Method Article

蛍光アッセイまたはフローサイトメトリーを使用したカスパーゼ活性の測定

DOI:

10.3791/64745

⸱

March 24th, 2023

 ,  , 
1Institute of Experimental Immunology, University of Zürich

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本プロトコルは、フローサイトメトリーまたは分光蛍光光度計を使用して蛍光発生基質を介してカスパーゼ活性を測定する2つの方法を記載する。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

カスパーゼとして知られるシステインプロテアーゼの活性化は、複数の形態の細胞死において依然として重要なプロセスです。カスパーゼは、プログラムされた細胞死の最も研究されている形態であるアポトーシスの重要な開始者および実行者です。アポトーシスは発生過程で起こり、組織の恒常性において必要な事象である。パイロトーシスは、カスパーゼを利用する別の形態の細胞死であり、インフラマソームの活性化を通じて免疫系を活性化する重要なプロセスであり、その結果、インターロイキン-1(IL-1)ファミリーのメンバーが放出されます。カスパーゼ活性を評価するために、標的基質を評価することができます。ただし、単一細胞または低レベルの活性を調べる場合、感度が問題になる可能性があります。蛍光発生基質を集団ベースのアッセイまたはフローサイトメトリーによるシングルセルアッセイでどのように使用できるかを示します。適切なコントロールでは、異なるアミノ酸配列を使用して、どのカスパーゼが活性であるかを識別できます。これらのアッセイを用いて、腫瘍壊死因子(TNF)刺激によるアポトーシスタンパク質の阻害剤の同時消失が確認されており、これは主に他の形態の細胞死ではなくマクロファージにおいてアポトーシスを誘導する。

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

カスパーゼは、いくつかの形態のプログラム細胞死に関与しています。アポトーシスは、プログラムされた細胞死の最も研究されている形態であり、カスパーゼ活性に関連しています1。すべてのカスパーゼは、大小の触媒サブユニットを持っています。カスパーゼ-1、カスパーゼ-4、カスパーゼ-5、カスパーゼ-9、およびカスパーゼ-11はカスパーゼ活性化およびリクルートメントドメイン(CARD)を有し、カスパーゼ-8およびカスパーゼ-10はデスエフェクタードメイン(DED)2,3,4,5を含む(表1)。アポトーシスは、外因性経路と内因性経路の2つの主要な経路によって開始できます。外因性アポトーシス経路は、腫瘍壊死因子スーパーファミリー(TNFSF)の一部である死受容体によって引き起こされます。死の受容体はDEDドメインを有し、カスパーゼ-8活性を促進します6。内因性アポトーシス経路は、アポトソームの形成後のカスパーゼ-9の活性化を含み、シトクロムcおよびApaf-17の放出を必要とする。イニシエーターカスパーゼ、カスパーゼ-8またはカスパーゼ-9のいずれかの活性化は、カスパーゼ-3、カスパーゼ-6、およびカスパーゼ-7である実行者カスパーゼの切断とその後の活性化につながります。実行者カスパーゼが活性であることを特定することは、細胞がアポトーシスを受けていることを示しており、この活性化は細胞死の様式を定義する上で重要な要素と考えられています。

カスパーゼ活性化は、炎症を調節し、プログラムされた細胞死の代替形態を誘導するための重要な分岐点でもあります。例えば、カスパーゼ-1の活性化は、インターロイキン-1ファミリーの炎症誘発性サイトカインの成熟をもたらす8。このファミリーからのサイトカイン、特にIL-1βおよびIL-18の放出および活性化は、原形質膜におけるガスダーミンD切断および孔形成から生じる9,10。ガスダーミンD孔の不十分な膜修復は、パイロトーシス11として知られる一種の細胞死を引き起こす可能性があります。さらに、カスパーゼ-8活性は、ネクロプトーシス12として知られるカスパーゼ非依存性細胞死の阻害をもたらす。受容体相互作用セリン/スレオニンプロテインキナーゼ1(RIPK1)は、ネクロトーシスおよびNF-kBによって調節される炎症の促進における重要な因子の1つです。 モデルは、RIPK1がカスパーゼ-8によって切断され、NF-kBシグナル伝達、アポトーシス、およびネクロトーシスを制限することを示しています13,14。したがって、異なるカスパーゼの活性を特定することは、結果として生じる炎症および細胞死のモダリティを理解するのに役立ちます。

