このプロトコルは、肉眼的および組織学的変化との相関を有する超音波画像を用いて、子宮内膜癌の誘導性マウスモデルにおける子宮内の形態学的変化の経時的な進行をモニターするための方法を記載する。
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方法論記事
マウスにおける腫瘍抑制因子 Arid1a および Pten のPax8指向性欠失における子宮内膜癌進行の非侵襲的超音波評価
この記事について
サマリー
要約
子宮がんは、これらのモデルでの取り扱いと遺伝子操作の容易さのためにマウスで研究することができます。ただし、これらの研究は、異なるコホートの複数の時点で安楽死させた動物の死後の病理の評価に限定されることが多く、研究に必要なマウスの数が増加します。縦断的研究でマウスをイメージングすると、個々の動物の病気の進行を追跡できるため、必要なマウスの数を減らすことができます。超音波技術の進歩により、組織のマイクロメートルレベルの変化を検出できるようになりました。超音波は、卵巣の卵胞成熟および異種移植片の成長を研究するために使用されてきましたが、マウスの子宮の形態学的変化には適用されていません。このプロトコルは、誘発された子宮内膜がんマウスモデルにおける in vivo イメージング比較と病理学の並置を調べます。超音波によって観察された特徴は、肉眼的病理学および組織学によって見られる変化の程度と一致していた。超音波は観察された病状を高度に予測することがわかり、マウスの癌などの子宮疾患の縦断的研究への超音波検査の組み込みを支持しました。
概要
マウスは、生殖障害の最も重要な動物モデルの1つであり続けています1,2,3。卵巣がんおよび子宮がんの遺伝子組み換えまたは誘発されたげっ歯類モデルがいくつかあります。これらの研究は通常、形態学的および病理学的変化の縦断的傾向を把握するために、異なる時点で安楽死させた複数のコホートに依存しています。これにより、個々のマウスにおける癌発生に関する継続的なデータを取得する能力が妨げられる。さらに、個々のマウス疾患進行状態を知らなくても、介入研究は、特定の動物における進行を検出するための個々の閾値ではなく、所定の時点および以前のコホートの平均所見に基づいている4,5。したがって、新薬や化合物を試験するための前臨床モデルを促進し、病理生物学の理解を加速すると同時に、厳密さと再現性を高めるために、生きた動物での縦断的評価を可能にするイメージングアプローチが必要です6。
超音波イメージング(米国)は、他のイメージング方法と比較して比較的簡単で安価であり、実行が容易であり、驚くべき解像度を持つことができるため、マウス子宮がんの進行の縦断的モニタリングにとって魅力的な方法です6,7。この非侵襲的モダリティは、覚醒マウスまたは5〜10分の検査を使用して短時間の鎮静下にあるマウスでミクロンスケールの特徴をキャプチャできます。超音波顕微鏡は、マウス卵巣卵胞の発達8および移植または誘発された腫瘍の成長を測定する方法として検証されています9、10、11。高周波USはまた、経皮的子宮内注射12および発情周期13にわたるラット子宮変化の観察にも使用されている。高周波USは、レールシステムを使用してトランスデューサ/プローブを保持し、標準化された位置と圧力で高解像度の画像をキャプチャする特殊な固定プラットフォームにマウスを保持します。ただし、この機器はすべての機関で利用できるわけではありません。ハンドヘルドトランスデューサースキャン法は、より少ない専用機器で採用でき、マウスの臨床診断と研究アプリケーションの両方に使用できます。
