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方法論記事

インテリジェントハイスループット抗菌感受性試験/ファージスクリーニングシステムの適用と薬剤耐性指数

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DOI:

10.3791/64785

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2023年7月21日

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1Shandong Key Laboratory of Animal Disease Control and Breeding, Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences, P.R. China, Key Laboratory of Livestock and Poultry Multi-omics of MARA, 2Department of Genetic and Genomes Biology, University of Leicester, 3College of Veterinary Medicine, Nanjing Agricultural University

この記事について

サマリー

ここでは、インテリジェントなハイスループット抗菌感受性試験/ファージスクリーニングシステムの原理、構造、および指示を紹介します。その応用例は、中国山東省の家禽から分離された サルモネラ菌 を例にとります。Lar指数を算出し、薬剤耐性の評価におけるその意義を総合的に論じる。

要約

耐性菌に対する抗菌剤感受性試験(AST)およびファージハイスループットスクリーニングの効率を向上させ、検出コストを削減するために、AST基準および臨床検査基準協会(CLSI)によって策定された耐性ブレークポイント(R)に従って、96ドットマトリックス接種器、画像取得コンバーター、および対応するソフトウェアを含むインテリジェントなハイスループットAST/ファージスクリーニングシステムが開発されました。中国山東省の家禽から分離された1,500株の サルモネラ 菌株のASTおよび最小発育阻害濃度(MIC)分布(R / 8から8R)の統計を、10の抗菌剤に対してインテリジェントなハイスループットAST/ファージスクリーニングシステムによって実施しました。Lar指数は、「抗生物質が少なく、耐性が少なく、抗生物質がほとんどなくなるまで残存する」という意味で、各MICの加重平均を計算し、Rで割ることによって得られました。このアプローチは、耐性菌株の抗菌薬耐性(AMR)の程度を特徴付けるために耐性の有病率を使用する場合と比較して、精度が向上します。AMRの高い サルモネラ 菌株については、このシステムによりファージライブラリーから溶解性ファージを効率的にスクリーニングし、溶解スペクトルを計算および分析しました。その結果、インテリジェントなハイスループットAST/ファージスクリーニングシステムは、操作性、精度、高効率、安価、メンテナンス性が高いことが示されました。山東省の獣医用抗菌薬耐性モニタリングシステムと組み合わせることで、AMRに関連する科学研究や臨床検出に適していました。

概要

細菌性感染症の予防に抗菌薬が広く用いられる中、薬剤耐性(AMR)は世界的な公衆衛生上の問題となっています1。AMRとの闘いは、疫学的病原体のAMRのモニタリングと、感受性抗菌剤と溶解性バクテリオファージの相乗療法の現在の主要な使命です2。

in vitro 抗菌薬感受性試験(AST)は、治療のモニタリングとAMRレベルの検出の主力です。抗菌薬理学の重要な部分であり、臨床薬学の重要な基盤です。米国の臨床検査基準協会(CLSI)と欧州抗菌剤感受性試験委員会(EUCAST)は、ASTの国際基準を策定および改訂し、ASTメソッドとブレークポイントを継続的に修正および補足して、特定の「生物-抗菌剤」の組み合わせのMICを感受性(S)、耐性(R)、または中間体(I)として決定しました3。4.

1980年代から1990年代にかけて、Alfred 60AST、VITEK System、PHOENIXTM、Cobasbact 5,6,7などの例で、自動マイクロブロス希釈装置が急速に開発され、臨床診療に適用されました。しかし、これらの機器は高価で、高コストの消耗品が必要であり、その検出範囲は臨床患者の投薬用に設計されていました5,6,7。これらの理由から、獣医の臨床検査や大量の高耐性株の検出には適していません。本研究では、96ドットマトリックス接種装置(図1)、画像取得コンバーター(図2)、および対応するソフトウェア8を含むインテリジェントなハイスループットAST/ファージスクリーニングシステムを開発し、寒天希釈法により複数の抗菌剤に対して一度に細菌株のバッチのASTを実施しました。さらに、このシステムは、薬剤耐性菌に対するファージの溶解パターンの検出と分析にも使用され9、ファージライブラリーから溶解性ファージを効率的に選択しました。このシステムは、効率的で、手頃な価格で、操作が簡単であることがわかりました。

