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方法論記事

カンナビスサティバからの腺頭状茎および固着毛状突起の非水性分離と濃縮

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DOI:

10.3791/64798

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2023年5月12日

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1Department of Vegetable Research, ARO-Volcani Center, 2Department of Vegetable Research, ARO-Newe Ya‘ar Center, 3Department of Ornamental Horticulture and Biotechnology, Institute of Plant Sciences, ARO- Volcani Center, 4Department of Fruit Science, ARO- Volcani Center

この記事について

サマリー

カンナビスサティバからの腺頭状茎および固着毛状突起の便利で高スループットの分離と濃縮のためのプロトコルが提示されています。このプロトコルは、液体窒素、ドライアイス、ナイロンふるいのみを使用したトリコームの乾燥した非緩衝抽出に基づいており、RNA抽出およびトランスクリプトーム解析に適しています。

要約

この論文は、 カンナビスサティバからの腺頭状茎および固着性毛状突起の便利でハイスループットな分離と濃縮のためのプロトコルを提示します。カンナビノイドと揮発性テルペン代謝の生合成経路は主に 大麻 トリコームに局在しており、単離されたトリコームはトランスクリプトーム分析に有益です。トランスクリプトームの特性評価のために腺毛状突起を単離するための既存のプロトコルは不便であり、毛状突起ヘッドが損なわれ、孤立した毛状突起が比較的少量になります。さらに、RNA分解を避けるために、タンパク質阻害剤を含む高価な装置と分離媒体に依存しています。本プロトコルは、3つの個別の修飾を組み合わせて、 それぞれC. sativa 成熟雌花序および扇形葉から大量の単離された腺頭状茎および固着毛状突起を得ることを示唆している。第1の改変は、マイクロシーブを通るトリコームの通過を容易にするために、従来の単離媒体を液体窒素に置き換えることを含む。2番目の変更では、ドライアイスを使用してトリコームを植物源から切り離します。第3の変更は、細孔サイズが減少する5つのマイクロシーブに植物材料を連続して通過させることを含む。顕微鏡イメージングは、両方のトリコームタイプに対する分離技術の有効性を示しました。さらに、単離されたトリコームから抽出されたRNAの品質は、下流のトランスクリプトーム解析に適切でした。

概要

腺毛状突起は、多くの二次代謝産物1を含む植物に存在する毛のような構造であり、新しい生合成遺伝子と酵素の貴重なバンクを表しています2。大麻では、重要な二次代謝産物であるカンナビノイド3とテルペン4の生合成が毛状突起に局在しています。薬用と娯楽用の両方で大麻の品質を決定する上での毛状突起の役割を考慮すると、毛状突起遺伝子発現の研究は興味深いものです。トリコーム特異的遺伝子の発現を特徴付けるには、まず目的のトリコームを単離する必要があります。トリコーム分離プロトコルは、早くも1992年に最初に記述されました5、そしてそれらの最新の開発は最近レビューされました2。一般に、トランスクリプトミクス特性評価のために腺トリコームを抽出するためのプロトコルは、2つの異なる連続ステップに分けることができます。最初のステップは、植物組織からの毛状突起の徹底的な物理的分離を含む。この工程は、ドライアイス5、ガラスビーズを市販の装置6,7を用いて、メッシュ篩8に対して植物材料を粉砕するか、または単離緩衝液9中で植物組織をボルテックスすることによって行うことができる。2番目のステップでは、関心のあるトリコームを微視的な植物残渣および/または他のトリコームタイプからより洗練された分離します。このステップは、密度勾配遠心分離8、10または様々なサイズの篩7、9を用いて実行することができる。処理された組織中のRNAは分解剤に対して極端に敏感であるため、これらの2つの連続したステップは通常、氷冷分離媒体中で、多くの場合タンパク質阻害剤の存在下で行われます4。

従来のトリコーム分離プロトコルでは、氷冷温度に加えて、効率的な抽出手順を確保するために大量の分離媒体が必要です。これらのコンポーネントの組み合わせにより、高スループットを妨げる、困難で時間のかかる絶縁プロセスが発生します。したがって、簡単でユーザーフレンドリーな代替のトリコーム分離プロトコルを提示することは、トリコームの特性評価に関連するさまざまな側面にとって有益である可能性があります。本論文は、従来のプロトコルのいくつかの要素を組み合わせて統合することにより、大麻サティバから茎および固着腺頭状毛状突起を分離するための代替プロトコルを提供することを目的としています。これらの要素には、ドライアイス5、細孔径7,9の減少を伴ういくつかのマイクロシーブを通るトリコームの通過、および隔離媒体8の液体窒素(LN)の置換が含まれます。

本トリコーム分離プロトコルの新規性は、従来のプロトコルと比較して、多くの点で提示される。このプロトコルは、危険なコンポーネントを必要としないため便利です。この手順は、最小限の予防措置でラボで実施でき、高スループットを促進します。標準的な液体分離媒体の代わりにLNを使用することで、単離プロセス全体を通してトリコームの完全性が保証され、その後のトランスクリプトーム解析が可能になります。LNとドライアイスが昇華すると、孤立したトリコームには有害な残留物がなくなります。さらに、LNは室温で昇華する傾向があるため、プロトコル全体で寛大な使用が可能になります。対照的に、従来の単離媒体を大量に使用すると、その取り扱いに実際的な困難が生じます。最後に、このプロトコルは、腺毛状突起の残りの壊れやすい頭部構造からの椎間板細胞の分離を減少させ、ヘッドスペースコンテンツの保持を可能にする。

