方法論記事

2光子顕微鏡を用いた閉鎖頭蓋外傷性脳損傷マウスおよび頭蓋窓における蛍光タンパク質発現の生体内イメージング

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DOI：

10.3791/64701

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2023年4月21日

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1Department of Neurology, University of Massachusetts Chan Medical School, 2Department of Neurosurgery, The First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, 3Department of Neurobiology, University of Massachusetts Chan Medical School

この記事について

サマリー

この研究は、マウスへの反復性外傷性脳損傷の送達と、2光子顕微鏡を使用したニューロン発現EGFPのその後の生体内イメージングのための頭蓋窓の同時移植を示しています。

要約

このプロトコルの目的は外因性の刺激への露出に縦断的に動物の頭脳の特定のセル・タイプ内の興味の蛋白質の表現そしてローカリゼーションを、視覚化する方法を示すことである。ここでは、閉鎖頭蓋骨外傷性脳損傷(TBI)の投与と、その後の縦断的生体内イメージングのための頭蓋窓の同時移植がマウスに示されています。マウスに、増強緑色蛍光タンパク質(EGFP)を発現するアデノ随伴ウイルス(AAV)をニューロン特異的プロモーター下で頭蓋内注射します。2〜4週間後、マウスはAAV注射位置の上でウェイトドロップデバイスを使用して反復TBIを受けます。同じ手術セッション内で、マウスに金属製のヘッドポストを埋め込み、次にTBIの衝撃部位の上にガラスの頭蓋窓を埋め込みます。EGFPの発現と細胞局在は、数か月にわたって外傷にさらされた同じ脳領域で2光子顕微鏡を使用して調べられます。

概要

外傷性脳損傷(TBI)は、スポーツ傷害、車両衝突、軍事戦闘に起因する可能性があり、世界的な健康上の懸念事項です。TBIは、生理学的、認知的、行動的障害、および生涯にわたる障害または死亡率につながる可能性があります1,2。TBIの重症度は、軽度、中等度、重度に分類でき、大多数は軽度のTBI(75%-90%)です3。TBI、特にTBIの反復発生は、神経変性を促進し、アルツハイマー病(AD)、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、前頭側頭型認知症(FTD)、慢性外傷性脳症(CTE)などのいくつかの神経変性疾患の危険因子として機能する可能性があることがますます認識されています4,5,6.しかし、TBI誘発性神経変性の根底にある分子メカニズムは依然として不明であり、したがって活発な研究分野を表しています。ニューロンがTBIに応答し、TBIから回復する方法についての洞察を得るために、TBI後のマウスにおける縦断的生体内イメージングによって、特にニューロン内で目的の蛍光タグ付きタンパク質をモニタリングする方法を本明細書に記載する。

この目的のために、この研究は、以前に報告されたものと同様の閉鎖頭蓋骨TBIの投与のための外科的処置を組み合わせる方法を示しています7,8、 Goldeyらによって記述されたように、下流の生体内イメージングのための頭蓋窓の移植のための外科的処置と一緒に9。特に、最初に頭蓋窓を移植し、その後、TBIを誘発する体重減少の影響が窓を損傷し、マウスに取り返しのつかない害を及ぼす可能性があるため、同じ領域にTBIを実行することは現実的ではありません。したがって、このプロトコルは、TBIを投与してから、すべて同じ手術セッション内で、衝撃部位に直接頭蓋窓を埋め込むように設計されました。TBIと頭蓋窓移植の両方を1回の手術セッションで組み合わせることの利点は、マウスが手術を受ける回数が減ることです。さらに、後の手術セッションで窓を埋め込むのとは対照的に、TBIに対する即時反応(つまり、時間のタイムスケールで)を監視できます(つまり、TBI後数日の時間スケールで開始される初期イメージング)。また、頭蓋窓と生体内イメージングプラットフォームは、固定組織の免疫染色などの従来の方法によるニューロンタンパク質のモニタリングよりも優れています。例えば、同じマウスを複数の時点で研究できるため、個別の時点に必要なマウスのコホートとは対照的に、生体内イメージングに必要なマウスの数が少なくて済みます。さらに、同じニューロンを経時的に監視できるため、同じ細胞内の特定の生物学的または病理学的イベントを追跡できます。

概念実証として、シナプシンプロモーター下での増強緑色蛍光タンパク質(EGFP)のニューロン特異的発現がここで実証されています10。このアプローチは、1)オリゴデンドロサイトのミエリン塩基性タンパク質(MBP)プロモーターやアストロサイトのグリア線維性酸性タンパク質(GFAP)プロモーターなど、他の細胞タイプ特異的なプロモーターを利用することで異なる脳細胞タイプに拡張できます11、2)それらの遺伝子をEGFP遺伝子と融合させることによる目的の異なる標的タンパク質、および3)異なる蛍光色素に融合した複数のタンパク質を共発現します。ここでは、EGFPは、頭蓋内注射によるアデノ随伴ウイルス(AAV)送達を介してパッケージ化され、発現されます。閉じた頭蓋骨TBIは、ウェイトドロップデバイスを使用して投与され、その後、頭蓋窓が埋め込まれます。ニューロンEGFPの可視化は、2光子顕微鏡を使用してin vivoでEGFP蛍光を検出するために頭蓋窓を介して達成されます。2光子レーザーでは、最小限の光損傷で皮質組織の奥深くまで浸透することができ、個々のマウス内の同じ皮質領域を数日から最大数ヶ月にわたって縦断的に繰り返しイメージングすることができます12,13,14,15。要するに、TBI手術と生体内イメージングを組み合わせるこのアプローチは、TBI誘発性疾患の病理に寄与する分子イベントの理解を深めることを目的としています16,17。