figure-introduction-1
図1:96ドットマトリックス接種器の構造図。 1:接種ピンプレート。2:携帯電話会社;3:シードブロック;4:インキュベートプレート;5:ベース;6:操作ハンドル;7:リミットピン。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

figure-introduction-2
図2:画像取得コンバータの構造図。 1:シェル;2:表示画面;3:画像取得室。4:検出板基盤;5:倉庫の内外の検出板;6:コントロールボード;7:画像取得変換装置と、8:光源;9:イメージスキャナー。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

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プロトコル

本研究で使用した サルモネラ菌 株は、中国山東省農業科学院畜産獣医学研究所バイオセーフティ委員会の承認を得て、中国山東省の家禽から採取されたものです。

1. インテリジェントハイスループットASTシステムの応用8

  1. 接種剤の調製
    1. 品質管理生物である大腸菌と93のサルモネラ菌株をインキュベートし、ミューラーヒントン寒天(MHA)プレート上でASTを試験します。
    2. CLSI標準で指定されている方法に基づいて、0.5マクファーランド濁度標準に一致するように各菌株の接種体を調製し、3とした後、10倍に希釈します。
    3. 200 μL の滅菌生理食塩水をネガティブコントロールとして 96 ウェルプレートの水平 1 番目のウェル (A1) に入れ、品質管理生物の 2 つの懸濁液をポジティブコントロールとして水平の 2番目と 3番目のウェル (A2 と A3) に入れ、品質管理を行います。試験した各染色の希釈した接種懸濁液200 μLを、96ウェルシードブロックの対応する93ウェルに加えます。
  2. 抗菌寒天プレートの調製
    1. Lar指数の計算範囲(0.125Rから8R)に従って、テストされたさまざまな抗菌剤の濃度範囲を設定します。濃度は、品質管理範囲または 0.0625R (より低い範囲の対象) から 8R の範囲です。
      注:Lar指数が計算されない場合は、ASTのニーズに応じて抗生物質濃度の範囲を設定できます。
    2. CLSI標準3で指定されている寒天希釈法に基づいて、適切なストック濃度から始まる抗生物質溶液のlog2倍増希釈スキームを実行します。
    3. 18 mLのMueller-Hinton寒天培地を含む50 mLのガラス瓶を滅菌します。45〜50°Cに冷却した18 mLの溶融培地に適切な希釈液2 mLを加え、完全に混合し、バイオセーフティキャビネット内のプレートに注ぎます。
    4. 寒天を室温(RT)で固化させ、インキュベートプレートの蓋の下に隙間を残し、吹き飛ばして寒天表面を乾燥させてから接種します。
    5. インキュベートプレートの裏側に抗菌剤の種類と濃度をラベル付けします。各抗菌剤の複数のインキュベートプレートを、log2倍の希釈順でスタックに配置します。
    6. 各抗菌剤のコントロールとして、2枚の薬剤を含まない寒天プレートを調製します。
  3. 96ドットマトリックス接種器の接種手順
    1. オートクレーブ処理した接種ピンプレートを、バイオセーフティキャビネット内の96ドットマトリックス接種器の支持体に取り付けます。
    2. 準備したシードブロックを、試験した菌株と寒天インキュベートプレートとともに、2つのプレートの位置決め角度を同じにしてモバイルキャリアに置きます。
    3. シードブロックが接種ピンプレートの真下に来るように携帯電話キャリアを押します。
    4. 操作ハンドルを押し、接種ピンプレートを下に動かし、96本のピンをシードブロックの96ウェルの接種器に向けます。
    5. 操作ハンドルをコントロールで放し、スプリングの作用で接種ピンプレートをリセットします。
    6. 操作ハンドルを2〜3回押して、各接種物をよくかき混ぜ、浸します。インキュベートプレートが接種ピンプレートの真下になるように、キャリアプレートを押して動かします。
