脱細胞化軟骨細胞外マトリックスハイドロゲルの合成

軟骨組織工学は、損傷または病変した軟骨組織の再生を目指す急速に発展している分野^です1。この分野における重要な課題の1つは、軟骨の産生に関与する細胞である軟骨細胞の成長と分化をサポートできる生体模倣スキャフォールドの開発^です2。軟骨組織のECMは、軟骨細胞の挙動を調節する上で重要な役割を果たしています。DC-ECMは、組織^{工学アプリケーション3}の効果的な足場です。

軟骨組織からDC-ECMを製造するために、化学的、酵素的、物理的方法など、多くの技術が開発されています。しかし、これらの方法では、生体模倣が不十分なECMハイドロゲルが生成されることが多く、組織工学用途での使用の可能性が制限されます^4,5。したがって、DC-ECMヒドロゲルを製造するためのより効果的な方法が必要である。

この技術の開発は、組織の再生と修復をサポートできる生体模倣スキャフォールドを作成するための新しいアプローチを提供することにより、組織工学の分野を前進させることができるため、重要です。さらに、この技術は、他の組織からECMハイドロゲルを製造するために容易に適応できるため、その潜在的な用途が拡大します。

より広範な文献では、組織工学アプリケーションの足場としてDC-ECMを使用することへの関心が高まっています⁶。多くの研究により、軟骨を含むさまざまな組織における細胞の成長と分化を促進するDC-ECMハイドロゲルの有効性が実証されています^7,8。したがって、軟骨組織の天然ECMを厳密に模倣したDC-ECMハイドロゲルを製造するためのプロトコルの開発は、この分野への重要な貢献です。

この論文で紹介するプロトコールは、軟骨組織の天然ECMを厳密に模倣したDC-ECMハイドロゲルを製造するための新しい方法を提供することで、このニーズに対処します。プロトコルは軟骨のティッシュをdecellularizing、生じるECMを隔離し、そしてbiocompableポリマーとECMを架橋することによってハイドロゲルを作成することを含む。得られたハイドロゲルは、軟骨細胞の増殖と分化をサポートする上で有望な結果を示しています。