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プロトコル

動物に関するすべてのプロトコルは、全米研究評議会(US)委員会が発行した実験動物のケアと使用に関するガイドに従って実施されました。プロトコルは、マサチューセッツ大学チャン医科大学(UMMS)の施設動物管理および使用委員会によって承認されました(許可番号202100057)。簡単に言うと、研究の概略図(図1)に示されているように、動物はウイルス注射、TBI、窓の移植、そして時間順に生体内イメージングを受けます。

注: 商用用語は削除されました。具体的な使用機器については、 部品表 をご参照ください。

1.脳定位固定装置を用いたAAVの頭蓋内注射

  1. AAV(PHP.eB)-Syn1-EGFP
    1. 1 x 1013 ウイルスゲノム/ミリリットル(vg/mL)のウイルス力価を使用します。Syn1は、ニューロンにおけるウイルス発現の制限を可能にするニューロン特異的なプロモーターであるSynapsin1を指します。ウイルスは、社内で準備することも、外部に委託することもできます。
  2. AAV投与のための脳定位固定手術の準備
    1. オートクレーブレギュラーハサミ、外科用ノギス、外科用スプリングハサミ、外科用鉗子、蚊鉗子、ガーゼ、綿先アプリケーター、ガラスマイクロリットル注射器。
    2. 75%エタノールを使用して手術部位を消毒します。使い捨ての滅菌手術用ドレープを拡張して、脳定位固定プラットフォームの手術領域をカバーします。
      注:注射手術中に動物の体温を維持するには、フィードバック調整された加熱装置を使用してください。
    3. マウスの体重を量り、記録します。
    4. 酸素ボンベバルブを開き、酸素流量を1.5 L / minに調整します。麻酔器を開き、イソフルランレベルの値を3に設定します。
      注:このステップでは、キャリアガスは室内空気または100%酸素のいずれかです。
    5. マウスを誘導室に入れ、5分間放置して完全な麻酔を実現します。
    6. マウスが完全に麻酔されたら(すなわち、尾部つまみ反射がないことと相まって、約2秒に1サイクルのゆっくりとした安定した呼吸数)、マウスを誘導チャンバーから取り出し、マウスの頭を脳定位固定装置フレームに置きます。
    7. 麻酔チューブのノーズコーンをマウスの鼻の上に置きます。
    8. 手術が終了するまで、1.5%イソフルランを使用し、キャリアガスを1L/minの流量で使用して麻酔を維持します。呼吸の頻度を定期的にチェックし、手術中は少なくとも15分ごとに尾またはつま先をつまんで、適切な麻酔を評価します。イソフルラン濃度を適宜調整し、所望の麻酔深度を維持します。
    9. マイクロリットルのシリンジ(10 μL)にウイルス溶液を入れます。次に、シリンジを脳定位固定装置の対応するマイクロインジェクターポンプに固定します。
  3. 注射手術
    1. 使い捨てインスリン注射器を使用してブプレノルフィン(1 mg / kg、皮下投与)を投与し、マウスの目に潤滑剤点眼軟膏を塗布します。.
    2. 頭のてっぺんの頭皮から通常のハサミでトリミングして毛を取り除きます1。
    3. ガーゼと綿の先端のアプリケーターで頭皮の皮膚をきれいにします。最初に75%エタノールを使用して皮膚を消毒し、次にベタジンを使用します。これを3回繰り返し(つまり、エタノールの後にベタジンを)、ベタジンを皮膚に最後に塗布します。
    4. 麻酔深度を再チェックして、マウスが完全に麻酔されていることを確認します(つまり、2秒あたり約1サイクルのゆっくりとした安定した呼吸数と、尾部つまみ反射がないことを確認します)。正中線に沿って通常のハサミ2を使用して~1cmの切開を行い、右頭頂頭蓋骨を露出させ、綿の先端アプリケーターを使用して骨膜を取り除きます。
    5. マーカーペンを使用して頭蓋骨の2つの点を次の座標にマークします:点A:ブレグマの後方2.5 mm、右半球の正中線の外側1 mm。ポイントB:ブレグマの後方2.5 mm、右半球の正中線の外側2 mm。
    6. 細かいEF4カーバイドビットを備えた電動歯科用ドリルを使用して、マークされた座標で頭蓋骨に2つの穴を慎重に開けます。
      注意: 脳組織を傷つけないように注意してください。
    7. 脳定位固定フレームを調整して、マイクロリットルのシリンジ針の先端を正中線から1 mm横の頭蓋骨の穴に合わせます。.
    8. シリンジの針を脳表面に当て、その位置をゼロ点(z軸)に設定します。針先を大脳皮質に0.5mmの深さまで下げ、1μLのウイルス溶液を200nL/minの速度でゆっくりと注入します。
    9. ウイルス溶液が脳組織に完全に注入された後、溶液の逆流を防ぐために針を抜く前に5分間待ちます。
    10. シリンジ針をゆっくりと引き抜きます。他の部位で注入を繰り返します。無菌の非吸収性外科用縫合糸(6-0ゲージ)で切開部を縫合します。
    11. セファゾリン [500 mg/kg (333 mg/mL、通常 ~45 μL)、筋肉内投与]、およびメロキシカム (5 mg/kg、皮下投与) を手術後、動物に麻酔をかけたまま投与します。
    12. マウスを脳定位固定装置から外し、麻酔を中止します。マウスを加熱毛布の上の清潔なケージに入れ、動物が歩行可能になるまで(約15分)監視します。その後、ホームケージに移します。
    13. 最初のブプレノルフィン注射後、それぞれ8時間、16時間、24時間にブプレノルフィン(1 mg / kg、皮下)とメロキシカム(5 mg / kg、皮下)を再度投与します。.
      注:ウイルス注射後2〜4週間で、マウスはAAV注射と同じ部位にTBIと頭蓋窓移植を受けます。

