ここでは、 ex vivo ポリビニルアルコールベースの増殖を使用してマウス造血幹細胞培養を開始、維持、および分析するためのプロトコルと、レンチウイルス形質導入およびエレクトロポレーションによってそれらを遺伝子操作する方法を紹介します。
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方法論記事
エクスビボ ポリビニルアルコール培養におけるマウス造血幹細胞の増殖と遺伝子操作
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
自己複製型多能性造血幹細胞(HSC)は、生涯を通じて造血をサポートし、移植後に血液系全体を再構成する能力があるため、重要な細胞型です。造血幹細胞は、さまざまな血液疾患の治癒的治療を表す幹細胞移植療法で臨床的に使用されています。造血幹細胞活性と造血を調節するメカニズムの理解と、新しいHSCベースの治療法の開発の両方に大きな関心が寄せられています。しかしながら、幹細胞幹細胞の ex vivoでの安定した培養および増殖は、取り扱い可能な ex vivo システムでこれらの幹細胞を研究する上で大きな障壁となってきた。我々は最近、移植可能なマウス造血幹細胞の長期的・大規模拡大を支援できるポリビニルアルコールベースの培養系と、それらを遺伝子編集する方法を開発しました。このプロトコルは、エレクトロポレーションおよびレンチウイルス形質導入 を介して マウスHSCを培養および遺伝子操作する方法について説明しています。このプロトコルは、HSC生物学と造血に関心のある幅広い実験血液学者に役立つことが期待されます。
概要
造血系は、酸素供給から病原体との戦いまで、特殊な血液および免疫細胞タイプを通じて、哺乳類のさまざまな重要なプロセスをサポートします。造血幹および前駆細胞(HSPC)1によって維持される血液系の恒常性をサポートするためには、継続的な血液産生(造血)が必要です1。最も原始的な造血細胞は造血幹細胞(HSC)であり、これは自己複製および多系統分化のためのユニークな能力を有する2,3。これはまれな細胞集団であり、主に成体の骨髄4に見られ、約30,000細胞に1個の頻度で発生します。造血幹細胞は、生涯にわたる造血をサポートし、血液学的ストレス後の造血を再確立するのに役立つと考えられています。これらの能力はまた、HSCが照射されたレシピエントへの移植後に造血系全体を安定して再構成することを可能にする5。これは、HSCの機能的定義を表しており、さまざまな血液および免疫疾患の治癒的治療法であるHSC移植療法の科学的根拠も形成します6。これらの理由から、造血幹細胞は実験血液学の主要な焦点です。
研究の大きな焦点にもかかわらず、HSCをex vivo
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プロトコル
繁殖や安楽死を含むすべての動物の手順は、制度的および国のガイドラインの範囲内で実行されなければなりません。以下に詳述する実験は、英国内務省によって承認されました。このプロトコルで使用されるすべての材料、試薬、および機器のリストについては、 材料の表 を参照してください。
1.ストックソリューションの準備
- PVAストックソリューション
- 50 mLの組織培養品質の水を小さなガラス瓶に入れます(オートクレーブに適しています)。電子レンジで沸騰近くまで水を温めます。
- 5 gのPVA粉末を量り、水に加える。
注意: 1〜5 gのPVAのみを溶解することをお勧めします。大量に溶解すると、再構成が不完全になる可能性があります。 - 蓋をしっかり閉め、振って混ぜます。次に、蓋を緩めます。
注意: 水温の変化により圧力が変化する可能性があるため、再開するときは注意してください。 - オートクレーブして冷まします。蓋をしっかり閉め、振って混ぜます。滅菌チューブにアリコートを入れ、4°Cで最大3ヶ月間保存します。
- 凍結乾燥サイトカインを1 mg/mL PVAを含むF-12培地に溶解します。幹細胞因子を10 μg/mLに、トロンボポエチンを100 μg/mLに再構成して、1:1,000の....
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結果
造血幹細胞のFACS精製では、c-Kitが豊富な骨髄内で、細胞の~0.2%が若い(8-12週齢)C57BL/6マウスのCD150+CD34-c-Kit+Sca1+系統集団であると予想しています(図1)。ただし、トランスジェニックマウスまたは異なる年齢のマウスは、異なるHSC頻度を示す可能性があります。4週間の培養後、CD201+CD150+c-Kit+Sca1+系統画分は~10%になると予想しています(図2)。これらの結果は、c-Kit濃縮骨髄またはFACS精製HSCから開始された細胞培養についても同様である。GFP発現レンチウイルスベクター(20形質導入単位/細胞)による形質導入後、~30%のGFP+細胞が期待されます(図3
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ディスカッション
このプロトコルが、HSC生物学、造血、および血液学をより一般的に調査するための有用なアプローチを提供することを願っています。FACS精製HSCs8のPVAベースの培養法の最初の開発以来、この方法は拡張されてきた。例えば、この方法は、骨髄および負の表面荷電プレート14で富化されたc−Kitで機能することが示されている。形質導入およびエレクトロポレーションとの適合性も実証されている14,15。これらのHSCおよびc-Kit+ HSPC培養物のin vivo検証はこれらの出版物に記載されていますが、読者はin vivo移植プロトコルに関する他の公開プロトコルを参照できます21。移植後の新鮮なHSPCと培養されたHSPCの間で系統キメラに大きな違いは見られませんが、ex vivo拡張後の個々のHSCの再構成効力は.......
