このプロトコルは、肉眼的および組織学的変化との相関を有する超音波画像を用いて、子宮内膜癌の誘導性マウスモデルにおける子宮内の形態学的変化の経時的な進行をモニターするための方法を記載する。
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方法論記事
マウスにおける腫瘍抑制因子 Arid1a および Pten のPax8指向性欠失における子宮内膜癌進行の非侵襲的超音波評価
この記事について
サマリー
要約
子宮がんは、これらのモデルでの取り扱いと遺伝子操作の容易さのためにマウスで研究することができます。ただし、これらの研究は、異なるコホートの複数の時点で安楽死させた動物の死後の病理の評価に限定されることが多く、研究に必要なマウスの数が増加します。縦断的研究でマウスをイメージングすると、個々の動物の病気の進行を追跡できるため、必要なマウスの数を減らすことができます。超音波技術の進歩により、組織のマイクロメートルレベルの変化を検出できるようになりました。超音波は、卵巣の卵胞成熟および異種移植片の成長を研究するために使用されてきましたが、マウスの子宮の形態学的変化には適用されていません。このプロトコルは、誘発された子宮内膜がんマウスモデルにおける in vivo イメージング比較と病理学の並置を調べます。超音波によって観察された特徴は、肉眼的病理学および組織学によって見られる変化の程度と一致していた。超音波は観察された病状を高度に予測することがわかり、マウスの癌などの子宮疾患の縦断的研究への超音波検査の組み込みを支持しました。
概要
マウスは、生殖障害の最も重要な動物モデルの1つであり続けています1,2,3。卵巣がんおよび子宮がんの遺伝子組み換えまたは誘発されたげっ歯類モデルがいくつかあります。これらの研究は通常、形態学的および病理学的変化の縦断的傾向を把握するために、異なる時点で安楽死させた複数のコホートに依存しています。これにより、個々のマウスにおける癌発生に関する継続的なデータを取得する能力が妨げられる。さらに、個々のマウス疾患進行状態を知らなくても、介入研究は、特定の動物における進行を検出するための個々の閾値ではなく、所定の時点および以前のコホートの平均所見に基づいている4,5。したがって、新薬や化合物を試験するための前臨床モデルを促進し、病理生物学の理解を加速すると同時に、厳密さと再現性を高めるために、生きた動物での縦断的評価を可能にするイメージングアプローチが必要です6。
超音波イメージング(米国)は、他のイメージング方法と比較して比較的簡単で安価であり、実行が容易であり、驚くべき解像度を持つことができるため、マウス子宮がんの進行の縦断的モニタリ....
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プロトコル
マウスを含むすべての手順および実験は、ジョンズホプキンス動物管理および使用委員会によって承認されたプロトコルに従って実施されました。すべての手順で、手袋や使い捨ての隔離ガウンなど、適切なPPEを着用しました。使用直後に赤い箱の鋭利物の容器に適切に廃棄された鋭利物を取り扱う際には注意が払われました。このプロトコルで使用されるすべての材料と機器の詳細については、 材料の表 を参照してください。
1.ドキシサイクリンを用いたiPAD(誘導性 Pten、Arid1a 二重欠失)マウスにおける子宮内膜癌の誘導
- 前述のように、10匹のPax8-Cre-Arid1a-Pten二重欠失(iPAD)トランスジェニックマウス(図1)を混合遺伝的背景(129S、BALB/C、C57BL/6)で維持します14。
- ドキシサイクリン治療の前に、各マウスの卵巣、卵管、子宮のベースライン超音波(2D)画像を収集します。
- ドキシサイクリン含有マウス固形飼料(625 mg / kg飼料のドキシサイクリンヒクレート)を雌iPADマウスに7〜8週齢から最低2週間提供して、遺伝子欠失を誘発します。.
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結果
Pax8-Cre-Arid1a-Pten二重欠失(iPAD)トランスジェニックマウスは、前述のように、混合遺伝的背景(129S、BALB/C、C57BL/6)で維持された14。マウス全員にドキシサイクリン飼料を2週間与えて、Creリコンビナーゼを誘導した。私たちのグループによる以前の研究では、ドキシサイクリンは経管投与14によって投与されました。しかし、この現在の研究では、ドキシサイクリン飼料誘導法が効率的に機能し、マウスの経管栄養のストレスを軽減しました。子宮などのPax8発現細胞の腫瘍抑制因子(Arid1aおよびPten)のDNAを切除するために必要なCreリコンビナーゼ発現を誘導するには、ドキシサイクリン投与法が適切であることを確認することが重要です。図6に示すように、ARID1aおよびpTEN14に対する抗体を用いた免疫組織化学を用いて、隣接する間質組織と比.......
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ディスカッション
このプロトコルは、マウスの子宮内の腺癌の進行における子宮形態学的変化を評価するための超音波の有用性を調べます。本研究では、マウスの子宮内膜がんの誘導を縦断的に追跡することにより、超音波によって検出された解剖学的詳細が肉眼的および組織学的病理の指標となることが判明した。これにより、マウスの子宮がんの進行を追跡するために、複数の時点で超音波によって監視された少数のマウスによる縦断的研究の使用への扉が開かれます。この縦方向の検出は、ハンドヘルドプローブを使用し、レールシステムの超音波装置を使用せずに達成されました。使用されている高周波プローブ(トランスデューサ)は広く入手可能であり、このアプローチは世界中の複数の機関で再現可能です。プロトコルの重要なステップには、実験に必要な解像度のレベルに適したプローブの使用と、超音波の前にイメージングするためのマウスの準備が含まれます。
マウスを準備する際の重要なステップは、研究領域からすべての毛を取り除き、腹腔に液体を注入することです。皮膚に残った毛皮は、超音波ゲルに泡を閉じ込める可能性があり、画像にアーティファクトを生成する可能性があります。し.......