ハンドヘルド高周波プローブを使用した米国のイメージングを使用して、数週間にわたって子宮がんの発生を監視できるかどうかという疑問が残ります。腸と同様に、げっ歯類の子宮は薄壁の細い構造であり、腹部内で非常に可動性があり、複数の組織の深さに隣接しているため、腎臓などの比較的動かない臓器よりもイメージングが困難です。この研究は、超音波によって観察された組織と組織病理学の間の相関を確立し、マウスの子宮を見つけるためのランドマークを定義し、 子宮内膜がんの縦断的評価の実現可能性。この研究は、米国によって画像化された子宮の出現と組織病理学との間の定性的対応を示すデータを提示し、数週間にわたるマウスの連続画像も提示します。これらの結果は、ハンドヘルドUSを使用してマウスの子宮内膜がんの発生をモニタリングできるため、専用の機器を必要とせずに個々のマウス縦断データを収集して子宮がんを研究する機会が生まれることを示しています。
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プロトコル
マウスを含むすべての手順および実験は、ジョンズホプキンス動物管理および使用委員会によって承認されたプロトコルに従って実施されました。すべての手順で、手袋や使い捨ての隔離ガウンなど、適切なPPEを着用しました。使用直後に赤い箱の鋭利物の容器に適切に廃棄された鋭利物を取り扱う際には注意が払われました。このプロトコルで使用されるすべての材料と機器の詳細については、 材料の表 を参照してください。
1.ドキシサイクリンを用いたiPAD(誘導性 Pten、Arid1a 二重欠失)マウスにおける子宮内膜癌の誘導
- 前述のように、10匹のPax8-Cre-Arid1a-Pten二重欠失(iPAD)トランスジェニックマウス(図1)を混合遺伝的背景(129S、BALB/C、C57BL/6)で維持します14。
- ドキシサイクリン治療の前に、各マウスの卵巣、卵管、子宮のベースライン超音波(2D)画像を収集します。
- ドキシサイクリン含有マウス固形飼料(625 mg / kg飼料のドキシサイクリンヒクレート)を雌iPADマウスに7〜8週齢から最低2週間提供して、遺伝子欠失を誘発します。.
2.機器のセットアップ
- 加熱パッドの電源を入れ、清潔な吸収パッド(目標温度:38°C)で覆います。
- イソフルラン気化器とO2 タンクが適切に満たされていることを確認してください。内容物が少ない場合は補充して交換してください。
- 誘導チャンバー、ノーズコーン、および清掃システムを気化器に接続します。
- 超音波装置をセットアップします。
- 子宮または卵巣のイメージングには、それぞれ32〜56MHzまたは最大70MHzの範囲のトランスデューサー(プローブ)を選択します。
- プローブを取り付け、マシンの電源を入れます。
- システムの起動後、コントロールパネルを使用してユーザー資格情報でログインし、ホーム画面にアクセスします。
- ホーム画面から、[ アプリケーション ]タブに移動し、[ マウス(小)腹部モード]を選択します。
- [ スキャン ]をクリックしてホーム画面に戻り、ライブ画像が表示されるのを待ちます。
- 左側のツールバーのオプションからBモードを選択します。
- 「 その他のコントロール」 をクリックすると、画像のゲインや深度などの画像補正のための追加ツールを表示したり、フレーム/秒などのクリップ取得設定を調整したりできます。
- 画像設定を選択したら、[ スキャン]をクリックしてホーム画面に戻ります。
- O2 タンクの電源を入れ、流量を誘導チャンバーに向け、流量を1 L / minに設定します。
3.脱毛を含む超音波スクリーニングのためのマウスの準備
- 誘導チャンバーにマウスを置きます。麻酔の誘導のためにイソフルラン気化器を2%-3%vol / volに設定します。
- つま先のつまみに対する反応の欠如と1〜2呼吸/秒前後の呼吸数によって、適切な麻酔の深さを決定します。
- 滅菌眼科用潤滑剤を各眼に塗布します。適切なサイズのバリカンを使用して、最後の肋骨と骨盤の間の背側と腹側から毛皮を取り除きます。
- 画像化する腹側と背側の領域に脱毛クリームの薄層を適用します(必要な場合)。
- マウスを誘導室に約3〜5分間戻し、脱毛クリームが脱毛に作用している間、適切な麻酔深度を維持します。≤4分後、清潔で湿ったペーパータオルでクリームをそっと拭き取ります。