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開示事項
著者には利益相反はありません。
謝辞
フローサイトメトリーへのアクセスを提供してくれたWIMMフローサイトメトリーコアと、レンチウイルスベクターの生成にWIMMウイルススクリーニングコアに感謝します。この研究は、Kay Kendall Leukaemia FundとUK Medical Research Councilによって資金提供されました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 機器 | |||
| 解剖キット | フィッシャーサイエンティフィック | 12764416 | |
| 血球計算盤 | アップルトンウッズ株式会社 | HC002 | |
| P3 初代細胞 4D-ヌクレオフェクター X キット | ロンザ | V4XP-3024 | |
| 棒および乳鉢 | 科学実験室供給 限定 | X18000 | |
| QuadroMACSセパレーター | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| Materials | |||
| 5 mL syringe | VWR International Ltd | 720-2519 | |
| 19 G needle | VWR International Ltd | 613-5394 | |
| 50 μmセルストレーナー | シスメックス | 04-004-2317 | |
| 70 μm細胞ストレーナー | コーニング | 431751 | |
| Kimtechワイプ | VWR International Ltd | 115-2075 | |
| LS MACSカラム | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Reagents | |||
| Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3, 100 μg | IDT | ||
| アニマルフリー組換えマウス幹細胞因子 | Peprotech | AF-250-03 | |
| アニマルフリー組換えマウストロンボポエチン | Peprotech | AF-315-14 | |
| 抗マウスCD117 APC (クローン:2B8) | サーモフィッシャー | 17-1171-83 | |
| 抗マウスCD117 BV421 (クローン:2B8) | Biolegend | 105828 | |
| 抗マウスCD127 APC/Cy7 (クローン:A7R34) | Biolegend | 135040 | |
| 抗マウスCD127ビオチン(クローン:A7R34) | Biolegend | 135006 | |
| Anti-mouse CD150 PE/Cy7 (clone: TC15-12F12.2) | Biolegend | 115914 | |
| 抗マウスCD201 APC (クローン: eBio1560) | ThermoFisher | 17-2012-82 | |
| 抗マウスCD34 FITC (クローン: RAM34) | ThermoFisher | 11-0341-85 | |
| 抗マウスCD4 APC/Cy7 (クローン:RM4-5) | Biolegend | 100526 | |
| 抗マウスCD4ビオチン(クローン:RM4-5) | Biolegend | 100508 | |
| 抗マウスCD45R APC/Cy7 (クローン:RA3-6B2) | Biolegend | 103224 | |
| 抗マウスCD45Rビオチン(クローン:RA3-6B2) | Biolegend | 103204 | |
| 抗マウスCD48 BV421(クローン:HM48-1) | Biolegend | 103428 | |
| 抗マウスCD8ビオチン(クローン:53-6.7) | Biolegend | 100704 | |
| 抗マウスCD8a APC/Cy7 (クローン:53-6.7) | Biolegend | 100714 | |
| 抗マウスLy6G/Ly6C APC/Cy7 (クローン:RB6-8C5) | Biolegend | 108424 | |
| 抗マウスLy6G/Ly6Cビオチン(クローン:RB6-8C5) | Biolegend | 108404 | |
| Anti-mouse Sca1 PE (クローン:D7) | Biolegend | 108108 | |
| Anti-mouse Ter119 APC/Cy7 (クローン:TER-119) | Biolegend | 116223 | |
| 抗マウス Ter119 ビオチン (クローン:TER-119) | Biolegend | 116204 | |
| CellBINDプレート、24ウェル | Corning | 3337 | ネガティブ表面荷電 |
| CellBINDプレート、96ウェル | Corning | 3330 | ネガティブサーフェスチャージ |
| カスタム合成 sgRNA | Synthego, Sigma Aldrich, IDT | カスタムオーダー | |
| ウシ胎児血清 | Merck Life Science UK Limited | F7524-50ML | |
| フィブロネクチンコーティングプレート, 96ウェル | BD Biosciences | 354409 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix | Gibco | 11765054 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-X (100x) | Gibco | 51500.056 | |
| リン酸緩衝生理食塩水 | Alfa Aesar | J61196。AP | |
| ポリビニルアルコール | シグマアルドリッチ | P8136 | |
| ヨウ化プロピジウム | Enzo Life Sciences(UK)Ltd | EXB-0018 | |
| ストレプトアビジンAPC / Cy7 | レジェンド | 405208 | |
| TüRKSのソリューション | Sigma Aldrich | 109277 | |
| Virkon | Mettler-Toledo Ltd | 95015662 |
参考文献
- Laurenti, E., Göttgens, B. From haematopoietic stem cells to complex differentiation landscapes. Nature. 553 (7689), 418-426 (2018).
- Eaves, C. J. Hematopoietic stem cells: concepts, definitions, and the new reality. Blood. 125 (17), 2605-2613 (2015).
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