    7. 操作ハンドルを押し、接種ピンプレートを下に動かし、1〜2秒間停止して、接種ピンがインキュベートプレートの表面に完全に接触するようにします。
    8. 操作ハンドルを放します。これで1回の接種は完了です。別のインキュベートプレートを交換し、抗菌寒天プレートの1つのグループが終了するまでサイクルを続けます。
    9. 別の接種ピンプレートとシードブロックを交換し、テストされた株の別のグループに接種します。すべての接種が完了するまでサイクルします。
      注:最初にコントロール寒天プレート(抗菌剤なし)を接種し、次に薬物濃度の低いものから高いものの順にプレートを接種し、最後に2番目のコントロール寒天プレートを接種して、汚染や抗菌剤のキャリーオーバーがないことを確認します。接種量は、約2μLの各ピンの自然沈着量に依存します。
  4. 抗菌寒天プレートのインキュベーション
    1. 接種した抗菌寒天プレートを室温で、接種斑の水分が寒天に吸収されるまでインキュベートします。
    2. プレートを反転させ、試験した菌株について37°Cで16〜20時間インキュベートして、抑制されていない細菌がコロニーを形成することを確認します。
  5. 画像取得とデータ統計
    1. 96ドットマトリクスAST画像取得システムをダブルクリックしてプログラムを開きます。
    2. タスクバーの[ テスト情報 ]をクリックします。 [新規 ]をクリックして新しいテストタスクを作成し、プロンプトに従って、コード、名前、ソース、細菌、菌株数、抗生物質、グラジエントなどの情報を入力します。
    3. [データ収集] > [ 写真] > [テスト項目] をクリックして、作成した新しいタスクを選択します。抗生物質の名前を選択するには抗生物質をクリックし、この 抗生物質 の初期濃度を選択するには グラジエント をクリックします。
    4. [接続]をクリックして、画像取得コンバーターに接続します。
    5. 対応するインキュベートプレートを検出プレートベースに置き、角度が欠けている方向を右前方に向け、画像取得コンバーターに押し込みます。
    6. [コレクション]をクリックして画像を取得します。抗生物質のグラジエントは、自動的に次のグラジエントにジャンプします。次のプレートを順番に置き、この抗生物質のプレートが収集されるまで[収集]をクリックし続けます。
    7. 抗生物質をクリックし、次のインキュベートプレートのセットを選択します。[グラデーション]をクリックして開始グラデーションを選択し、画像コレクションの次のラウンドに進みます。
    8. すべてのコレクションが完了したら、[ 送信]をクリックします。このプログラムは、画像の各接種点でフォーマットされた白いピクセルの数を自動的に認識し、コロニー形成があるかどうかを判断し、画像をMIC値に変換します。
    9. [ クエリ ] をクリックして、テストされた抗生物質に対する菌株のすべての MIC 結果を取得します。
      注:インテリジェントなハイスループットASTシステムは、細菌株の大規模なバッチのMICを測定するのに適しています。準備、接種、インキュベーション、結果の読み取りを含むテストプロセスには3日かかります。抗生物質の種類とMIC検出範囲は、それぞれのニーズに応じて設定でき、主要な消耗品は再利用できます。
  6. Lar指数の計算
    1. 次の式でLarインデックスを正確に決定します。 figure-protocol-1
      MICi:最小発育阻害濃度。
      MIC-3 から MIC3 までの MIC 分布の範囲は、R を中心とする直列 2 倍濃度 (0.125R、0.25R、0.5R、R、2R、4R、8R) を表します。
      figure-protocol-2 は 2 i で、i の範囲は -3 から 3 です。
      R:CLSIによって標準化された抗菌剤に対する細菌の耐性のブレークポイント。
      f: MIC 度数分布。
      注:一般的なLarインデックスは、すべてのLarインデックスの算術平均です。Lar インデックスが計算されたら、最終値を小数点以下の 2 桁の有効数字に四捨五入します。