注意: 脱毛クリームに長時間さらされると刺激があり、皮膚病変を引き起こす可能性があります。
4.臓器間のコントラストを高めるための体液の腹腔内注射
- 滅菌等張液溶液(滅菌0.9%NaClまたは乳酸リンガー溶液など)で満たされた3〜10 mLシリンジを加熱パッドと吸収パッドの間に数分間置き、35〜40°Cに温めます。機械にウォーマーがない場合は、加熱パッドに超音波ジェルのボトルを置きます。
- 20〜25 gのマウスの場合、1〜2 mLの溶液を腹腔に注入します。
- 片手で首筋でマウスを固定し、腹側を露出させます。
- マウスを~20°の角度で持ち、鼻を床に向けて、重力によって臓器を頭蓋に向けます。
- 小さなゲージ針(25 G、長さ5/8、ツベルクリン注射器)を使用して、腹部の尾右象限の皮膚と腹壁に穴を開けます。
- 液体を注入する前に、血管系または消化管への注入を避けるために、最小限の圧力で引き戻します。血液やその他の物質が注射器に入った場合は、針を外してください。新しい針と注射器を使用して、少し異なる位置で再試行してください。
- 注射中にマウスが目覚めた場合は、2%〜3%vol/volイソフルランを含む麻酔用の小さな誘導チャンバーに戻します。
5. 背側アプローチからの超音波イメージング
- マウスを加熱パッドの上の吸収パッドの腹側横臥状態に配置します(図2A-C)。
- げっ歯類のノーズコーンをマウスの鼻と銃口の上にしっかりと置きます。鼻コーンを通して送達されるイソフルランで麻酔薬の深さを100%O 2で1%-2%vol / volで維持します。.必要に応じて、滅菌眼科用潤滑剤を各眼に塗布します。.
- マウスの定期的な呼吸数(1-2 / s)とつま先のつまみ反応の欠如を監視して、麻酔を調整する必要があるかどうかを示します。
- 麻酔をかけたマウスの両側、最後の肋骨と骨盤の間の脊椎に、少量(~0.5-1 mL)の予熱した超音波ゲルを軸方向(外側)に置きます。
- 超音波プローブに少量のゲルを置きます。
- プローブを椎骨と平行に配置し、プローブの前面を頭蓋側に向けます。プローブヘッドには、プローブの向きを示すインジケーターマークがあります。収集される新しい画像セットごとに、曜日、時刻、動物ID、プローブの向き、および動物側(右、左、背側、腹側)を記録します。
- マウスが腹側横臥(背側の皮膚がプローブに触れている)の状態で、腎臓のランドマークがないかその領域をゆっくりとスキャンします(図2B および 図3)。腎臓を視野に入れた状態で、プローブの尾を引いて、腎臓によって頭蓋腹側、背側腹壁によって背外側に接している非常に高エコー性の卵巣脂肪パッド内の卵巣-わずかに高エコーの楕円形から円形の構造(図4A、B)を見つけます。
注:卵巣の尾側および外側の圧力は、卵巣を腹壁に近づけ、腸のループから遠ざける可能性があります。卵巣は解剖学的に背腹壁に対して位置しており、腹側と外側に上軸筋、腎臓に対して尾側にあります。 - コントロール画面の下部にあるスライダーを使用して 信号ゲイン を調整し、画像のコントラストを向上させます。
- 腎臓の画像を改善するには、反対側の腹部に指で圧力をかけます。圧力と角度を脊椎に直接平行から~20°の腹側まで変化させます。
- 目的の臓器が表示されたら、[ クリップの保存 ]または [録画の開始 ]をクリックしてビデオを収集し、[完了したら 録画を停止 ]をクリックして、事前設定されたフレーム数で画像を保持します。
- ライブ画像または録画から 1 つのフレームを Save Frame ボタンで保存します。
- 子宮を画像化するには、卵巣が視野の最も頭蓋的な側面になるまでプローブを尾側に引きます。子宮が見えるまでプローブの圧力と角度を変えます。
- 関心のある臓器ごとにビデオとフレームの収集を繰り返します。
- 外側の脚の筋肉組織も視野に入れて、背側腹壁に沿って縦方向に走る子宮を見つけます(図4B)。
注:子宮のサイズと内腔の直径は、発情期と病状によって異なる場合があります。 - 蠕動運動について組織を監視して、腸ループを子宮静止角と区別します。