この研究は、浙江省の通徳病院の倫理委員会によって承認されました。

1. DC-ECMハイドロゲルの調製

注:この研究では、軟骨は生後12か月のバマミニチュアブタの膝関節から採取され、骨組織の収集を回避しました。

1. 採取した軟骨をメスでブロックし、1〜2mmの³ 個に切り刻みます。
2. みじん切りにした軟骨20gを50mLの遠心チューブに入れ、20mLの低張性Tris-HCl緩衝液(10mM Tris-HCl、pH 8.0)を加えて組織を完全に沈めます。遠心チューブを-80°Cの冷凍庫に3時間入れ、次に37°Cのオーブンに3時間入れます。凍結と加熱のステップを6回繰り返します。このステップでは、低張Tris-HClバッファーを交換する必要はありません。
3. ボルテックスミキサーを使用して遠心分離管を1,000rpmの速度で30秒間振とうします。ステンレス製のふるい(孔径:~250 μm)を新しい50 mL遠心チューブに置きます。
4. 脱細胞化した軟骨をステンレス製のふるいにゆっくりとデカントし、滅菌PBSで組織を3回洗浄し、軟骨を採取します。
5. 10 mLのトリプシン溶液(0.25%トリプシンPBS溶液)を加え、チューブを37°Cのシェーカーに24時間置きます。この期間中、4時間ごとにトリプシンを交換してください。ステンレス鋼のふるいを使用して懸濁液をろ過し、組織を保存します。トリプシンは、消化プロセスの1つで一晩処理することができ、これは最終的な消化に影響を与えません。
6. トリプシン処理した組織を高張緩衝液(1.5 M NaCl、50 mM Tris-HCl、pH 7.6)で洗浄します。
7. 10 mL のヌクレアーゼ溶液(50 U/mL のデオキシリボヌクレアーゼと 1 U/mL のリボヌクレアーゼを 10 mM Tris-HCl、pH 7.5 に溶解)を加え、チューブを 37 °C のシェーカーに 4 時間置きます。
8. ヌクレアーゼ溶液を除去し、軟骨を滅菌PBSで3回洗浄し、低張性Tris-HCl溶液を加えます。遠心分離管をシェーカーの上に置き、室温(RT)で20時間すすぎます。
9. 低張性Tris-HCl溶液を除去し、軟骨を滅菌PBSで3回洗浄し、1%Triton X-100溶液を加えて組織を24時間浸します。
10. Triton X-100溶液を除去し、脱細胞化軟骨を蒸留水で3日間十分に洗い流し、蒸留水を12時間ごとに交換します。
11. 軟骨を過酢酸溶液(0.1% PAA in 4% ethanol)に4時間浸します。過酢酸溶液を取り除き、軟骨を滅菌蒸留水で3回洗浄します。
12. ステンレス鋼のふるい(孔径:~250μm)を50mLの遠心分離管に置きます。脱細胞化した軟骨をステンレス製のふるいにゆっくりとデカントし、軟骨を採取します。DNA、コラーゲン、グリコサミノグリカン(GAG)の含有量を推定することにより、軟骨の脱細胞化の程度とマトリックス保持をテストします。
13. 脱細胞化軟骨を粉砕ボウルに入れ、液体窒素を加え、脱細胞化軟骨を粉砕して粉末状にする。脱細胞化軟骨粉末2gを摂取し、0.5M酢酸80mLとペプシン20mgを加え、24時間消化します。400 x g で10分間遠心分離します。沈殿物を捨て、上澄み液(DC-ECM溶液)を回収する。
14. 1ウェルあたり1 mLのDC-ECM溶液を6ウェルプレートにデカントします。6ウェルプレートを凍結乾燥機に入れます。DC-ECM ソリューションを凍結します。凍結乾燥機内の温度が-40°Cに下がったら、真空ポンプを投入し、真空度を10Paで22時間維持します。
15. 凍結乾燥したDC-ECM溶液を取り出し、遠心チューブに入れ、-20°Cで保存します。 凍結乾燥DC-ECM溶液の最低保管期間は半年以上です。
16. 1 mL の滅菌蒸留水を加えて、20 mg の凍結乾燥 DC-ECM 溶液を遠心分離管に溶解します。ボルテックスミキサーを用いて、室温で1,000rpmの速度で1分間振とうし、DC-ECM溶液にビタミンB2(0.1%w/v)1mgを加え、37°Cで60分間インキュベートし、UV光(370nm、3.5mW/^cm2)を3分間照射してハイドロゲル(DC-ECMハイドロゲル)を形成する。