細胞死様式の調節におけるカスパーゼの機能とは無関係に、カスパーゼ活性は、感染に応答して、インターフェロン(IFN)などの他のサイトカインファミリーも調節することができる15,16。さらに、カスパーゼは、細胞運命の決定、組織の修復と再生、DNA修復による腫瘍形成、ニューロンのシナプス機能など、非細胞死機能に関与しています。これらの非致死的役割におけるカスパーゼの活性は、細胞局在およびカスパーゼの量によって制限されると考えられている。したがって、カスパーゼ活性のレベルを定量化することは、細胞が細胞死を受けるかどうか、またはカスパーゼが非細胞死機能において役割を果たすかどうかを適切に定義することができる4,17,18。

カスパーゼ活性は、複数の方法で評価することができる。切断されたカスパーゼとその基質のウェスタンブロッティングは活性の指標として使用されてきましたが、これらのアッセイはせいぜい定性的です。カスパーゼ活性が細胞死と関連しているかどうかを判断するには、定量的測定が理想的です。カスパーゼは4つのアミノ酸からなる認識部位で基質を切断するため、比色法、発光法、蛍光法が開発されている。しかしながら、カスパーゼは、それらの基質認識において可塑性を有するように見える19,20。認識配列はタンパク質ドメインと会合していない(表1)。しかしながら、テトラペプチド配列DEVDは、カスパーゼ−3およびカスパーゼ−7活性を検出するために使用することができる20,21。

Smac模倣体は、アポトーシスタンパク質(IAP)の阻害剤を標的とする化合物です。がん細胞のサブセットでSmac模倣体を使用すると、細胞はTNF誘発性細胞死に敏感になります22。一次マクロファージでは、Smac模倣体はTNF23,24の外因性添加なしに細胞死を引き起こす。Smac模倣体誘導分解によるcIAP1の喪失は、TNFの産生をもたらす。カスパーゼ活性が検出された場合、これは細胞がネクロトーシスによって死滅したのではなく、アポトーシス様式で死滅したことを意味します。この方法では、切断されたDEVD基質の検出を使用して、カスパーゼ-3/カスパーゼ-7活性を同定します。アポトーシス細胞死を確認するためのさらなる実験が以前に発表されている24。

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究は、チューリッヒ大学の動物倫理委員会(#ZH149/19)の承認を得て、ガイドラインに従って実施されました。本研究では、特定の病原体フリー(SPF)条件で飼育および飼育された、8〜16週齢の雄C57Bl / 6Jマウスを使用しました。無傷の骨は、2%熱不活化ウシ胎児血清(FBS)を含む滅菌ハンク緩衝生理食塩水(HBSS)で氷上に保つことができます。骨髄は分化当日にマウス25 の大腿骨及び脛骨から採取した。カスパーゼ活性を評価するための両方の方法は、初代および形質転換の両方を含む他の細胞型に使用することができる。

1. 骨髄由来マクロファージ(BMDM)の鑑別

注:組織培養層流フードですべての手順を実行し、滅菌無菌技術を使用します。

  1. 21 Gの針が付いた1 mLのシリンジを準備します。










  6. figure-protocol-1



Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

初代マウスマクロファージを6日間分化させた。6日後、細胞を回収し、カウントし、播種した。以下の処理を使用しました:無処理およびSmac模倣体(化合物A)22を250 nMおよび500 nMで16時間使用しました(図1)。カスパーゼ-3/カスパーゼ-7の活性化を集団ベースのアッセイまたはフローサイトメトリーを用いた単一細胞分析のいずれかで評価できるように、実験を二重に実施しました。

細胞溶解物のタンパク質濃度をBCAアッセイを用いて定量した(補足表1)。これは、カスパーゼ-3/カスパーゼ-7活性アッセイで使用されるタンパク質の量がサンプル間で同じであることを確認するために必要です。この集団ベースのアッセイでは、データは2つの方法で提示できます。1つ目は、調整された蛍光(y軸)と時間(x軸)をプロットすることにより、動態を示すことです(図2A)。あるいは、傾きを計算してサンプルを直接比較することもできます(図2B)。500 nM Smac模倣処理時の傾きの増加は、多重比較による通常の一元配置分散分析に基づいて有意ではありませんでした(Dunnettの多重比較検定28)。

