方法論記事

ヒートブロックを用いた動物プランクトンの熱限界決定

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DOI：

10.3791/64762

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2022年11月18日

 ,  , 
1Biology Department, Swarthmore College

この記事について

サマリー

本プロトコルは、安定かつ直線的な温度勾配を生成するための市販のコンポーネントの使用を示す。このような勾配は、次に、プランクトン生物、特に無脊椎動物の幼虫の上限熱限界を決定するために使用できます。

要約

熱限界と幅は、種の分布を予測するために広く使用されてきました。地球の気温が上昇し続ける中、熱限界が順応によってどのように変化するか、そしてそれがライフステージと個体群の間でどのように変化するかを理解することは、将来の温暖化に対する種の脆弱性を決定するために不可欠です。ほとんどの海洋生物は、初期の浮遊段階を含む複雑なライフサイクルを持っています。これらの小さな初期発生段階(数十〜数百ミクロン)の熱限界を定量化することは、発生のボトルネックを特定するのに役立ちますが、このプロセスは、標的生物のサイズが小さく、ベンチスペースの要件が大きく、初期製造コストが高いため、困難な場合があります。ここでは、少量(mLから数十mL)を対象としたセットアップを紹介します。このセットアップは、市販のコンポーネントを組み合わせて、安定した線形温度勾配を生成します。セットアップの生産仕様、および生きている個体と死亡した個体を導入および列挙し、致死温度を計算する手順も提示されます。

概要

熱耐性は、生物の生存と機能の鍵です1,2。人為的な炭素排出により地球が温暖化し続けるにつれて、熱限界の決定と適用にますます注意が払われています3。死亡率、発達障害、移動性の喪失などのさまざまなエンドポイントを使用して、熱限界の上限と下限の両方を決定してきました4。これらの熱限界は、生物の熱的ニッチの代理と見なされることがよくあります。この情報は、地球温暖化に対してより脆弱な種を特定し、将来の種の分布と結果として生じる種の相互作用を予測するために使用されます3,5,6,7。ただし、特に小さなプランクトン生物の場合、熱限界を決定することは困難な場合があります。

浮遊生物、特に海洋無脊椎動物の幼虫期の場合、熱限界は慢性暴露によって決定することができます。慢性曝露は、幼虫を数日から数週間にわたっていくつかの温度で飼育し、幼虫の生存率および/または発育率が8,9,10を低下させる温度を決定することによって達成されます。ただし、このアプローチはかなり時間がかかり、大型のインキュベーターと幼虫飼育の経験が必要です(海洋無脊椎動物の幼虫の養殖に関する優れた紹介については、参考文献11を参照してください)。

あるいは、熱応力への急性暴露を使用して熱限界を決定することもできます。多くの場合、この決定アプローチは、幼虫を含む小さなバイアルを温度制御されたドライバス12,13,14に入れ、PCRサーマルサイクラー15,16の温度勾配機能を活用するか、バイアルがぴったりと収まる穴のある大きなアルミニウムブロックの端部に加熱および冷却を適用することによって生成された温度勾配に沿ってガラスバイアル/マイクロ遠心管を配置することを含む17、18,19。典型的なドライバスは単一の温度を生成します。したがって、複数のユニットを同時に操作して、温度範囲での性能を評価する必要があります。サーマルサイクラーはグラジエントを生成しますが、少量のサンプル(120 μL)にしか対応できず、慎重な操作が必要です。サーマルサイクラーと同様に、大きなアルミニウムブロックは線形で安定した温度勾配を作り出します。どちらのアプローチも、ロジスティック回帰またはプロビット回帰と組み合わせて、人口の50%の致死温度を計算することができます(LT50)12、20、21。ただし、使用されたアルミニウムブロックの長さは~100 cmでした。このサイズでは、広いラボスペースと、穴を開けるための特殊なコンピューター数値制御フライス盤へのアクセスが必要です。目標温度を維持するために2つの研究グレードの水浴を使用することとともに、セットアップを組み立てるための経済的コストは高くなります。