2. 脱細胞化軟骨の検出

1. 脱細胞化軟骨のDNA含量検出
   注:DNEasy Blood & Tissue Kitを使用してDNAを抽出します。
   1. まず、遠心チューブに20mgのDC-ECM軟骨を採取します。180 μLのBuffer GTLと20 μLのProteinase Kを渦振動により添加し、軟骨が完全に溶解するまで56°Cで4時間インキュベートします。
   2. ボルテックスミキサーを使用して遠心分離管を室温で1,000rpmの速度で15秒間振とうします。次に、200μLのBuffer GLと無水エタノールを加え、渦振動により十分に混合する。サンプルを4°Cで6,000 x g の速度で1分間遠心分離します。
   3. 500 μL のバッファー GW1 を吸着カラムに添加し、サンプルを 4 °C で 12,000 x g の速度で 1 分間遠心分離します。 500 μL のバッファー GW2 を吸着カラムに加え、20,000 x g で 4 °C で 1 分間遠心分離します。最後に、吸着カラムに滅菌水50μLを加え、4°Cで6,000× g の速度で1分間遠心分離し、DNA溶液を回収します。分光光度計を使用してDNA含有量を測定します。
2. 脱細胞化軟骨におけるコラーゲン含量検出
   1. 脱細胞化軟骨のコラーゲン含有量を検出するには、コラーゲンアミノ酸マーカーとしてヒドロキシプロリンを使用します。5 mgの脱細胞化軟骨を5 mLの6 M塩酸で100°Cで20分間酸性化した後、5 mLの6 M水酸化ナトリウム溶液で中和します。
   2. 分光光度計で570nmのサンプルの吸光度を測定することにより、ヒドロキシプロリンの含有量を計算します。標準ヒドロキシプロリンサンプルを使用して濃度吸収線形回帰を取得します。
3. 脱細胞化軟骨中のGAG含量検出
   注:DC-ECM軟骨中のGAG含有量は、組織GAG比色定量検出キットを使用して検出しました。以下のすべての試薬がキットに含まれています。
   1. DC-ECM軟骨粉末200mgを採取し、500μLの試薬Aを渦振動により添加します。サンプルを4°Cで16時間インキュベートした後、14,000 x g で10分間遠心分離します。
   2. 試料溶液50mLを採取し、高塩溶液(試薬B)50μLと酸性溶液(試薬C)50μLを渦振動により加えます。サンプルを10分間インキュベートします。
   3. 750μLの色素溶液(試薬D)を渦振動により添加し、暗所で30分間インキュベートします。サンプルを 14,000 x g で 10 分間遠心分離し、上清を廃棄します。
   4. 洗浄液(試薬E)1μLを加え、よく混ぜる。サンプルを14,000 x g で10分間遠心分離し、上清を廃棄します。
   5. 解離液(試薬F)1μLを試料に加え、よく混合する。サンプルを暗所で30分間インキュベートします。最後に、600nmの分光光度計を使用してGAG含有量を決定します。
4. 走査型電子顕微鏡(SEM)および透過型電子顕微鏡(TEM)による脱細胞化軟骨の解析
   1. 脱細胞化軟骨と正常軟骨組織を比較します。サンプルを2.5%グルタルアルデヒド溶液に入れ、4°Cで一晩インキュベートした後、PBSで3回洗浄します。
   2. サンプルを1%OsO4で1時間固定した後、PBSで3回洗浄します。
   3. 50%、70%、90%、100%エタノール、および100%アセトンにそれぞれ15分間連続的に浸漬して、サンプルを脱水します。サンプルをヘキサメチルジシラザンとエタノール(1:1)の混合溶液に15分間入れた後、純粋なヘキサメチルジシラザンに15分間浸漬します。
   4. サンプルをHCP-2乾燥機に入れ、液体窒素を使用して乾燥させます。次に、完全に乾燥した試料をスパッタリングコーティングを使用して金パラジウムの薄層でコーティングし、SEMを使用して画像化します。スパッタコーティングは、120Wの電力で5分間行った。実験は、動作電圧15kV、真空度5×10^−5Pa 未満の条件で実施した。
   5. TEM分析では、サンプルを無水アセトンと樹脂(1:1)の混合物に1時間入れ、続いて無水アセトンと樹脂(1:3)の混合物に3時間入れます。次に、サンプルを樹脂に一晩入れます。
      1. サンプルを包埋培地充填カプセルに入れ、70°Cで9時間加熱します。
      2. 包埋後、超微細ミクロトームを用いて試料を70nmの薄切りにし、銅メッシュ上に置きます。
      3. 20 μLの酢酸ウラニル染色液を銅メッシュにピペットで移し、室温で15分間染色します。
      4. 次に、20 μLのクエン酸鉛染色溶液を銅メッシュにピペットで移し、室温で15分間染色します。
      5. 濾紙で裏打ちされた清潔なペトリ皿に銅メッシュを置きます。自然乾燥後、TEMで切片を撮影します。プローブは500 nNの下向きの力で印加され、1 Hzの速度でスキャンされ、弾性定数(k値)は40 ^Nm-1でした。プローブ先端の半径は8nmと測定した。

より優れたDC-ECM軟骨ハイドロゲルを調製するために、以前の文献を研究およびレビューし、脱細胞化率、免疫原性、および機械的機能の観点からさまざまな脱細胞化プロトコルを比較しました9。

