、ダンの多重比較検定(n = 7)を用いた一元配置分散分析で分析した。* P ≤ 0.05 および ** P ≤ 0.01エラーバーはSD±平均値を示す。 (C)RANKLで分化し、ビヒクルまたはロテノン(10nMおよび30nM)のいずれかで処理した未分化および7日目の分化成熟OCの総細胞内ATP含量。ここでは、2DGおよびオリゴマイシンをアッセイのポジティブコントロールとして使用し、細胞溶解およびATP定量の30分前に添加した。エラーバーはSD±平均を示します(n = 4)。データは、一元配置分散分析と対応のあるデータに対するDunnettの多重比較検定で分析されました。** P ≤ 0.01。 (D)アクチン環形成(赤)および核(青)について染色された成熟OCの代表的な20倍画像であり、阻害剤によるアクチン環の喪失を示す。スケールバー:100μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

プレートフォーマット96ウェルプレート48ウェルプレート24ウェルプレート12ウェルプレート6ウェルプレート
容積100 μL225–250 μL450–500 μL0.8〜1ミリリットル1.8〜2ミリリットル

表1:異なるプレートフォーマットの細胞懸濁液の量。 容量は1 x 106 cells/mL溶液から計算され、細胞間融合に最適な密度を提供します。

フルオロフォア、クローン106 細胞あたりの体積(μL)
CD14PE/シアニン7、HCD145 μL
オスカーFITC, REA49410 μL
セルソーティングバッファー80 μL

表2:抗体マスターミックス溶液。

補足図1:RANKL用量反応のTRAP染色。 CD14+ 単球を磁気的に濃縮し、96ウェルプレートに1 x 105 細胞/ウェルで播種し、 図2のように25 ng/mL M-CSFで一晩インキュベートしました。TRAP染色の代表的な画像は、MCSFプライミング単球をRANKL(1 ng/mL、25 ng/mL、50 ng/mL、および100 ng/mL)の濃度の増加で刺激し、固定し、7日目にTRAPについて染色したことを示しています。スケールバー:400μm。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図2:完全に分化したOCにおける作用リング染色。 (A)TCプラスチックで分化し、AF647ファロイジン(赤色)で染色したOCの10倍倍の倍率。スケールバー:400μm。 (B)ガラスチャンバースライドで区別され、AF488ファロイジン(黄色)で染色されたOCの40倍の倍率。スケールバー:100 μm.核はDAPIで染色され、(A)は青色、(B)はシアンで示されています。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図3:OC分化効率に対する異なるFBSバッチの影響。 OCは、25 ng/mL M-CSFおよび50 ng/mL RANKL(MR)の存在下でCD14+ 単球から7日間分化しました。対照ウェルはM-CSFのみ(M)を有していた。(A)代表的な10倍倍の倍率(スケールバー:400 μm)および(B)FBSの2つの異なるバッチで1つのドナーから区別されたTRAP染色OCの定量。エラーバーは、3つのテクニカル反復の平均±SDを示します。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

in vitroで多数の機能性OCを容易に培養および単離することは、骨生物学およびOC媒介性疾患の理解を進めるために重要です。古典的には、OCは、脾臓または骨髄由来の骨芽細胞または間質細胞および造血細胞との共培養において生成された38,39。破骨細胞形成の理解における重要なブレークスルーは、OCの形成、分化、および生存の主要な調節因子としてのRANKLの同定でした40。RANKL依存性培養システムの初期のプロトコルは、OC生成21、41、42にPBMCを利用していました。ただし、これらの混合培養は時間がかかり、OCの分化と機能に対する直接的な影響をテストする能力を制限する多くの交絡因子を提示します。このプロトコルは、最適な破骨細胞形成が7日以内に得られるヒト末梢CD14+単球からの破骨細胞形成の効率的で信頼性の高いin vitroモデルを説明しています(図1および図2)、これは他のいくつかのプロトコルと比較してかなり高速です43,44,45,46.このプロトコルの主な特徴は、(1)精製されたCD14+単球の使用、(2)RANKLへの曝露前のM-CSFによる単球のプライミング、(3)培養期間(<7日間)、および(4)阻害剤によるOC形成(TRAP染色)および機能(吸収、ATP産生、アクチン環再編成)の阻害の信頼性の高い検出です。