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開示事項
著者は開示する利益相反を持っていません。
謝辞
NCI卵巣がん胞子プログラムP50CA228991、ポスドク研修プログラム5T32OD011089、ジョンズ・ホプキンス大学のリチャード・W・テリンデ基金からの資金提供に感謝している。また、私立学校振興・共済機構の私立高等教育機関への経常支出補助金も一部賄いました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 動物の世話に使用される試薬および機器 | |||
| げっ歯類の食事療法(2018、625ドキシサイクリン) | Envigio | TD.01306 | Mouse Feed |
| Reagents and Equipment Used for Ultrasound Imaging | |||
| 10 mL Injectable 0.9% NaCl | Hospira, Inc | RL-7302 | アイソトニック液 |
| 吸収パッド | Daigger | EF8313 | 吸収パッド |
| 麻酔誘導チャンバー | ハーバード製装置 | 75-2029 | 誘導チャンバー |
| 麻酔吸収キット アブソーバーキャニスター、ホルダー、チューブ、アダプター付き | CWE, Inc | 13-20000 | ノーズコーンとチューブ |
| アクアソニッククリア超音波ゲル(0.25リットル) | Parker Laboratoies | 08-03 | ゲル |
| BD Plastipak 3 mLシリンジ | BDバイオサイエンス | 309657 | リンジ |
| F /エアスカベンジャーチャコールキャニスターOMNICON | 80120 | ||
| イソフルラン用清掃システム、USP | Vet One | 502017 | 麻酔剤 |
| M1050非再呼吸移動式麻酔器 | Scivena Scientific | M1050 | 麻酔気化器 |
| MX550S、25-55 MHzトランスデューサー、15mm、リニア | VisualSonics | MX550S | 超音波トランスデューサー(プローブ) |
| Nair Hair Aloe &ラノリン脱毛ローション - 9.0オン | ネール | デピリエイティングクリーム | |
| フィリップスノレルコマルチグルーマーオールインワントリマーシリーズ7000 | リップス北米 | MG7750 | クリッパーPrecisionGlide |
| 25 G 1 "針 | BDバイオサイエンス | 305125 | 針 |
| Puralube眼科軟膏 | Dechra | 17033-211-38 | 点眼薬 |
| Vevo 3100イメージングシステム | VisualSonics | Vevo 3100 | 超音波装置 |
| Vevo LAB 5.6.1 | VisualSonics | Vevo LAB 5.6.1 | 超音波分析ソフトウェア |
| ビニール 加熱パッド カバー付き、12 x 15 インチ | Sunbeam | 731-500-000R | 加熱パッド |
| Wd Elements 2TB 基本ストレージ | Western Digital Elements | WDBU6Y0020BBK-WESN | データ ストレージ |
| 免疫組織化学に使用される試薬および装置 | |||
| 10% w/v ホルマリン | フィッシャー サイエンティフィック | SF98-4 | 組織固定バッファー |
| アニマルフリー ブロッカーおよび希釈剤、R.T.U. | ベクターラボラトリーズ株式会社 | SP5035 | 抗体ブロッカー |
| チャージスーパーフロストプラスガラススライド | VWR4831-703 | ティッシュマウントスライドク | |
| エン酸バッファー | ミリポアシグマ | C9999-1000ML | エピトープ Retrival バッファー (pTEN) |
| Cytoseal – 60 | Thermo Scientific | 8310-4 | スライドシール用樹脂 |
| ゴールドシールカバー ガラス | Thermo Scientific | 3322 | カバースライド |
| ハリス修飾ヘマトキシリン | ミリポアSigma | HHS32-1L | カウンターステインバッファー |
| ハイブリダイゼーションインキュベーター (デュアルチャンバー) | Fischer Scientific | 13-247-30Q | パラフィン |
| ImmPACT DAB 基質、ペルオキシダーゼ (HRP) | Vector Laboratories Inc. | SK-4105 | シグナル現像基板 |
| ImmPRESS HRP ヤギ抗ウサギIgGポリマー検出キット ペルオキシダーゼ | ベクター研究所 | MP-7451 | 二次 IHC 抗体 |
| Oster 5712 デジタルフードスチーマー | オスター | 5712 | エピトープ用野菜スチーマー |
| Retrival rabbit mAB anti-ARID1a | abcam | ab182560 | 一次 IHC 抗体 (1:1,000) |
| rabbit mAB anti-PTEN | Cell Signaling | 9559 | 一次 IHC 抗体 (1:100) |
| Scotts Tap Water Substitute | MilliporeSigma | S5134-100ML | "Blueing" Buffer |
| Tissue Path IV Cassette | Fischer Scientific | 22272416 | Tissue Fixation Cassette |
| Trilogy Buffer | Cell Marque | 920P-10 | エピトープ Retrival バッファー (ARID1a) |
参考文献
- Ajayi, A. F., Akhigbe, R. E. Staging of the estrous cycle and induction of estrus in experimental rodents: an update. Fertility Research and Practice. 6, 5(2020).
- Kim, S. W., Kim, Y. Y., Kim, H., Ku, S. Y. Animal models closer to intr....
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