2.反復TBI導入の投与

注:TBIパラメータは、TBIの影響が一度だけ提供された以前のレポート7,8から調整されています。ここでのプロトコルは、影響の総数を 10 に増やすことを除いて、同じパラメータを適用します。

  1. TBI機器
    1. 図2Bに示すように、右側のマウスヘッドに閉じた頭蓋骨TBI(図2A)を投与するには、特注のポータブルデバイスを使用します。
  2. 手術前の準備
    1. 通常のはさみ、手術用ノギス、手術用スプリングハサミ、外科用鉗子、蚊の鉗子、ヘッドポストピース、ガーゼ、先端が綿のアプリケーターなどのオートクレーブ手術器具。
    2. 手術の2時間前にマウスの体重を量り、記録します。頭蓋窓移植中の脳浮腫を最小限に抑えるために、インスリン注射器を使用して大腿四頭筋に4.8 mg / kg [2 mg / mL、通常~70 μl(2つの部位に注射する必要がある)]の用量でデキサメタゾンリン酸ナトリウムを注射します。.デキサメタゾンの注射後、TBI手術を開始する前に、後で使用するためにステップ3.1に示されているようにガラス窓を準備します。
    3. 75%エタノールを使用して手術ステージとTBI機器を消毒し、使い捨ての滅菌手術用ドレープを拡張して、脳定位固定プラットフォームの手術ステージをカバーします。加熱装置と温度モニターの電源を入れ、目標温度を37°Cに設定します。
    4. 酸素ボンベバルブを開き、酸素流量を1.5 L / minに調整します。麻酔器を開き、イソフルランレベルの値を3に設定します。
      注:100%純粋な酸素は、動物がTBIの影響を生き延びるのに役立ちます。
    5. マウスを誘導室に入れ、5分間放置して完全な麻酔を実現します。
    6. マウスが完全に麻酔されたら(すなわち、尾部つまみ反射がないことと相まって、約2秒に1サイクルのゆっくりとした安定した呼吸数)、マウスを誘導チャンバーから取り出し、マウスの頭を脳定位固定装置フレームに置きます。
    7. 麻酔チューブのノーズコーンをマウスの鼻の上に置きます。
    8. 1.5%イソフルランと100%純酸素を混合し、1L/minの流量で手術終了まで麻酔を維持します。呼吸の頻度を定期的にチェックし、手術中は少なくとも15分ごとに尾またはつま先をつまんで、適切な麻酔を評価します。イソフルラン濃度を適切に調整して、希望の麻酔深度を維持します。.
  3. TBI手術
    1. 使い捨てインスリン注射器を使用してブプレノルフィン(1 mg / kg、皮下投与)を投与し、マウスの目に眼科用軟膏を塗布します。.
    2. ハサミ1でトリミングして頭のてっぺんから毛を取り除き、脱毛剤を1分間塗布します。
      注意:脱毛剤製品は皮膚刺激物であるため、頭皮に3分以上塗布しないでください。マウスの目に脱毛剤が入らないようにしてください。
    3. ガーゼと綿の先端のアプリケーターを塗って頭皮の皮膚をきれいにします。次に、最初に75%エタノールを使用して皮膚を消毒し、次にベタジンを使用します。これを3回繰り返し(つまり、エタノールの後にベタジンを)、ベタジンを皮膚に最後に塗布します。
    4. 麻酔深度を再チェックして、マウスが完全に麻酔されていることを確認します(つまり、2秒あたり約1サイクルのゆっくりとした安定した呼吸数と、尾部つまみ反射がないことを確認します)。外科用鉗子3で皮膚をテントで固定し、目から約12mm後方から12〜15mmの長さの正中線切開を行います。
    5. スプリングハサミ2を使用して頭蓋骨の左右の半球の皮膚を切除します。
    6. 頭蓋骨が露出したら、滅菌綿の先端アプリケーターで優しくこすり、滅菌生理食塩水で洗い流して骨膜を取り除きます。
    7. 頭蓋骨の状態を目視検査して、以前のウイルス注射手術のために作られた2つの小さな穴を除いて、頭蓋骨が無傷であることを確認します。
    8. 頭蓋骨領域を乾燥させ、ブレグマの後方2.5 mm、矢状縫合糸から右側の外側2 mmの座標でTBI衝撃部位に印を付けます(図2B)。
    9. マウスを脳定位固定装置フレームからすばやく取り外し、TBIデバイスの下のバッファークッションに頭を置きます。
    10. インパクターの先端をマークされた衝撃部位に合わせます。
    11. 繋がれたナイロン製の紐をマウスの頭から15cm上まで引っ張って金属柱を持ち上げてから放し、TBI部位の頭蓋骨の上部に接触しているトランスデューサーロッドに重りが自由に落ちるようにします。TBI衝撃を与えるときは、マウスの頭に触れないでください。
    12. マウスを加熱ブランケットの上に移動させ、呼吸状態を監視しながら仰向けに置きます。
    13. マウスが仰臥位から腹臥位になったら、マウスをイソフルラン誘導チャンバーに、3%イソフルランと100%純酸素を混合したイソフルランを1.5 L/minの流量で~5分間入れます。
    14. マウスが完全に鎮静したら(つまり、2秒あたり約1サイクルのゆっくりとした安定した呼吸数と、尾部つまみ反射がない状態)、手順2.3.9〜2.3.14を繰り返して、合計10回の衝撃を達成します。
      注:私たちの研究では、10のTBIの影響が、マウスの死亡率が低い堅牢な表現型を誘発することがわかっています(データはまだ公開されていません)。パラメータは、衝撃の数および/または重量が解放される高さを増減することにより、異なる重症度の脳損傷を達成するように調整され得る。すべてのパラメータは、地元のIACUCによる承認の対象となります。
    15. 手術用顕微鏡で頭蓋骨をチェックし、頭蓋骨骨折が発生した場合はマウスを研究から外します。
    16. 偽手術の場合は、動物をインパクターの下に配置するなど、上記と同じ手順に従いますが、TBIの衝撃は与えません。
    17. 10回目の TBI衝撃後、マウスが仰臥位から腹臥位に直動した後、マウスをイソフルラン誘導チャンバーに~5分間入れます。手順2.2.6-2.2.8に従って、以下に説明する頭蓋窓移植手術のためにマウスヘッドを脳定位固定フレームに配置します。