方法論の最適化中に、いくつかの重要なポイントが特定されました。OCのin vitro分化は、CD14+単球の播種密度に大きく依存することが観察されています。したがって、このプロトコルでは、細胞が互いに相互作用し、融合して成熟OCになるために近接していることが不可欠であるため、細胞は高密度(96ウェルプレートの1 x 105細胞/ウェル、100 μLの培地)で播種されます。同様に、密度が高すぎる細胞を播種すると、培地の制限と必要なスペースの不足により、細胞の分化と成長が制限されます。さらに、このプロトコルで最大の成功を収めるには、密度勾配分離を注意深く行い、CD14+細胞の濃縮集団が可能な限り純粋であることを確認することが重要です。例えば、不十分な洗浄ステップは血小板の除去の欠如をもたらし、その結果、OC分化を阻害する47,48。同様に、M-CSFのみで刺激された単離されたCD14+調製物中の軽度のT細胞汚染の存在は、潜在的にT細胞によるRANKL分泌を介してOC分化をもたらし得る49。したがって、すべての実験にM-CSFコントロールを含めることが重要です。サンプルの純度を確保するために、特に新しい分離キットを使用する場合は、定期的な純度チェックもお勧めします。

最適なOC値(範囲:~200-1,600 OC/ウェル)は、ヌクレオシドとL-グルタミンが豊富なα-MEM培地を使用して達成されます。ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)およびロズウェルパーク記念研究所(RPMI)1640培地を含む他の従来の培地は、OC収量に影響を与える。FBSの発生源も破骨細胞形成に影響を与える可能性があります。FBSのバッチが異なると、RANK-L由来の破骨細胞形成が減少し、M-CSFコントロールに少数のTRAP+ 多核細胞が出現する可能性があります(補足図3)。したがって、一貫した結果を得るには、使用前に新しいFBSバッチをテストし、実験全体を通して同じバッチを継続して、分化プロセスの変動を最小限に抑えることをお勧めします。さらに、終了時点で得られた分化型OCの総数に関するドナー間の変動性は、このプロトコルを使用して、たとえば健康なドナーと患者を比較する際の制限を構成します。このような場合、まったく同じ条件と同じロットの培地、FBS、およびその他の試薬を使用することが不可欠です。

最適なOC分化と成熟に必要な別のステップは、RANKL添加前にM-CSFで単球をプライミングすることです。RANKLの18〜24時間前に細胞をM-CSFに曝露すると、単球がRANK発現15,26をアップレギュレートするようにプライミングされます。この時点でRANKLを添加すると、用量依存的に最適なOC分化が保証されます。OC分化の程度はドナーによって異なります。ただし、ほとんどのドナーで多数のOCを区別するには、通常、25 ng / mLのRANKLで十分です。さらに、25 ng/mL RANKLは、試験化合物の増強効果と阻害効果の両方の評価を容易にするため、化合物の初期スクリーニングのためのアッセイに使用できます。他の培養系では、RANKL添加前のM-CSFプレインキュベーション時間が長くなっていますが、これにより破骨細胞形成の培養時間が長くなります50。さらに、プライミングされた単球を一晩インキュベートしたままにしておくと、完全に接着した状態ではないが、それらをプレートに付着させることができる。したがって、RANKLを初めて導入するときは、プライミングされた単球の剥離や喪失を防ぐために、培地を完全に交換するのではなく、非常に慎重に半分交換する必要があります。培地の枯渇を防ぎ、細胞死を防ぐために、培地は3〜4日ごとにリフレッシュする必要があります。さらに、このアッセイで使用される容量が少ないため(96ウェルプレートで100 μL/ウェル)、アッセイウェルの周囲に水溶液(すなわち、滅菌蒸留H2OまたはPBS)で満たされた空のウェルのフレームを持つことが最も重要です。これにより、中程度の蒸発とエッジ効果が防止されます。