フローサイトメトリーを用いたカスパーゼ-3/カスパーゼ-7活性の分析のために、細胞および上清を回収した。未染色細胞または蛍光マイナス1を陰性対照として使用し、ならびに未処理細胞とした。フローサイトメトリーによって収集された細胞のヒストグラムは、未処理の細胞と比較して、Smac模倣体で処理された細胞の蛍光のシフトを示しました(図2C)。データは、蛍光強度の中央値(図2D)または未処理細胞の倍率変化(図2E)のいずれかとして示すことができます。

figure-results-1
図1:研究のフローチャート 。 (A)大腿骨と脛骨をC57Bl/6マウスから切除した。骨をフラッシュし、20 ng / mL M-CSFで6日間分化させました。(B)6日目に、マクロファージを回収し、処理のために再播種した。1セットの細胞をライセート用に回収し、蛍光発生活性によって評価し、もう1セットを回収し、蛍光発生基質とともにインキュベートし、フローサイトメトリーで評価しました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-2
図2:フローサイトメトリーによるカスパーゼ-3/カスパーゼ-7活性および基質切断の速度論的アッセイ。 (A,B)フローサイトメトリーによるカスパーゼ-3/カスパーゼ-7活性(C-E)および基質切断の速度論的アッセイの代表的なデータ。マクロファージを2つの濃度のSmac模倣体(化合物A;250nMおよび500nM)で16時間処理した。 (A)切断されたDEVD AFC基質の経時的な検出。データは、サンプル中のタンパク質濃度に対して標準化した。(B)各サンプルのDEVD AFCの切断速度(スロープ)を未処理のスロープに正規化し、未処理の細胞に対するフォールド変化として提示しました。(C)カスパーゼ-3基質と共にインキュベートした細胞のフローサイトメトリーヒストグラム。(D,E)未処理サンプルと比較したMFIの比較および倍率変化。各データポイントは独立したサンプルを表します。平均±平均の標準誤差が表示されます。*p < 一元配置分散分析と多重比較検定(ダネットの多重比較検定)を用いて0.05。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

カスパーゼ種基板配列タンパク質ドメイン
カスパーゼ-1高さ、ミリメートル(長さ)ティッカーCARD, 大規模ドメイン, 小触媒ドメイン
カスパーゼ-2高さ、ミリメートルデックスCARD, 大規模ドメイン, 小触媒ドメイン
カスパーゼ-4ティッカー(長さ)ティッカーCARD, 大規模ドメイン, 小触媒ドメイン
カスパーゼ-5ティッカー(長さ)ティッカーCARD, 大規模ドメイン, 小触媒ドメイン
カスパーゼ-9高さ、ミリメートル(入出力/対面/左)E(H/T)DCARD, 大規模ドメイン, 小触媒ドメイン
カスパーゼ-11ミリメートル(長さ)ティッカーCARD, 大規模ドメイン, 小触媒ドメイン
カスパーゼ-12ミリメートルティッカーCARD, 大規模ドメイン, 小触媒ドメイン
カスパーゼ-8高さ、ミリメートル(入出力/対面/左)E(H/T)DDED、大規模ドメイン、小触媒ドメイン
カスパーゼ-10ティッカー(入出力/対面/左)E(H/T)DDED、大規模ドメイン、小触媒ドメイン
カスパーゼ-3高さ、ミリメートルデックス大ドメイン、小触媒ドメイン
カスパーゼ-6高さ、ミリメートル(入出力/対面/左)E(H/T)D大ドメイン、小触媒ドメイン
カスパーゼ-7高さ、ミリメートルデックス大ドメイン、小触媒ドメイン
カスパーゼ-14HS、MM(長さ)ティッカー大ドメイン、小触媒ドメイン
カードカスパーゼ活性化およびリクルートメントドメイン
デッドデスエフェクタードメイン
ティッカーホモサピエンス
ミリメートルムス・ムスクルス

表1:カスパーゼの基質特異性とタンパク質ドメイン。 この表はMcStayら20から改作されています。シャリーニら3;ヴァン・オプデンボッシュとラムカンフィ4.

補足表1:DEVD速度論的分析。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この方法では、蛍光発生基質を集団ベースのアッセイまたはシングルセル分析に使用して、カスパーゼ-3/カスパーゼ-7活性を測定します。どちらの方法も、基質の切断に基づいて定量的な方法でカスパーゼ活性を測定します。1つの利点は、これらの方法を多数のサンプルに利用できることです。これらの方法では、カスパーゼ-3/カスパーゼ-7活性がSmac模倣体で処理された一次マクロファージで検出されます。

ポピュレーションベースの蛍光測定アッセイの重要な側面は、溶解から蛍光の読み取りまでの時間です。サンプルは、手順全体を通して、特にアッセイを「読み取る」前に氷上に保管する必要があります。これにより、基質の早期切断および蛍光が防止される。ポピュレーションベースのアッセイを使用すると、必要な最適化が少なくて済みます。アッセイで使用されるタンパク質の量は正規化され、サンプルを直接比較することができます。1つの注意点は、アポトーシス細胞死の後期段階で、総タンパク質量が減少することです。したがって、カスパーゼ活性の検出が不可能な場合があります。この問題を回避するために、異なる動態または異なる治療用量が推奨される。さらに、この方法に記載されるソフトウェア以外の他のソフトウェアを使用して、カスパーゼ活性の速度を正確に評価することができる。