3.頭蓋窓移植手術

注:以下の頭蓋窓の埋め込み手順は、Goldeyら9から採用され、ヘッドポストとイメージングウェルの仕様がここに適用されました。

  1. ウィンドウの準備
    注意: TBI手術を開始する前に、ステップ2.2.2でウィンドウの準備を完了してください。窓は、以下に説明するように、透明な光学接着剤で結合された2つの丸いガラスカバーガラス( 図2Cに示すように、直径3mmと5mm)で作られています。
    1. ガラスカバーガラスを75%エタノールに15分間浸して消毒します。ガラスカバーガラスをエタノールから取り出し、無菌表面(滅菌済み24ウェルプレートの蓋など)で~10分間乾燥させます。
    2. インスリン注射器に透明な光学接着剤を充填し、気泡の発生を防ぎます。顕微鏡1(材料表)で倍率0.67倍で、5mmのカバーガラスの中央に光学接着剤を少量(~1μL)垂らします。次に、すぐに3mmのカバーガラスを上に置き、5mmのカバーガラスの中央に配置します。
    3. 細かい鉗子を使用して優しく圧力をかけ、接着剤を均一に広げます。3 mmのカバースリップの周囲に気泡や壁が形成されている場合は、ガラス窓を廃棄してください。
    4. 接着剤を硬化させるには、カバーガラスをUVボックスに20 x 100 μJ / cm2のパワーで150秒間入れます。鉗子4を使用して3mmのスリップの側面をそっと動かし、2枚のカバーガラスがしっかりと接着されていることを確認します。カバーガラスが動いた場合は、さらに60秒間UVボックスに戻します。ガラス窓は、後で使用するために滅菌済みの24ウェルプレートに保管してください。
  2. 頭蓋骨の表面を粗くします。
    注意: ここからは、手術用顕微鏡でセクション3のすべての手順を実行します。10倍から始めて、希望の倍率に調整します。
    1. FG4カーバイドビットを使用して、低速のローター速度(つまり、出力数を~1-2に設定)で頭蓋骨の表面を優しくゆっくりとドリルで開け、残りの骨膜を取り除き、歯科用セメントが頭蓋骨としっかりと結合するように、粗い頭蓋骨の表面を作成します。ここでは、ドリルの代わりにメスを使用することもできます。
    2. 生理食塩水を使用して、頭蓋骨の表面から骨のほこりを洗い流して取り除きます。
  3. 筋肉を分離します。
    注:筋肉の分離は、歯科用セメントの接点として機能する露出した頭蓋骨の表面積を増やすのに役立ち、それによってインプラントの構造的完全性を確保します。この筋肉分離ステップは、通常、側頭蓋骨プレートの~3mmを露出させます。
    1. 頭頂骨と側頭蓋骨をつなぐ縫合糸がある眼の後約5mmで、閉じた細い先端(#5/45鉗子)をそっと挿入して外側の筋肉を頭蓋骨から分離し、ラムドイド縫合糸まで閉じた先端を後方向に静かに動かします。
    2. 頭蓋窓の移植が行われる側の側方筋を分離します。
      注意: 眼動脈を傷つけないように、筋肉を目の近くに離しすぎないように注意してください。そうしないと、重度で持続的な出血が発生する可能性があります。.マウスは頭を上げるためにこれらの筋肉を必要とするため、後頭骨から筋肉を分離しないでください。
    3. 生理食塩水を使用して手術部位の破片を洗い流し、ガーゼでその部分を乾かします。ジェルフォームを手術部位に塗布して止血することができます。
  4. ヘッドポストを埋め込みます。
    1. 開頭手術を行う間、およびその後の2光子イメージングのために、マウスの頭をしっかりと固定するために、以前の出版物9に記載のカスタムメイドのチタンヘッドポスト(図2D)を使用する。
    2. マーカーペンと外科用ノギスを使用して、右側の清潔で乾燥した頭蓋骨の開頭術の周囲をトレースします。トレースされた円の中心点は、ブレグマの後方2.5 mm、右半球の矢状縫合糸から1.5 mm離れています。トレースされた円の直径は約3.2〜3.5 mmで、3 mmのガラスカバーガラスよりもわずかに大きいです。開頭サークルがウイルス注入部位(ウイルス注入中に開けられた2つの穴を参考にすることができます)とTBI部位を覆うことができることを確認してください。