最後に、代謝アッセイ(ATPアッセイなど)では、反復間の大きな標準偏差を回避するために、細胞が生存可能であることが不可欠です(図5)。細胞の高い生存率は、細胞を選別し、選別されたOCをさらに培養するためにも重要です(図4)。ただし、この方法にはいくつかの制限があります。完全に成熟したOCは非常に接着性があり、プレートから取り外すのが困難です。より大きなOCは剥離が不可能なことが多く、細胞収率が低下する可能性があります。したがって、細胞は、選別後、必要な濃度でプレーティングする前にカウントする必要があります。さらに、本プロトコールでは、OCを剥離する非酵素的方法(アキュターゼ)を使用して、フローサイトメトリーの下流表面染色における膜変化を防止します。セルスクレーパー(ソフトエンドまたはハードエンドの両方)の使用もテストされ、高い細胞死につながりました。0.05%トリプシン/EDTA溶液を使用した酵素分離は、下流のアプリケーションで膜の完全性が不要な場合に、分離したOCのより高い収率に使用できます。さらに、OCが凝集するのを防ぐために、細胞剥離後のすべてのバッファーに高濃度のEDTAを使用し、フローサイトメトリー取得前に適切なフィルタリングを行うことを強くお勧めします。OC培養は、成熟OC、OC前駆体、およびマクロファージからなる細胞の不均一な集団であることに注意することが重要です。マクロファージはOCと容易に区別できますが、単核プレOCと多核OCはどちらもOSCARを発現しており、現在の方法では区別できません(図4)。実際、この後者の問題は、この方法の主な制限を構成します。さらに、OSCARの低発現はM-CSF培養物にも存在し(図4B)、OC系統コミットメントのためにプライミングされているマクロファージを示している可能性があります。図4Bに示すように、FMO染色シグナルに基づいてOSCAR+細胞のゲートを設定することが重要です。

要約すると、このプロトコルは、循環する初代ヒト単球から活性および機能的に成熟したOCを効率的に産生するための最適化された堅牢な方法について説明しています。このプロトコルの強みは、短時間でOCを生成し、多数の差別化されたOCを生成する能力です。この方法は、OCの分化と機能の根底にある基本的なメカニズムを調べるための道を開きます。

開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は、競合する利益がないことを宣言します。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者らは、感染免疫学部内のフローコア施設とグラスゴーイメージング施設(GIF)のこの作業への支援と支援に感謝の意を表します。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
µ-スライド 18ウェルチャンバースライド同上81816
8ウェルガラスチャンバースライド 同上 80807 
96ウェルTCプレート コーニング 3596 
96ウェルオステオアッセイストリップウェルプレート  コーニング 3989年 
アセテート溶液Sigma Aldrich386-3キット Cat No. 387A-1KT
アセトン VWR 20066.330 
酸性ホスファターゼ、白血球(TRAP)キット シグマ・アルドリッチ 387A-1KT 
Alexa Fluor 488 ファロイジンテレモフィッシャー - Invitrogen A12379 AF488   
Alexa Fluor 647 PhalloidinThermo Fisher - InvitrogenA22287AF647
Alfa Aesar 2-Deoxy-D-グルコース フィッシャーサイエンティフィック 11321867 2DG、98% 
アルファ最小エッセンシャルミディアム ギブコ 22571-020 
ATPlite 1ステップ パーキンエルマー 6016731 Luminiscence ATP検出アッセイシステム 