6.腹側アプローチから画像を収集する
- マウスを背側横臥状態に置き、目の潤滑が十分であり、銃口がノーズコーンにしっかりと収まっていることを確認します(図2A)。
- 少量(~0.5-1 mL)の予熱した超音波ゲルを腹側腹部に塗布し、恥骨の頭蓋の正中線にプローブを当てて、膀胱を低エコーのランドマークとして特定します(図5)。
注:膀胱が大きすぎて子宮の画像が不明瞭になる場合は、下腹部に穏やかな圧力をかけ、尿を表現できます。 - プローブを膀胱の外側に引いて、子宮角を見つけます。マウスの両側または両側から軽いデジタル圧力を加えて、ホーンを視野に入れます。プローブをマウスに対して垂直に持ち、腹部の両側をスキャンして、両方の角の横方向(断面図)をキャプチャします。プローブを回転させて矢状ビューをキャプチャします。
- 超音波検査の後、ペーパータオルでマウスのゲルをきれいに拭き取り、ケージに戻して回復させます。マウスは2〜5分で完全に目覚めます。完全に目覚めて歩行可能になったら、マウスを動物室に戻します。
注意: 弱火の加熱パッドをケージの下に置いて、回復のためにケージを温めることができます。 - 実験的または人道的なエンドポイントで、マウスを安楽死させます。理想的には、ストレスを軽減するためにホームケージでマウスを安楽死させます。または、マウスをクリーンチャンバーに入れます。加圧されたCO2 を、毎分チャンバ容積の10%〜30%の変位率で送達する。約5分間の目に見える呼吸が見られなくなった後、頸部脱臼による死亡を確認します。腫瘍摘出のために腹部剖検に進みます。
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結果
Pax8-Cre-Arid1a-Pten二重欠失(iPAD)トランスジェニックマウスは、前述のように、混合遺伝的背景(129S、BALB/C、C57BL/6)で維持された14。マウス全員にドキシサイクリン飼料を2週間与えて、Creリコンビナーゼを誘導した。私たちのグループによる以前の研究では、ドキシサイクリンは経管投与14によって投与されました。しかし、この現在の研究では、ドキシサイクリン飼料誘導法が効率的に機能し、マウスの経管栄養のストレスを軽減しました。子宮などのPax8発現細胞の腫瘍抑制因子(Arid1aおよびPten)のDNAを切除するために必要なCreリコンビナーゼ発現を誘導するには、ドキシサイクリン投与法が適切であることを確認することが重要です。図6に示すように、ARID1aおよびpTEN14に対する抗体を用いた免疫組織化学を用いて、隣接する間質組織と比...
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ディスカッション
このプロトコルは、マウスの子宮内の腺癌の進行における子宮形態学的変化を評価するための超音波の有用性を調べます。本研究では、マウスの子宮内膜がんの誘導を縦断的に追跡することにより、超音波によって検出された解剖学的詳細が肉眼的および組織学的病理の指標となることが判明した。これにより、マウスの子宮がんの進行を追跡するために、複数の時点で超音波によって監視された少数のマウスによる縦断的研究の使用への扉が開かれます。この縦方向の検出は、ハンドヘルドプローブを使用し、レールシステムの超音波装置を使用せずに達成されました。使用されている高周波プローブ(トランスデューサ)は広く入手可能であり、このアプローチは世界中の複数の機関で再現可能です。プロトコルの重要なステップには、実験に必要な解像度のレベルに適したプローブの使用と、超音波の前にイメージングするためのマウスの準備が含まれます。
マウスを準備する際の重要なステップは、研究領域からすべての毛を取り除き、腹腔に液体を注入することです。皮膚に残った毛皮は、超音波ゲルに泡を閉じ込める可能性があり、画像にアーティファクトを生成する可能性があります。し...