    3. イヤーバーを緩め、開頭面が完全に水平になるようにヘッドを回転させてから、イヤーバーを再度締めます。
    4. 綿の先端が付いたアプリケーターの木の棒を使用して、ヘッドポストの前端と後端に瞬間接着剤を2滴加えます。
    5. チタン製のヘッドポストを開頭術の中心に配置し、頭蓋窓を埋め込む場所と同じ平面内に収まるようにすばやく調整します。瞬間接着剤が乾くまで軽く圧力をかけます。これには通常、~30秒かかります。
    6. 予冷したセラミックミキシングディッシュ(-20°Cの冷凍庫で少なくとも10分間)で歯科用セメントを調製します:300 mgのセメント粉末、6滴の速乾性塩基液、および1滴の触媒を混ぜ合わせ、完全に混合されるまで(~15回)混合物を攪拌します。
      注:セメントはペースト状である必要があります。薄すぎる場合は、セメント粉末をもう少しかき混ぜます。濃すぎる場合は、ペースト状の粘稠度が得られるまで、一度に1滴ずつすばやくベース液をかき混ぜます。
    7. たどった円周の外周にたっぷりの歯科用セメント混合物をすばやく塗布し、露出した骨表面を覆います。ただし、開頭部位は覆わないでください。歯科用セメントが乾燥して固まるまで~15分待ってから、先に進みます。
    8. イヤーバーを放し、ヘッドポストを金属フレームに固定して、ヘッドが安定し、マークされた開頭術の円周に沿って正確に穴を開けることができるようにします。開頭部位にセメントがある場合は、FG4カーバイドビットを使用してドリルで穴を開けて取り外します。
  5. 開頭術
    1. 外科用ノギスを使用して、手順3.4.2で定義されているように、マークされた円の直径を確認します。頭蓋窓が開頭手術の内側にぴったりと収まるように、必要に応じて調整します。
    2. 電動歯科用ドリルを使用して、最初にFG4カーバイドビットを使用して、マークされた円の外側に沿って頭蓋骨をエッチングして薄くします(速度は出力~9-10に設定されています)。これにより、頭蓋骨を薄くするための「トラック」が作成されます。
      注意: 熱傷を最小限に抑え、スムーズなトラックを実現するには、ドリルビットを動かし続けてください。同じ場所に2秒以上穴を開けないでください。
    3. 定期的に掘削を停止し、滅菌生理食塩水で全域を灌漑して、ドリルからの加熱を減らし、骨粉を洗い流します。
    4. ステップ3.5.2で説明したように、FG1/4カーバイドビットを使用して、頭蓋骨が紙のように薄く透明になるまで、頭蓋骨を薄くし続けます。
      注意: 両手でドリルを握ると、ドリルの制御が容易になり、ドリルビットを脳に挿入しないようにすることができます。
    5. EF4カーバイドビットを使用して頭蓋骨の薄化を完了します。骨弁と周囲の頭蓋骨の間に亀裂が発生すると、脳脊髄液(CSF)が放出されることがあり、頭蓋骨が完全に穴を開けられたことを示します。
    6. トラックに沿って頭蓋骨の残りの部分を薄くし、穴を開け続けます。出血を防ぐために、明らかな血管系が頭蓋骨の下を横切るポイントに穴を開けることは避けてください。
    7. 細い鉗子の先端(鉗子1)~0.5mmをひびの入った場所に挿入し、下にある脳をへこませることなく、骨皮弁を静かに上に持ち上げます。
    8. 骨皮弁を切除した後、開頭部を生理食塩水で灌漑します。脳の表面は、開頭術の端よりも1〜2mm高くなる可能性があります。
    9. このステップから始めて、脳組織を保護するために、露出した脳を常に生理食塩水で覆います。