BD FACSAria IIIセルソーターBD Biosciences
ウシ血清アルブミン(BSA) シグマ・アルドリッチ A9418-100G 
細胞培養マイクロプレート、96ウェル、PS、F底 グライナーバイオワン 655083 ホワイトボトムプレート 
クエン酸溶液Sigma Aldrich91-5キット Cat No. 387A-1KT
Corning 6ml 丸底ポリスチレン試験管Fisher Scientific352054
Corning オステオアッセイ 表面 マルチウェルプレートSigma-Aldrich 
Corning osteo assay Surface multiple well plate 1 x 8 stripwellCorningCLS3989-2EA
DAPI テレモ・フィッシャー  D3571 
EasySepヒトCD14ポジティブセレクションキット STEMCELL Technologies 17858 
EasySep 赤血球溶解バッファー (10x)StemCell Technologies 20110
eBioscience fixable viability dye eFluor 780Theremo Fisher - Invitrogen 65-0865-14
エチレンジアミン四酢酸 シグマ・アルドリッチ E7889-100ML 
EVOS FL オートイメージングシステムサーモフィッシャーA32678
ファルコン丸底ポリプロピレン試験管 キャップ付きフィッシャーサイエンティフィック10314791
ファルコンチューブ 15 mLコーニング 430790 
ファルコンチューブ50mL コーニング  430828 
高速ガーネットGBCベースソリューションシグマアルドリッチ387-2キットからカタログ番号387A-1KT
ウシ胎児血清 ギブコ 〒10500-064 FBSの
フィコール・パケ・プラス cytiva 17144003 
ホルムアルデヒド シグマ・アルドリッチ F-8775 
ヒトsRANKリガンド ペプロテック 310-01-100UG 核因子κ-Bリガンドの受容体活性化因子 (ランクル)
ImageJ 画像解析ソフトImage Jversion 2.9.0
L-グルタミン ギブコ 25030-024 
リチウムヘパリンチューブ(9mL) バキュエット 455084 
マクロファージコロニー刺激因子 ペプロテック 300-25-100UG  M-CSF
ナプトール AS-BI リン酸溶液Sigma Aldrich387-1キット Cat No. 387A-1KT
Neubauer 血球計算計計数室 CamlabSKU 1127885
Streptomyces Diastatochromogenes由来のオリゴマイシン シグマ・アルドリッチ Q4876-5MG 
OSCAR抗体、抗ヒト、Vio Bright FITC、REAfinitMiltenyi Biotec130-107-661および130-107-617Clone REA494
PE/Cyanine7 抗ヒトCD14抗体Biolegend325618Clone HCD14 
ペニシリン/ストレプトマイシン シグマ P0781 
PHERAstarマシンおよびソフトウェアBMGLABTECH
リン酸緩衝生理食塩水(DPBS、1x) ギブコ 14190-094 
REA制御抗体(S)、ヒトIgG1、Vio Bright FITC、REAfinityMiltenyi Biotec130-113-443
亜塩素酸ナトリウム溶液  シグマ・アルドリッチ 425044-1L 
亜硝酸ナトリウム溶液Sigma Aldrich91-4キット Cat No. 387A-1KT
酒石酸溶液Sigma Aldrich387-3キット Cat No. 387A-1KT
Triton X-100 シグマ・アルドリッチ 9002-93-1 
トリパンブルー シグマ・アルドリッチ T8154-100ML 
CLS3989次