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開示事項
著者は開示する利益相反を持っていません。
謝辞
NCI卵巣がん胞子プログラムP50CA228991、ポスドク研修プログラム5T32OD011089、ジョンズ・ホプキンス大学のリチャード・W・テリンデ基金からの資金提供に感謝している。また、私立学校振興・共済機構の私立高等教育機関への経常支出補助金も一部賄いました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 動物の世話に使用される試薬および機器 | |||
| げっ歯類の食事療法(2018、625ドキシサイクリン) | Envigio | TD.01306 | Mouse Feed |
| Reagents and Equipment Used for Ultrasound Imaging | |||
| 10 mL Injectable 0.9% NaCl | Hospira, Inc | RL-7302 | アイソトニック液 |
| 吸収パッド | Daigger | EF8313 | 吸収パッド |
| 麻酔誘導チャンバー | ハーバード製装置 | 75-2029 | 誘導チャンバー |
| 麻酔吸収キット アブソーバーキャニスター、ホルダー、チューブ、アダプター付き | CWE, Inc | 13-20000 | ノーズコーンとチューブ |
| アクアソニッククリア超音波ゲル(0.25リットル) | Parker Laboratoies | 08-03 | ゲル |
| BD Plastipak 3 mLシリンジ | BDバイオサイエンス | 309657 | リンジ |
| F /エアスカベンジャーチャコールキャニスターOMNICON | 80120 | ||
| イソフルラン用清掃システム、USP | Vet One | 502017 | 麻酔剤 |
| M1050非再呼吸移動式麻酔器 | Scivena Scientific | M1050 | 麻酔気化器 |
| MX550S、25-55 MHzトランスデューサー、15mm、リニア | VisualSonics | MX550S | 超音波トランスデューサー(プローブ) |
| Nair Hair Aloe &ラノリン脱毛ローション - 9.0オン | ネール | デピリエイティングクリーム | |
| フィリップスノレルコマルチグルーマーオールインワントリマーシリーズ7000 | リップス北米 | MG7750 | クリッパーPrecisionGlide |
| 25 G 1 "針 | BDバイオサイエンス | 305125 | 針 |
| Puralube眼科軟膏 | Dechra | 17033-211-38 | 点眼薬 |
| Vevo 3100イメージングシステム | VisualSonics | Vevo 3100 | 超音波装置 |
| Vevo LAB 5.6.1 | VisualSonics | Vevo LAB 5.6.1 | 超音波分析ソフトウェア |
| ビニール 加熱パッド カバー付き、12 x 15 インチ | Sunbeam | 731-500-000R | 加熱パッド |
| Wd Elements 2TB 基本ストレージ | Western Digital Elements | WDBU6Y0020BBK-WESN | データ ストレージ |
| 免疫組織化学に使用される試薬および装置 | |||
| 10% w/v ホルマリン | フィッシャー サイエンティフィック | SF98-4 | 組織固定バッファー |
| アニマルフリー ブロッカーおよび希釈剤、R.T.U. | ベクターラボラトリーズ株式会社 | SP5035 | 抗体ブロッカー |
| チャージスーパーフロストプラスガラススライド | VWR4831-703 | ティッシュマウントスライドク | |
| エン酸バッファー | ミリポアシグマ | C9999-1000ML | エピトープ Retrival バッファー (pTEN) |
| Cytoseal – 60 | Thermo Scientific | 8310-4 | スライドシール用樹脂 |
| ゴールドシールカバー ガラス | Thermo Scientific | 3322 | カバースライド |
| ハリス修飾ヘマトキシリン | ミリポアSigma | HHS32-1L | カウンターステインバッファー |
| ハイブリダイゼーションインキュベーター (デュアルチャンバー) | Fischer Scientific | 13-247-30Q | パラフィン |
| ImmPACT DAB 基質、ペルオキシダーゼ (HRP) | Vector Laboratories Inc. | SK-4105 | シグナル現像基板 |
| ImmPRESS HRP ヤギ抗ウサギIgGポリマー検出キット ペルオキシダーゼ | ベクター研究所 | MP-7451 | 二次 IHC 抗体 |
| Oster 5712 デジタルフードスチーマー | オスター | 5712 | エピトープ用野菜スチーマー |
| Retrival rabbit mAB anti-ARID1a | abcam | ab182560 | 一次 IHC 抗体 (1:1,000) |
| rabbit mAB anti-PTEN | Cell Signaling | 9559 | 一次 IHC 抗体 (1:100) |
| Scotts Tap Water Substitute | MilliporeSigma | S5134-100ML | "Blueing" Buffer |
| Tissue Path IV Cassette | Fischer Scientific | 22272416 | Tissue Fixation Cassette |
| Trilogy Buffer | Cell Marque | 920P-10 | エピトープ Retrival バッファー (ARID1a) |
参考文献
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再版と許可