    10. 注射手術後の組織の癒着と血管系の成長により、元のAAV注射部位の骨皮弁を持ち上げると出血が発生する可能性があります。このような場合は、乾いた綿の先端付きアプリケーターでサイトを~2分間(または必要に応じてそれ以上)静かに押します。ジェルフォームを使用して出血を止めることができます。ケガの原因となるため、止血のために化学薬品や加熱鉗子を使用しないでください。
    11. 鉗子1を使用して、目に見えるくも膜を静かに取り除きます。
  6. インプラントガラス窓
    1. 外科用鉗子2を使用して、3mmのガラスカバーガラスを下に向けて滅菌ガラス窓を持ち上げます。開頭部位の上にガラス窓を配置して調整し、窓が開頭部の端にぴったりと収まるようにします。5mmのガラスカバーガラスが上部にあります。
    2. 次のように歯科用セメントを準備します:100 mgのセメント粉末、2滴の速乾性塩基液、および1滴の触媒を混ぜ合わせます。完全に混ざるまで(~15回)混合物をかき混ぜます。セメントがペースト状で厚くなるまで~6分待ちます。セメントが薄すぎると、手順3.6.4で窓の下のスペースに浸透し、窓を覆い隠す可能性があります。
    3. セメントがペースト状で厚くなるのを待っている間、脳定位固定装置マニピュレーターを介して窓に十分な量の圧力をかけ、頭蓋骨がガラス窓にしっかりとしっかりと接触することを確認します。手順3.6.4の歯科用セメント液がガラスの下のスペースに到達して窓を覆い隠さないようにしてください。
    4. 調整可能な精密アプリケーターブラシを使用して、窓の端に沿って少量のセメントを追加し、ガラス窓を頭蓋骨で密閉します。セメントが完全に乾くまで~10分待ってから、窓の上のマニピュレーターを静かに解放して取り外します。このステップの時点で、10回のTBI衝撃を終了し、ヘッドポストと頭蓋窓を埋め込むのに~4時間かかります。
    5. 窓を覆っている余分なセメントがある場合は、FG4カーバイドビット付きの歯科用ドリルを使用して歯科用セメントをトリミングします。
      注意: 窓の周りのセメントが多すぎると、2光子対物レンズが窓の表面に近づくのを妨げる場合があります。
  7. イメージングウェルを埋め込む
    注:イメージングウェル(図2D)は、外径~1.6cmのゴムリングで、ヘッドポストの上面と一致し、2光子イメージングのために頭蓋窓の上に水を保持します。
    1. 窓の埋め込みが完了したら、ヘッドポストの上面にある歯科用セメントの破片をドリルで取り除き、湿った手術用ガーゼを使用してその領域を清掃します。その領域を~3分間乾かします。
    2. 綿の先端付きアプリケーターを使用して、少量の瞬間接着剤を浸し、ヘッドポストの上面に貼り付けます。ゴムリングをヘッドポストにすばやく取り付けます。ヘッドポストに密着させるために、ゴムリングに中程度の圧力をかけて~2分間にします。瞬間接着剤は控えめに使用してください、そうしないとガラス窓に付着し、2光子イメージングを覆い隠す可能性があります。
  8. 鎮痛薬と抗生物質の投与
    1. イメージングウェルを埋め込んだ直後、イソフルランを中止する前に、使い捨てインスリン注射器を使用してセファゾリン [500 mg/kg (333 mg/mL、通常 ~45 μL)、筋肉内]およびメロキシカム (5 mg/kg、皮下) を投与します。
    2. 薬物投与後、麻酔を中止し、マウスを脳定位固定装置フレームから解放し、マウスを加熱毛布の上にあるホームケージに戻します。
    3. マウスが歩行可能になるまで、~15分間マウスを注意深く監視します。
      注:マウスは他のマウスのゴム製イメージングウェルを噛む可能性があるため、個別に飼育してください。ケージ内のマウスの近くに餌と水ジェルを与えて、 自由にアクセスします。
    4. ブプレノルフィン(1 mg / kg、皮下)とメロキシカム(5 mg / kg、皮下)を、頭蓋窓移植手術後48時間まで、前の投与後8時間ごとに再度投与します。.