フローサイトメトリーアッセイでは、集団を確実にゲートするのに十分なイベントまたは細胞が必要です。さらに、基質と細胞数の最適な比率を達成するために、フローベースのアッセイにおけるさらなる最適化が必要になる場合があります。ただし、フローサイトメトリーでは、この方法は、細胞型識別のための細胞表面マーカーなどの追加パラメーターの測定に役立ちます。

ポピュレーション法とシングルセル法の両方が他のカスパーゼに使用することができます。ただし、認識シーケンスは他のカスパーゼに対してあまり識別されないことを覚えておくことが重要です。そのため、カスパーゼ活性のための他の方法を使用しなければならない。これには、カスパーゼ活性の阻害、特定のカスパーゼのCRISPRまたはノックダウン、および既知の基質の切断を検出するためのウェスタンブロッティングが含まれます。

カスパーゼ活性を検出するための代替方法の1つは、タイムラプスイメージングです。同じ透過性カスパーゼ基質を、アネキシンVなどの他の生存マーカーとともに使用して、細胞死の動態に関する情報を提供することができます。イメージングはまた、カスパーゼ活性と細胞生存を分離し、細胞集団における致死量のカスパーゼ活性の検出を可能にする。カスパーゼ-3/カスパーゼ-7の非致死機能は、自然免疫細胞29における抗ウイルス調節、特にミトコンドリアDNA放出を介したI型IFNの活性化に関連しています15,16。したがって、カスパーゼ活性を測定するためのこれらのアッセイは、細胞死の異なるモードを同定するために重要であり、非細胞死機能の評価に有用であり得る。

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は開示する利益相反を持っていません。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

WWWはClöetta Medical Research Fellow grant、S.R.はCanDoc UZH Forschungskredit、J.T.はChina Scholarship Councilの支援を受けています。

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mLマイクロチューブSarstedt72.706.400
15 cm ペトリプレートSarstedt82.1184.500
37 度インキュベーターシェーカーIKA シェーカー KS 4000i97014-816VWR
6ウェル細胞培養ディッシュSarstedt83.392
96 ウェル平底、白色ポリスチレン、非滅菌シグマCLS3600
96ウェルフラットプレートSarstedt82.1581
Ac-DEVD-AFCEnzo Life SciencesALX-260-032-M005Caspase-3 substrate
BD FortessaBD適切な励起および発光検出器を備えた任意のフローサイトメーターは、
b-グリセロールリン酸SigmaG9422-10G
カスパーゼ-3組換え体を作動させます Enzo Life SciencesALX-201-059-U025
CHAPSSigma1.11662
DMEM、低グルコース、ピルビン酸サーモサイエンティフィック31885023
DMSOSigmaD8418-250ML
EDTASigma03685-1KG
EGTASigma324626-25GM
エトポシドMedChemExpressHY-13629
FBSThermoscientific26140
フローサイトメトリーチューブFalcon352008
FlowjoFlowjoライセンスが必要ですが、.fcs ファイルを分析できるプログラムであれば、
グリセロールSigmaG5516-500ML
HEPESSigmaH4034
で十分です。Magic Redカスパーゼ-3/7アッセイキット;フローサイトメトリーまたはイメージング免疫化学技術935
M-CSFebioscience14-8983-80現在、Thermoscientific
M-PlexTecan蛍光リーダーは、適切な励起および発光検出器
NaClRoth3957.1
PBS pH 7.4Thermoscientific10010023
ペニシリン-ストレプトマイシン-グルタミン (100X)Thermoscientific10378016
Pierce BCA Protein Assay KitThermoFisher Scientific23225protein concentration assay
protease inhibitorsBiomolP9070.100
Smac mimetic, Compound ATetralogicsalso known as 12911; Vince et の補足図に示される構造、セル2007
ッ化ナトリウムシグマS7920-100G
オルトバナジン酸ナトリウムシグマS6508-10G
ピロリン酸ナトリウムシグマP8010-500G
スタウロスポリンMedChemエクスプレスHY-15141
ショ糖シグマ1.07687
トリスベースシグマT1503-1KG
Triton X100SigmaT8787-50ML
TrypLEThermoscientificA1285901プロトコルでは、トリプシンとしてリストされています
の子会社である任意のフ

References

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