したがって、この研究は、市販の部品を使用して安定した線形温度勾配を生成するための代替手段を開発することを目的としています。このような製品は、設置面積が小さく、浮遊生物の急性熱応力暴露実験に簡単に使用できる必要があります。このプロトコルは、<1mmの大きさの動物プランクトンを標的生物として開発されたため、1.5mLまたは2mLの微量遠心チューブの使用に最適化されています。より大きな研究生物は、使用する1.5mLの微量遠心チューブよりも大きな容器と、アルミニウムブロックの拡大された穴を必要とします。

この作業は、実験装置をよりアクセスしやすくすることに加えて、データ処理パイプラインを簡素化することを目的としています。市販の統計ソフトウェアは、ロジスティック回帰またはプロビット回帰を使用してLT50 を計算するルーチンを提供しますが、ライセンスコストは重要ではありません。したがって、オープンソースの統計プログラムR22 に依存する使いやすいスクリプトは、データ分析をよりアクセスしやすくするであろう。

このプロトコルは、市販の部品でコンパクトなヒートブロックを製造し、動物プランクトン(サンドダラー デンドラスタエキセントリカスの幼虫)を急性熱ストレスにさらして熱の上限を決定する方法を示しています。

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プロトコル

1.ヒートブロックの製作

  1. 120 V、100 Wストリップヒーターをレオスタットに配線します(材料表を参照)。
  2. 6 x 10のグリッドに60個の穴を開けて、20.3 cm x 15.2 cm x 5 cm(8インチx 5インチx 2インチ)のアルミニウムブロックを準備します( 材料表を参照)。穴が中心から中心まで両方向に2cm離れていることを確認します。それぞれ直径1.1 cm、深さ4.2 cmである必要があります(図1)。
    注意: フライス盤または高速度鋼ドリルビットを備えたドリルプレスで穴あけを実行します。発熱体と冷却要素はどちらも、15.2 cm x 5 cmの表面の接触面をできるだけ多く覆うように選択されました。
  3. 温度コントローラープローブのサイズに合わせて、1列目と2列目、および9列目と10列目の間の20.3 cm x 5 cmの表面の1つに、さらに2つの穴を開けます(材料の表を参照)。
  4. 1.2 cm(0.5インチ)の透明なアクリルシート( 材料表を参照)からケースを構築し、要素を所定の位置に保持し、完成したヒートブロックを断熱します。2層のアクリルを使用して、発熱体の裏側を断熱します(図1)。
  5. 最終アセンブリでは、サーマルペースト( 材料表を参照)を塗布して、発熱体からブロックへ、およびブロックから冷却要素への熱伝導率を最大化します。

2.温度勾配設定の決定

  1. ウォーターバス/水槽チラーをタイゴンチューブに接続します( 材料表を参照)。必要に応じて、チューブをフォームパイプ断熱材で絶縁します。
  2. サーモスタットプローブをアルミニウムブロックの側面の穴に挿入します。プローブ1が発熱体の近くに配置されていることを確認します。
  3. 水道水で縁まで満たした微量遠心チューブ(合計60本)をすべてのミルドホール(合計60本)に置きます。
  4. 温度コントローラーの電源を入れ、プローブ1の加熱停止温度を35〜37°Cに設定し、プローブ2の加熱停止温度を21.5〜22.5°Cに設定します。
    注意: 提案されたサーモスタットには、独立して動作する2つのコンセントがあります。この特定のユースケースでは、プローブ1のみが暖かい温度を調整するために使用されます。そこで、プローブ2の温度を下限温度に設定する。
  5. レオスタットを回転させて発熱体をオンにし、中程度に設定します。
  6. ウォーターバス/水槽チラーの電源を入れ、チラーの温度を15°Cに設定します。
  7. ブロックの一方の端が暖かく、10分後にもう一方の端が冷えていることを確認します。
    注意: 発熱体の露出端は高温になる可能性があります。それらに触れないでください。
  8. その後、K型電極付きの熱電対( 材料表を参照)を使用して、各マイクロ遠心チューブ内の温度を10分ごとにチェックします。温度は~60分後に安定し、直線的に見えます(図2)。
  9. 必要に応じて、温度コントローラーとウォーターバスの設定を変更して、エンドポイントの値を調整します。