4. 生体内2光子イメージング

  1. 生体内イメージングには、調整可能なコヒーレント多光子レーザーと倍率20倍の対物レンズ(NA 1.0;水浸)を備えた顕微鏡2(材料表)を使用します18。EGFP信号に使用されるフィルターは「BP500-550」です。
  2. 生体内イメージングのために頭蓋窓マウスを準備します。
    1. 手術日(0日目と指定)から開始し、TBI後の設計された時点で2光子イメージングを実施します。頭蓋窓マウスを麻酔導入室に入れ、キャリアガスと混合した3%イソフルランを1.5L/minの流量で5分間投与します。
      注意: キャリアガスは、室内空気または100%酸素のいずれかです。
    2. マウスが完全に麻酔されたら(つまり、2秒あたり約1サイクルのゆっくりとした安定した呼吸数と、テールピンチ反射がない状態)、マウスを誘導チャンバーから取り外し、ヘッドポストをブラケットにすばやく固定します。マウスの胴体を、ブラケットが取り付けられている丸いプラスチックプレート(直径19 cm)の上に置きます。
      注:マウスの胴体の下に手温パッドを配置し、生体内イメージング中に熱サポートを提供しました。
    3. 潤滑剤の眼科用軟膏をマウスの目に塗布し、麻酔チューブのノーズコーンをマウスの鼻の上に置きます。1.5%イソフルランとキャリアガスを1L/minの流量で使用し、麻酔を維持します。
    4. 呼吸の頻度を定期的にチェックし、適切な麻酔を評価するために、画像撮影中、少なくとも15分ごとに尾またはつま先をつまんで行います。.イソフルラン濃度を適切に調整して、希望の麻酔深度を維持します。.
    5. マウスヘッドの位置を合わせて、頭蓋窓が2光子対物レンズの真下になるようにします。頭蓋窓のかなり上のイメージングに水を加えます。対物レンズを水に浸すように下げます。
  3. 頭蓋内窓マウスの生体内イメージング
    1. スコープの水銀ランプをオンにします。まず、眼球を通して落射蛍光で脳を観察します。
      注意: 血管系は黒く見えます。ウィンドウがクリアになっている領域を選択します。落射蛍光をオフにし、EGFPシグナルのレーザー波長を860 nmに設定し、最適な(つまり、明るいが飽和していない)シグナルになるようにレーザー設定を調整します。
    2. スキャンモードを フレーム に設定し、ラインステップを1に設定します。平均数を 16 に、ビット深度を 8 ビットに、モードを Line に、メソッドを Mean に設定します。
    3. 血管系パターンを「参照マップ」として使用して、その後の縦断的イメージングのために同じ脳領域を画像化します。 図3Aに示すように、皮質血管系がzスタックモードで優勢である3つの平面の表在レベル(髄膜表面から100μm未満のI層)を、10μmの面間間隔で画像化します。
    4. 図3Aに示すように、zスタックモードで、10 μmの面間間隔と8のスキャン速度で、深層レベル(レイヤーIVおよびV、表面レベルより~400 μm深い)の6つの平面を画像化します。
    5. イメージングが終了したら(マウスあたり~20分)、麻酔を中止し、マウスをフレームから解放し、加熱ブランケットの上にあるホームケージに戻します。マウスが歩行可能になるまで連続して監視します (通常は ~7 分かかります)。
    6. TBI手術後0日目、1週間後、4か月のマウスを縦断的に画像化します。

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結果

このプロトコルの概念実証として、AAV-Syn1-EGFPを発現するウイルス粒子を、生後3ヶ月の雄TDP-43 Q331K/Q331Kマウス(C57BL/6Jバックグラウンド)19の大脳皮質に注入しました。なお、野生型C57BL/6J動物も用いることができるが、本研究室は神経変性疾患の研究に力を入れているため、TDP-43 Q331K/Q331Kマウスを用いた。AAV注射の4週間後にTBI手術が行われました。同じ手術環境内で、ヘッドポストと頭蓋窓が埋め込まれました。TBI手術後0日目、1週間後、4カ月後に2光子顕微鏡を用いてマウスを連続的に画像化しました(図1)。一般に、注射手術は~30分かかり、TBI手術はマウス1匹あたり~1時間かかりました。TBI手術中、マウスは一般的に、最初の衝撃と比較して、その後の衝撃後に仰臥位から腹臥位に直るのに長い時間を必要としました。たとえば、マウスは、最初の衝撃の後、その位置を右にするのに 2 分かかりましたが、10回目の衝撃の後、...

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ディスカッション

本研究では、AAV注射、TBI投与、頭蓋窓留置ヘッドポストを組み合わせて、マウスの脳皮質(IV層およびV層)内のEGFP標識ニューロンの縦断的画像解析を行い、皮質ニューロンに対するTBIの影響を観察しました。この研究は、ここで選択された海馬の上のTBI部位が、頭蓋窓の移植に比較的平らで広い表面を提供することを指摘しています。逆に、頭蓋骨はこの部位の前方が比較的狭いため、ヘッドポストが頭蓋骨の表面に効果的に接触することを保証することは困難です。この研究ではTDP-43 Q331K/Q331K マウスモデルのみを使用しましたが、ALSおよびFTD19に焦点を当てた研究所の研究を考慮すると、このプロトコルは他のほとんどのマウス株に適用できるはずです。ここに記載されるようなニューロンの標識に加えて、様々な戦略を用いて、生体内イメージングのために他の細胞型を標識することができる。1つのアプローチは、遺伝子改変マウスにおいてCre-Lox組換え系を用いて、遺伝的にコードされた蛍光タンパク質を細胞特異的に発現させることである21。別の...