2. 理性的なハイスループットのバクテリオファージのスクリーニング システム9

  1. バクテリオファージシードブロックおよびバクテリアを含有する2層インキュベートプレートを調製する。
    1. 異なるファージを作製するには、二層寒天法10 または液体培養法11 を使用します。1 x 104-5 pfu/mLの力価で適切な平行濃度に希釈し、200 μLのファージ接種体を96ウェルシードブロックに加えます。
    2. バクテリア(10 mLの底寒天培地[寒天12 g/L]と6 mLの上部半寒天培地[6 g/L]、100 μLのバクテリア[0.5 McFarland])を入れた2層プレートを試験します。
    3. 試験する菌株ごとに2層のインキュベートプレートを作成します。二層プレートの蓋の下に隙間を残し、バイオセーフティキャビネット内の寒天表面を吹き飛ばして乾燥させます。
  2. スクリーニング検査
    1. 調製したファージシードブロックと2層プレートを96ドットマトリックス接種器のモバイルキャリアに置き、すべてのファージ接種を半寒天表面に移します。テストされたすべての株が完了するまでサイクルを続けます。
    2. 接種した二層プレートは、接種スポットの水分が半寒天に完全に吸収されるまで室温に留まります。
    3. プレートを反転させ、試験した菌株に適した条件下で4〜6時間インキュベートして、透明な溶解性スポットが形成されるようにします。
  3. データの分析
    1. 画像取得コンバータにより、各二層板の実験結果の画像を取得し、保存する(ステップ1.5.4-1.5.6)。
    2. 得られた画像に基づいて、さまざまな形状の斑点の数と形態をスプレッドシートに記録し、さまざまな種類のファージのそれぞれの比率を計算します。

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結果

インテリジェントなハイスループットASTシステムのプロトコルに従って、そのアプリケーションは、例として中国山東省の家禽由来の サルモネラ 菌によって説明されました。

画像取得コンバーターで測定したアンピシリン(R 32 μg/mL)を2〜256 μg/mLの濃度で寒天プレート上でサル モネラ菌 株が増殖したことを 図3に示します。水平の第1ウェル A1はネガティブコントロールであり、コロニーの成長は示さなかった。A2およびA3は、CLSIによって標準化された品質管理範囲(2-8μg/mL)内のMIC 4 μg/mL(2 μg/mLのアンピシリンで寒天プレート上にコロニーを形成するが、4 μg/mLのコロニーを形成しない)の品質管理株であった。A4の サルモネラ 菌株のMICは64μg/mLであったのに対し、A5のMICは16μg/mLであった。アンピシリンに対する93の サルモネラ菌 株のMIC分布は、ソフトウェアによって自動的に...

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ディスカッション

寒天希釈法は確立されており、広く使用されています。ハイスループットASTシステムの原理は寒天希釈法の原理であった。プロトコル内の重要なステップの1つは、一度に96個の接種者を正確かつハイスループットで移送することで、これを複数回連続して実行しました。この重要なステップを完了するために、96ドットマトリックス接種器のピンは均一で非常に滑らかでした。各ピンの自然堆積量は約 2 μL で、寒天培地の表面に凝集して小さな液滴となり、寒天にすばやく吸収され、流れたり飛散してクロスコンタミネーションを引き起こしたりしませんでした。2つ目の重要なステップは、大規模なASTデータの統計処理でした。ハイスループット接種では、検査データを決定する必要があり、作業負荷も膨大でした。インテリジェントな画像取得コンバータとサポートソフトウェアによって生成されたインテリジェントな分析と統計結果は、この問題に対する完璧なソリューションでした。ASTの結果は、Varmsデータベースに直接自動的にアップロードされました。結果解釈の効率と精度が向上し、人的要因によって引き起こされるエラーが減少しました13。