3.熱暴露とライブ:デッド列挙

注意: 温度勾配に必要な設定が決定されたら、ステップ2を省略できます。

  1. 再循環水浴とヒーターをオンにして、それぞれ15°Cと37°Cに設定して、19.5°Cから37°Cへの温度勾配を生成します。
  2. 温度勾配が直線的になるように、すべての粉砕穴(合計60本のチューブ)に水道水で縁(1.5 mL)で満たされた微量遠心チューブを配置します。
  3. 45〜60分待って、ヒートブロックを設定温度に到達させます。K型電極を備えた熱電対を使用して各マイクロ遠心チューブ内の温度をチェックし、予想される温度に達したかどうかを確認します。これらの温度に注意してください。
  4. 研究生物のサイズが>500 μmで、ある容器から別の容器(カイアシ類など)に簡単に移動できる場合は、1.5 mLの微量遠心チューブに750 μLの0.45 μmのろ過海水を満たします。または、研究生物が小さい場合は、1.5 mLの微量遠心チューブに250 μLの0.45 μmのろ過海水を満たします。
    注:代表的なデータについては、受精後2、4、および6日目のサンドダラー デンドラスタエキセントリック の幼虫を使用しました( 材料表を参照)。これらの個体の平均(各年齢±S.D.、n = 15)サイズは、それぞれ152 ± 7 μm、260 ± 17 μm、および292 ± 14 μmでした。これらの幼虫が容易に濃縮できることを考えると(ステップ3.5)、マイクロ遠心チューブは750μLの濾過海水で満たされた。
  5. 研究生物がビーカー11の下部に残るように、逆フィルタリングで研究生物の培養物を濃縮する(すなわち、研究生物を保持する容器にメッシュを置き、メッシュの上部から水を除去する)。
    注:研究した幼虫の砂のドルには30μmのナイロンメッシュを使用しました( 材料の表を参照)。
  6. 濃縮された動物サンプルをろ過された海水ですすいでください(例:藻類食品または他の化学物質で培養する場合)。逆ろ過をもう一度繰り返して、動物サンプルを濃縮します。
  7. 既知の数の個々の生物を半分満たされた微量遠心チューブに入れます。解剖顕微鏡( 材料表を参照)で小さな浮遊生物を数え、ガラスパスツールピペットで移します。
    注:配置する生物の数はサイズによって異なります。サイズが~200μmの幼虫の砂の場合、微量遠心管あたり20個体が適切でした。
    注意:一部の浮遊性生物は疎水性であり、プラスチック表面に付着するため、ガラスピペットはプラスチックピペットよりも望ましいです。
  8. 最終容量が1 mLになるまで、動物を含む微量遠心チューブに0.45 μmのろ過海水を追加します。
  9. 生物が徐々に目的の実験温度まで温まるようにするには、ステップ3.7で準備した動物と一緒に微量遠心チューブをコールドエンドからヒートブロックに入れます。各列にマイクロ遠心チューブのペアを配置します(合計12本のチューブ)。
  10. 10分待ちます。
  11. 手順3.9で挿入したマイクロ遠心チューブのペアを、より暖かい温度の隣接するドリル穴に移動します。コールドエンドの各列にマイクロ遠心チューブの追加ペアを配置します。各行に4つのチューブがあります。さらに10分待ちます。
  12. 動物と一緒にマイクロ遠心チューブを追加し続けます ペアでそれらの位置を冷たい端からより暖かい端にシフトすることによって。ヒートブロックが完全にいっぱいになるまで、各シフトの間に10分待ちます。
    注:ステップ3.9〜3.12は、研究生物が経験する温度を徐々に上昇させるためのランプアップフェーズと見なされます。
  13. 動物を指定された温度で2時間インキュベートさせます。このステップは、実験の恒温暴露フェーズです。
    1. インキュベーション期間が2時間を超える場合は、熱電対でマイクロ遠心チューブの温度を1時間ごとにチェックしてください。
      注:実験のニーズに基づいてインキュベーション時間を調整してください。インキュベーションが2時間より長い場合は、予期しない機器障害が発生した場合に備えて、熱電対を使用して定期的にチューブの温度を確認してください。研究生物への妨害を最小限に抑えるために、ろ過された海水のみで満たされた6本以上のマイクロ遠心チューブをランダムに配置して、温度を監視します。
  14. インキュベーション期間の終わりに、K型電極を備えた熱電対を使用して各マイクロ遠心チューブ内の温度を測定します。これらの温度に注意してください。
  15. 動物と一緒に60本の微量遠心チューブをすべて取り外し、事前にラベル付けされたホルダーに入れます。
  16. チューブを飼育温度などの所定の温度で、回復期間である1時間インキュベートします(ステップ3.14)。
    注:回復期間は種固有の場合があります。幼虫の砂のドルは飼育温度が18°Cであったため、サンプルは環境チャンバーに入れられました。関連する文献を参照するか、試行実験を実施して、ライブ:デッドカウントが回復期間の長さの影響を受けないことを確認します。代表的なデータでは、1時間後に生きている動物の数は、回復の12時間または24時間後と同じでした。
  17. 熱暴露後に生きている研究生物の割合を列挙するには、ガラスピペットを使用して個々の微量遠心チューブの内容物を35mmのペトリ皿に移します。
  18. 解剖顕微鏡で、まだ活動している(生きている)個体と、水泳をつかんだり溶解したりした(死んでいる)個体の相対数を観察し、メモします。観察された個体の総数が、ステップ3.7でチューブに入れられた個体の数と等しいことを確認してください。数値が一致しない場合は、マイクロ遠心チューブとペトリ皿の側面を個人の確認します。