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. Osteoclast differentiation and activation. Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).
  2. Boyce, B. F., Xing, L. Functions of RANKL/RANK/OPG in bone modeling and remodeling. Archives Of Biochemistry and Biophysics. 473 (2), 139-146 (2008).
  3. Jacome-Galarza, C. E., et al. Developmental origin, functional maintenance and genetic rescue of osteoclasts. Nature. 568 (7753), 541-545 (2019).
  4. Agemura, T., Hasegawa, T., Yari, S., Kikuta, J., Ishii, M. Arthritis-associated osteoclastogenic macrophages (AtoMs) participate in pathological bone erosion in rheumatoid arthritis. Immunological Medicine. 45 (1), 22-26 (2022).
  5. Hasegawa, T., et al. Identification of a novel arthritis-associated osteoclast precursor macrophage regulated by FoxM1. Nature Immunology. 20 (12), 1631-1643 (2019).
  6. Walsh, N. C., Crotti, T. N., Goldring, S. R., Gravallese, E. M. Rheumatic diseases: The effects of inflammation on bone. Immunological Reviews. 208 (1), 228-251 (2005).
  7. Gravallese, E. M., et al. Identification of cell types responsible for bone resorption in rheumatoid arthritis and juvenile rheumatoid arthritis. The American Journal of Pathology. 152 (4), 943-951 (1998).
  8. Bromley, M., Woolley, D. E. Chondroclasts and osteoclasts at subchondral sites of erosion in the rheumatoid joint. Arthritis & Rheumatism. 27 (9), 968-975 (1984).
  9. Kleyer, A., Schett, G. Arthritis and bone loss: A hen and egg story. Current Opinion in Rheumatology. 26 (1), 80-84 (2014).
  10. Kawai, V. K., Stein, C. M., Perrien, D. S., Griffin, M. R. Effects of anti-tumor necrosis factor α (anti-TNF) agents on bone. Current Opinion in Rheumatology. 24 (5), 576-585 (2012).
  11. Siebert, S., Tsoukas, A., Robertson, J., McInnes, I. Cytokines as therapeutic targets in rheumatoid arthritis and other inflammatory diseases. Pharmacological Reviews. 67 (2), 280-309 (2015).
  12. Smiljanovic, B., et al. Monocyte alterations in rheumatoid arthritis are dominated by preterm release from bone marrow and prominent triggering in the joint. Annals of the Rheumatic Diseases. 77 (2), 300-308 (2018).
  13. Anderson, J. R., et al. 1H NMR metabolomics identifies underlying inflammatory pathology in osteoarthritis and rheumatoid arthritis synovial joints. Journal of Proteome Research. 17 (11), 3780-3790 (2018).
  14. McGarry, T., et al. Rheumatoid arthritis CD14+ monocytes display metabolic and inflammatory dysfunction, a phenotype that precedes clinical manifestation of disease. Clinical & Translational Immunology. 10 (1), 1237(2021).
  15. Ansalone, C., et al. TNF is a homoeostatic regulator of distinct epigenetically primed human osteoclast precursors. Annals of the Rheumatic Diseases. 80 (6), 748-757 (2021).
  16. Yokota, K., et al. Characterization and function of tumor necrosis factor and interleukin-6-induced osteoclasts in rheumatoid arthritis. Arthritis and Rheumatology. 73 (7), 1145-1154 (2021).
  17. Allard-Chamard, H., et al. Osteoclasts and their circulating precursors in rheumatoid arthritis: Relationships with disease activity and bone erosions. Bone Reports. 12, 100282(2020).
  18. Takegahara, N., et al. Involvement of receptor activator of nuclear factor-κB ligand (RANKL)-induced incomplete cytokinesis in the polyploidization of osteoclasts. The Journal of Biological Chemistry. 291 (7), 3439-3454 (2016).
  19. Jansen, I. D. C., Vermeer, J. A. F., Bloemen, V., Stap, J., Everts, V. Osteoclast fusion and fission. Calcified Tissue International. 90 (6), 515-522 (2012).
  20. McDonald, M. M., et al. Osteoclasts recycle via osteomorphs during RANKL-stimulated bone resorption. Cell. 184 (5), 1330-1347 (2021).
  21. Lacey, D. L., et al. Bench to bedside: Elucidation of the OPG-RANK-RANKL pathway and the development of denosumab. Nature Reviews Drug Discovery. 11 (5), 401-419 (2012).
  22. Zhao, B., Grimes, S. N., Li, S., Hu, X., Ivashkiv, L. B. TNF-induced osteoclastogenesis and inflammatory bone resorption are inhibited by transcription factor RBP-J. The Journal of Experimental Medicine. 209 (2), 319-334 (2012).
  23. Zhao, B. Does TNF promote or restrain osteoclastogenesis and inflammatory bone resorption. Critical Reviews in Immunology. 38 (4), 253-261 (2018).
  24. Crotti, T. N., et al. Receptor activator NF-κB ligand (RANKL) expression in synovial tissue from patients with rheumatoid arthritis, spondyloarthropathy, osteoarthritis, and from normal patients: semiquantitative and quantitative analysis. Annals of the Rheumatic Diseases. 61 (12), 1047-1054 (2002).
  25. Kim, H. R., et al. Reciprocal activation of CD4+ T cells and synovial fibroblasts by stromal cell-derived factor 1 promotes RANKL expression and osteoclastogenesis in rheumatoid arthritis. Arthritis and Rheumatology. 66 (3), 538-548 (2014).
  26. Arai, F., et al. Commitment and differentiation of osteoclast precursor cells by the sequential expression of c-Fms and receptor activator of nuclear factor κB (RANK) receptors. Journal of Experimental Medicine. 190 (12), 1741-1754 (1999).