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開示事項

Yuqing Liuらは、96ドットマトリックス接種器および画像取得コンバーターとその用途に関する中国特許を申請しています(特許番号ZL 201610942866.3および特許番号ZL 201910968255.X)。

謝辞

この研究は、国家重点研究開発プロジェクト(2019YFA0904003)の支援を受けました。山東省の現代農業産業システム(SDAIT-011-09);国際協力プラットフォーム最適化プロジェクト(CXGC2023G15)中国山東省農業科学院農業科学技術イノベーションプロジェクトの主なイノベーション課題(CXGC2023G03)。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
96ウェル 培養プレート北京lanjieke技術有限公司11510
96ドットマトリックスAST画像取得システム山東農業科学院動物科学獣医学研究所ソフトウェア著作権
96ドットマトリックス接種器 動物科学および獣医学研究所、山東農業科学院N / A特許製品
寒天青島ハイテク工業団地海博バイオテクノロジー株式会社HB8274-1
アミカシン Shanghai McLean Biochemical Technology Co., LtdA857053
AmoxicillinShanghai McLean Biochemical Technology Co., LtdA822839
AmpicillinShanghai McLean Biochemical Technology Co., LtdA830931
分析天びんザルトリウスBSA224S
AMRのLar指数の自動計算ソフト山東省農業科学院畜産獣医学研究所自社ソフト著作権
Bacteria Salmonella strains東農業科学院畜産獣医学研究所N/A動物由来
細菌耐性 Lar指数認証管理システム V1.0Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences社内ソフトウェアの著作権
CeftiofurShanghai McLean Biochemical Technology Co., LtdC873619
CiprofloxacinShanghai McLean Biochemical Technology Co., LtdC824343
Clavulanic acidShanghai McLean Biochemical Technology Co., LtdC824181
清潔な作業台蘇州浄化装置有限公司SW-CJ-2D
コリスチン硫酸塩上海マクリーン生化学技術有限公司C805491
カルチャープレート動物科学および獣医学研究所、山東農業科学院N/A特許取得済み製品
ドキシサイクリン上海マクリーン生化学技術有限公司
EnrofloxacinShanghai McLean Biochemical Technology Co., LtdE809130
Filter 0.22 μmMilliporeSLGP033RB
FlorfenicolShanghai McLean Biochemical Technology Co., LtdF809685
GentamicinShanghai McLean Biochemical Technology Co., LtdG810322
ガラス瓶 50 mL徐州 Qianxing Glass Technology Co., LtdQX-7
ハイスループット抵抗検出システム V1.0Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences自社ソフト copyright
Image acquisition converterInstitute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural SciencesN/A特許製品
MeropenemShanghai McLean Biochemical Technology Co., LtdM861173
Mueller-Hinton agar青島ハイテク工業団地Haiboバイオテクノロジー株式会社HB6232
シャーレ60 mm x 15 mm青島ジンディアン生化学機器有限公司16021-1
レ90 mm x 15 mm島ジンダン生化学機器有限公司16001-1
サルモネラ菌< / E>Mファージ動物科学および獣医学研究所、山東農業科学アカデミーN/A
シェーカーインキュベーターShanghai Minquan Instrument Co., LtdMQD-S2R
濁度計Shanghai XingBai Biotechnology Co., LtdF-TC2015
Varms ベース型ライブラリシステム V1.0山東農業科学院畜産獣医学研究所社内ソフトウェアの著作権
縦型高圧蒸気滅菌器上海神安医療機器工場LDZX-75L
獣医病原体耐性試験管理システム東省農業科学院動物科学獣医学研究所社内ソフトウェアの著作権
獣医耐性クラウド監視およびファージ制御プラットフォームV1.0山東省農業科学院畜産獣医学研究所自社製ソフトウェアの著作権
社内 山D832390シャー青山

参考文献

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