4. LT50の計算

  1. 少なくとも次のヘッダーを含むCSV形式のデータテーブルを生成します:関心のあるグループ化変数、°C単位のチューブの温度、生きている個人の数、および死亡した個人の数。
    注: 代表的なデータの場合、年齢グループ間の比較が目的であるため、対象のグループ化変数は年齢に置き換えられます。
  2. ロジスティック回帰でデータを適合させるには、二項分布を持つ一般化線型モデルを使用します。 補足符号化ファイル1 は、オープンソースソフトウェアR22を用いたサンプルスクリプトの一例を示す。
  3. 熱の上限の中央値(LT 50)を決定するには、個人の50%が生存した予測変数値(つまり、温度)を計算します。補足コーディングファイル2は、R22のMASS23から関数dose.pを使用したスクリプト例を示しています。

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結果

このプロトコルの目的は、動物プランクトンの上限熱限界を決定することです。そのためには、安定した直線的な温度勾配が必要です。提案されたセットアップは、ウォーターバス温度を8°Cに設定し、ヒーターを39°Cに設定することにより、14°Cから40°Cの範囲の温度勾配を生成することができました(図2A)。温度勾配は、端点の値を変更することで狭めたりシフトしたりできます。ヒーターを37°Cに、ウォーターバスを15°Cに設定することにより、より狭い範囲(19°C〜37°C)の温度勾配も生成されました。 ブロック内の温度は、セットアップから45分から1時間以内に安定します(図2B)。

動物プランクトンへのこのプロトコルの適用を説明するために、砂のドルの幼虫(デンドラスタエキセントリカス)の個体発生によるLT50で示される上限熱限界の変化を調べました。砂のドルは商業的に入手されました(材料表を参照)。配偶子...

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ディスカッション

このプロトコルは、急性熱曝露を通じて小さなプランクトン生物の熱限界を決定するためのアクセス可能でカスタマイズ可能なアプローチを提供します。下端の水浴と上端のヒーターによって制御される10穴設計と柔軟な温度エンドポイントにより、LT50を正確に決定できます。この方法を使用すると、<1°Cの熱限界の差を検出することができました(図3)。このアプローチは、様々な種の熱限界(時間単位)の迅速な決定を提供し、その結果の値は複数の種の分布モデルに適用されている2,21。ただし、急性曝露は、慢性曝露と比較した場合、異なる熱耐性推定値を提供する可能性が高いことに注意することが重要です8,26。

現在の設計の主な利点の1つは、10の温度処理と6回の反復が小さなフットプリント(20.3 c...