  27. Hayman, A. Tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) and the osteoclast/immune cell dichotomy. Autoimmunity. 41 (3), 218-223 (2008).
  28. Nedeva, I. R., Vitale, M., Elson, A., Hoyland, J. A., Bella, J. Role of OSCAR signaling in osteoclastogenesis and bone disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 780(2021).
  29. Boyce, B. F., Yoneda, T., Lowe, C., Soriano, P., Mundy, G. R. Requirement of pp60c-src expression for osteoclasts to form ruffled borders and resorb bone in mice. The Journal of Clinical Investigation. 90 (4), 1622-1627 (1992).
  30. Matsubara, T., et al. Regulation of osteoclast differentiation and actin ring formation by the cytolinker protein plectin. Biochemical and Biophysical Research Communications. 489 (4), 472-476 (2017).
  31. Roscher, A., et al. The F-actin modulator SWAP-70 controls podosome patterning in osteoclasts. Bone Reports. 5, 214-221 (2016).
  32. Jurdic, P., Saltel, F., Chabadel, A., Destaing, O. Podosome and sealing zone: Specificity of the osteoclast model. European Journal of Cell Biology. 85 (3-4), 195-202 (2006).
  33. Francis, M. J. O., et al. ATPase pumps in osteoclasts and osteoblasts. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 34 (5), 459-476 (2002).
  34. Kwak, H. B., et al. Inhibition of osteoclast differentiation and bone resorption by rotenone, through down-regulation of RANKL-induced c-Fos and NFATc1 expression. Bone. 46 (3), 724-731 (2010).
  35. Massey, H. M., Flanagan, A. M. Human osteoclasts derive from CD14-positive monocytes. British Journal of Haematology. 106 (1), 167-170 (1999).
  36. Xue, J., et al. CD14+CD16-monocytes are the main precursors of osteoclasts in rheumatoid arthritis via expressing Tyro3TK. Arthritis Research and Therapy. 22 (1), 221(2020).
  37. Marco-Casanova, P., et al. Preparation of peripheral blood mononuclear cell pellets and plasma from a single blood draw at clinical trial sites for biomarker analysis. Journal of Visualized Experiments. (169), e60776(2021).
  38. Takahashi, N., et al. Osteoblastic cells are involved in osteoclast formation. Endocrinology. 123 (5), 2600-2602 (1988).
  39. Yasuda, H., et al. Osteoclast differentiation factor is a ligand for osteoprotegerin/osteoclastogenesis-inhibitory factor and is identical to TRANCE/RANKL. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (7), 3597-3602 (1998).
  40. Lacey, D. L., et al. Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation. Cell. 93 (2), 165-176 (1998).
  41. Matsuzaki, K., et al. Osteoclast differentiation factor (ODF) induces osteoclast-like cell formation in human peripheral blood mononuclear cell cultures. Biochemical and Biophysical Research Communications. 246 (1), 199-204 (1998).
  42. Shalhoub, V., et al. Osteoprotegerin and osteoprotegerin ligand effects on osteoclast formation from human peripheral blood mononuclear cell precursors. Journal of Cellular Biochemistry. 72 (2), 251-261 (1999).
  43. Neale, S. D., Smith, R., Wass, J. A. H., Athanasou, N. A. Osteoclast differentiation from circulating mononuclear precursors in Paget's disease is hypersensitive to 1,25-dihydroxyvitamin D3 and RANKL. Bone. 27 (3), 409-416 (2000).
  44. Abdallah, D., et al. An optimized method to generate human active osteoclasts from peripheral blood monocytes. Frontiers in Immunology. 9, 632(2018).
  45. Komano, Y., Nanki, T., Hayashida, K., Taniguchi, K., Nobuyuki, M. Identification of a human peripheral blood monocyte subset that differentiates into osteoclasts. Arthritis Research and Therapy. 8 (5), 152(2006).
  46. Kylmäoja, E., et al. Peripheral blood monocytes show increased osteoclast differentiation potential compared to bone marrow monocytes. Heliyon. 4 (9), 00780(2018).
  47. Wang, D., et al. Platelet-rich plasma inhibits RANKL-induced osteoclast differentiation through activation of Wnt pathway during bone remodeling. International Journal of Molecular Medicine. 41 (2), 729-738 (2018).
  48. Cenni, E., Avnet, S., Fotia, C., Salerno, M., Baldini, N. Platelet-rich plasma impairs osteoclast generation from human precursors of peripheral blood. Journal of Orthopaedic Research. 28 (6), 792-797 (2010).
  49. D'Amico, L., Roato, I. Cross-talk between T cells and osteoclasts in bone resorption. BoneKEy Reports. 1 (6), 82(2012).
  50. Quinn, J. M. W., Elliott, J., Gillespie, M. T., Martin, T. J. A combination of osteoclast differentiation factor and macrophage-colony stimulating factor is sufficient for both human and mouse osteoclast formation in vitro. Endocrinology. 139 (10), 4424-4427 (1998).

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Osteoclast DifferentiationM CSF StimulationRANKL InductionTRAP StainingMineral Resorption AssayActin Ring FormationFlow Cytometry SortingImmunofluorescence Microscopy

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