これに基づいて、DC-ECM軟骨ハイドロゲルを調製し、骨軟骨欠損症の治療における放射状配向抽出マトリックス/間葉系幹細胞エクソソームバイオインクの効果を調査しました。その結果、DC-ECM軟骨ハイドロゲルは免疫原性が低く、細胞遊走を促進し、軟骨修復を促進する可能性があることが示された10。

近年では、DC-ECM軟骨の作製を最適化しています。上記の実験手順を用いて脱細胞化軟骨を作製した。その結果、脱細胞化軟骨では、天然軟骨と比較してDNA含有量が除去されることが示されました(p < 0.001、 図1A)。ヒドロキシプロリン検査では、天然軟骨と脱細胞化軟骨の間でコラーゲン含有量が類似していることが示されました(p = 0.48、 図1B)。DMMBアッセイでは、グリコサミノグリカンが天然軟骨と比較して脱細胞化軟骨によく保持されていることが示されました(p = 0.68、 図1C)。さらに、SEMとTEMを使用して、DC-ECMの微細構造を観察しました(図1D)。

DC-ECMヒドロゲルを調製するために、凍結乾燥したDC-ECM溶液を最終濃度2wt%で可溶化しました。さらに、DC-ECM溶液をVB2と混合し、続いてUVA(370 nm)誘起架橋を行いました(図2A)。DC-ECM溶液とDC-ECMハイドロゲルを微量遠心チューブに入れました(図2B)。チューブを反転させると、チューブ内のヒドロゲルが底に流れず、ゲル化の兆候でした。架橋剤を含まず、37°Cでのコラーゲン自己組織化に基づくDC-ECM溶液のゲル化時間は約15分でした(図2C)。DC-ECM溶液とハイドロゲルの粘度と動的弾性率を試験しました。その結果、DC-ECMハイドロゲルの溶液粘度はDC-ECM溶液よりも高く、せん断速度が高いほど溶液粘度が低くなることがわかりました(図2D)。さらに、DC-ECM溶液とハイドロゲルの両方の貯蔵弾性率は損失弾性率よりもはるかに高く、どちらも液体ではなくゲルの特性を持っていることを示しています(図2E)。特に、架橋および凍結乾燥後、SEMで測定したDC-ECM溶液およびDC-ECMハイドロゲルの細孔径は、137.672 μmから37.936 μmに減少しました(p < 0.00195、 図2F、G)。

図1:脱細胞化軟骨の作製と特性評価。脱細胞化軟骨を天然軟骨と比較した。(A-C)DNA、コラーゲン、グリコサミノグリカン(GAG)含有量の定量化。n = 5, ***p < 0.001 (スチューデントのt検定)。すべての実験は少なくとも3回行われました。(D)SEMおよびTEMで撮影した天然軟骨と脱細胞化軟骨の微視的構造。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図2:DC-ECMハイドロゲルの調製と特性評価。 紫外光下では、DC-ECM溶液とVB2が架橋し、DC-ECMハイドロゲルを形成しました。(A)DC-ECMハイドロゲルの分子構造と合成。外観、特性評価、および機械的特性を、DC-ECM 溶液と DC-ECM ハイドロゲルの間で比較しました。(B)微量遠心チューブ内のDC-ECM溶液およびDC-ECMハイドロゲルの画像。(C)DC-ECMハイドロゲルおよびDC-ECM/VB2ハイドロゲルのゲル化時間。n = 3, ***p < 0.001 (スチューデントのt検定)。(D)DC-ECM溶液およびDC-ECMヒドロゲルの粘度および(E)動的弾性率。(F)DC-ECM溶液とハイドロゲルの微視的構造(低倍率および高倍率)。スケールバー = 100 μm。 (G)DC-ECM溶液およびハイドロゲルの孔径。n = 5, ***p < 0.001 (スチューデントのt検定)。すべての実験は少なくとも3回行われました。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

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