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開示事項

著者は宣言する利益相反を持っていません。

謝辞

この研究は、スワースモア大学[KC]の教員研究基金とBJのロバートレイノルズとルシンダルイス'70サマーリサーチフェローシップによってサポートされています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.45 以上mメンブレンフィルターVWR74300-042
½”アクリルシートMcMaster-Carr8560K266十分な断熱材を備えた隆起したケースを構築するために使用されます。
1 mLシリンジVWR76290-420
2 チャンネル 7 熱電対タイプ データロガーオメガエンジニアリングHH506Aマイクロ遠心チューブ内に収まる任意の温度計と交換可能
自動ピペット ラニン 
ボルトおよびクランプマウントストリップヒーター
、430ステンレス鋼シース、120V AC、1-1 / 2 "幅、100W		McMaster-Carr3619K32
クリスタルシーバイオアッセイミックスペンテアCM2B人工海水を作るために使用 
Denraster excentricusM-Rep カリフォルニアからのサンドダラー 
解剖顕微鏡 ニコン SMZ645
DIYhzアルミニウム水冷ブロック、PCコンピューターCPUグラフィックスラジエーターヒートシンク用液体ウォータークーラーヒートシンクシステムシルバー(40 mm x 120 mm x 12 mm)Amazonバスに接続し、ブロックの一端を冷却するために使用されます。
加工が簡単なMIC6鋳造アルミニウムシート2インチ厚8インチx 8インチ McMaster-Carr86825K953インチ x 6インチ x 8インチに機械加工され、60個の等間隔の穴(直径11 mm、深さ42 mm)があり、片側にサーモスタットプローブ用の2つの追加穴が開けられています。
経済的な適用範囲が広いポリエチレンの泡の管の絶縁材McMaster-Carr4530K121熱損失を減らすためにチラーとブロック間のプラスチック管を覆う。温度範囲が室温に近い場合は省略できます 
EVERSECU 72w 110-240v 水槽用ウォーターチラー ウォーマー/クーラー温度コントローラー 魚用 エビタンク マリンコーラルリーフタンク 20 L/30 L アクアリウムチラーアマゾンラボグレードのウォーターバスの代わりに使用できます 
幼虫の砂のドルの例 
GENNEL 100 g銀製シリコーン熱伝導性コンパウンドグリースペーストGPU CPU IC LEDオーブン冷却アマゾン用 ブロックと加熱および冷却要素との間の熱伝導率を改善します。
Inkbird WiFi爬虫類サーモスタット温度コントローラー、2つのプローブと2つのアウトレット、IPT-2CH爬虫類ヒートマットサーモスタット(コンセントあたり最大250 W)Amazonはホットエンドとコールドエンドを監視します。範囲のホットエンドを維持します
ラウダエコラインシルバー空冷冷蔵サーキュレーターVWR89202-386水族館のチラーと交換できます 
微量遠心チューブVWR76019-014より大きな動物を使用する場合は、スキャンバイアル(VWR 66022-004)が適しています 
Nitexメッシュフィルター 自作/2インチPVCチューブに取り付けられたNitexメッシュにホットグルーを使用 
パスツールピペットVWR14673-010
塩化カリウム (0.35 m) ミルポアシグマP3911-500G
R統計ソフトウェア。統計計算
シリンジニードルVWR89219-346対象生物のサイズに応じて、gague 14および16を使用することができます
Tygon Tubing McMaster-Carr5233K65チラーとブロックに合わせて調整します 
Zoo Med Repti Temp RheostatChewy.com定格は 150 W で、発熱体に直接供給するように再配線されています。熱出力の速度を制御するために使用されます
ウォーター 2 1のためのRプロジェクト使用する

参考文献

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