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開示事項

利益相反は宣言されていません。

謝辞

AAV(PHP.eB)-Syn1-EGFPウイルスを寄贈してくださったマサチューセッツ大学チャン医科大学のMiguel Sena-Esteves博士と、マウスの頭蓋骨のスケッチを描いてくださったマサチューセッツ大学チャン医科大学のDebra Cameron博士に感謝します。また、Bosco、Schafer、Henningerの各研究室の現在および過去のメンバーの提案とサポートにも感謝します。この研究は、国防総省(W81XWH202071/PRARP)からDAB、DS、およびNHに資金提供されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
調節可能な精密アプリケーター ブラシParkellS379
BD インスリン シリンジBDNDC/HRI#08290-3284-385/16" x 31G
BetadinePurdueNDC67618-151-177.5% ポビドン ヨウ素を含む
BuprenorphinePAR PharmaceuticalNDC 42023-179-05
セファゾリンHIKMA PharmaceuticalNDC 0143-9924-90
セラミックミキシングディッシュパーケルSKU:S387歯科用セメント製剤用
コットンチップアプリケーターZOROキャットログ#:G9531702
触媒パーケルS371フルネーム:「C」ユニバーサルTBB触媒
歯科用セメント粉末パーケルS396不透過性L-パウダーC&B メタボンド
デンタル ドリルフォアダムH.MH-130
デンタル ドリル コントローラーフォアダムHP4-310
デキサメタゾンフェニックスNDC 57319-519-05
EF4 超硬ビットマイクロコピーロット# C150113ヘッド Dia/Lgth/mm 1.0/4.2
エトナルフィッシャー サイエンティフィック04355223EA75%
FG1/4超硬ビットマイクロコピーLot# C150413ヘッド径/Lgth/mm 0.5/0.4
FG4 超硬ビットコピーLot# C150309ヘッド径/Lgth/mm 1.4/1.1
ヘッドポストN/AN/Aカスタムメイド
加熱装置CWETC-1000 マウスには定位固定装置が装備されており、手術中に使用できます
ヒーティングブランケットCVS薬局E12107余分な暖房装置および外科の後で使用されて下さい
イソフルランPivetalNDC 46066-755-03
イソフルランの誘導の部屋Vetequip89012-688短い
イソフルランの揮発機械のための誘導の部屋 Vetequip911103
イソフルランの揮発機械ホールダーVetequip901801
ライカ手術用顕微鏡ライカ10450243
潤滑剤 眼科用軟膏PicetalNDC 46066-753-55
マーカーペンDelascoSMP-BK
MeloxicamNorbrookNDC 55529-040-10
マイクロインジェクションポンプとそのコントローラーWorld Precision Instrumentsmicro4 and UMP3
マイクロリットルシリンジHamilton Hamilton800141701 RN, 10 μ注射器のためのLゲージおよび針のための32ゲージ、2のin、ポイント様式3
蚊の鉗子CAROLINA項目#:625314ステンレス鋼、曲がった、
5のDepilatory代理店McKesson CorporationのN/AのNairの毛のアロエ及びラノリン脱毛ローション
顕微鏡 1NikonSMZ745頭蓋窓の準備用ニコン顕微鏡
顕微鏡 2ZeissLSM 7 MP2 光子顕微鏡
多光子レーザーコヒーレントカメレオン ウルトラ II、モデル: MRU X1、VERDI 18Wレーザー 2 光子顕微鏡用
非吸収性外科用縫合ハーバード 装置カタログ# 59-68606-0、丸針付き
ノーランド光学接着剤 81ノーランド製品NOA 81
引っ掛かりなしニードルホルダーカロライナアイテム #: 567912
クイックベース液体パーケルS398"B" クイックベース C&B メタボンド
レギュラーハサミ 1ユーロスタットユーロスタット es5-300
レギュラーハサミ 2ワールド精密計器No.501759-G
丸型カバーガラス 1ワーナーインスツルメンツCS-5R Cat# 64-0700直径5mm用
丸型カバーガラス 2ワーナーインスツルメンツCS-3R Cat# 64-0720直径3mm用
ラバーリングOrings-Onlineアイテム # OO-014-70-50O-リング
生理食塩水バイオワールドL19102411PR
春のはさみ 1世界の精密機器No. 91500-09先端 まっすぐ
春のはさみ 2世界の精密機器No. 91501-09先端湾曲
脳定位固定装置プラットフォームKOPFモデル 900LS
瞬間接着剤ヘンケルアイテム#:1647358
外科用キャリパーワールド精密機器No.501200
用鉗子1顕微鏡科学Catlog#0508-5/45-POスタイル5/45、湾曲
外科用鉗子2電子顕微鏡科学catlog#0103-5-POスタイル5、ストレート
外科用鉗子3電子顕微鏡科学catlog#72912
用鉗子4顕微鏡科学Catlog#0508-5 / 45-POスタイル5/45、湾曲
用ガーゼZORO猫ログ#:G0593801
外科用ランプライカライカKL300 LED
UVボックス分光リンカーXL-1000は、UVクロスリン
カーVaporguardVetequip931401
Vetbond ティッシュ接着剤3M アニマルケア部品番号:014006
放射線 マイクロつの糸 台 台 台 台 外科電子外科電子外科

参考文献

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