このプロトコルは、 C. sativa glandular capitate trichomesを単離する技術的実践を支援するように設計された詳細なステップバイステップの方法で提示されます。このプロトコルは、下流の分子分析に適した高濃度および高純度の単離されたトリコームをもたらす管理可能なワークフローを提供します。

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プロトコル

注:この研究で使用された植物材料は、他の場所に記載されているように、イスラエルのボルカニセンターで栽培された4つの C.サティバ ARO-Volcani株(CS-11、CS-12、CS-13、およびCS-14)で構成されていました11。腺頭状茎毛状突起は成熟開花花序から単離され、腺頭状固着性毛状突起は成熟非開花母植物からの大きな扇状葉から単離された。すべての植物材料は摘みたてで、すぐに-80°Cで保存されました。

注意: ドライアイスとLNはプロトコル全体で使用されています。これらの物質は非常に危険です。孤立した毛状突起には、密閉されたチューブに挿入すると危険なガス圧を発生させる可能性のあるドライアイス粒子が含まれている可能性があります。したがって、すべてのキャップに針を刺す必要があります。極低温での取り扱いには、保護ゴーグル、適切なラボウェア、および手袋を使用することを強くお勧めします。

1.植物材料からの毛状突起の初期分離のためのセットアップ

  1. 5 Lのプラスチック容器にハンマーと硬い平らな物体を使用して、ドライアイスブロックを小さな細かいフレークに粉砕します。
  2. 粉砕されていないドライアイスから細かいドライアイスフレーク(5 mm未満)を大きなストレーナー(5 mm未満の細孔を介して )で別の5 Lプラスチック容器にふるいにかけます。約200 cm3 (200 mLマーク)のドライアイスフレークを直立した1 Lガラスビーカーに注ぎます。
  3. 砕いたドライアイスの最初の層の上に最大10 gの冷凍 C.サティバ 花序(これからは植物材料と呼びます)を加え、細かく砕いたドライアイスの200 cm3 の追加層で覆います。
  4. 1 Lガラスビーカーの開口部を2〜3層の1 mm網戸蚊帳で覆い、輪ゴムでガラスカップの外側に固定します(図1)。
  5. LNを大きな丸底のステンレス鋼容器( 材料表を参照)に注ぎ、そこで孤立した毛状突起を収集します。
  6. 小麦粉ふるい/ふるいストレーナーに350μmメッシュを挿入して、小麦粉ふるいメッシュを下から覆います(図2)。取り外し可能なプラスチックリング付きの小麦粉ふるいが利用可能な場合は、350μmのメッシュを挿入して、小麦粉ふるいのメッシュの下に固定します。そうでない場合は、350μmのメッシュを輪ゴムで小麦粉ふるいの周囲に固定します。
  7. LNで満たされた大きな丸底のステンレス鋼容器の上に小麦粉ふるいを置きます(図3)。丸底ステンレス鋼容器の外側のふるいにかけられた塊の損失を最小限に抑えるために、容器の幅が小麦粉ふるいの幅を超えていることを確認してください。

2.植物材料からの毛状突起の分離

  1. 大きなソルトシェーカーを使用するかのように、開口部が小麦粉ふるいに向かって下を向いた状態で1Lグラスを振ってください(図4)。
  2. 小麦粉のふるいに蓄積した砕いたドライアイスと植物材料をふるいにかけることができるように、2〜3分ごとに1 Lのガラスビーカーを取っておきます。
  3. 小麦粉のふるいを水平にふるいにかけ、下の丸底ステンレス鋼容器内のLNへの植物材料の通過を容易にします。
  4. LNをステンレス容器に加え、レベルが低くなったら1Lのガラスビーカーに砕いたドライアイスを入れます。小麦粉ふるいの植物材料が枯渇したら、ガラスビーカーの使用済み植物材料にさらに10 gの新鮮な植物材料を補充します。補充は通常、2回以上繰り返す必要はありません。
  5. 十分な量の濃縮トリコームが丸底のステンレス鋼容器に集められるまで、手順2.1〜2.4を繰り返します。一般に、RNA抽出とトランスクリプトーム解析には20 gの新鮮な植物材料で十分です。
  6. LNに沈めたステンレス容器の底に白い粉末状の物質(植物の破片、腺の毛状突起、砕いたドライアイスからなる)があることを確認します。顕微鏡観察は、十分な量の毛状突起が収集されたかどうかを判断するのに役立ちます。ただし、この手順を実行すると、プロトコルのフローが妨げられる可能性があります。通常、ほとんどの分離には10〜20 gの初期植物材料で十分です。ただし、植物の毛状突起密度には違いがあるかもしれません。
    注: この時点から、実験を一時停止し、後で再開できます。短時間休止する場合は、毛状突起が水没したままになるように、十分な量のLNを追加する必要があります。あるいは、トリコームを収集し、ステップ5で説明したように、後で使用するために最大3か月間-80°Cで保管することができます。

3.球根状および膀胱状毛状突起、および破片などの他の毛状突起タイプからの腺頭状毛状突起(茎および固着)の分離

  1. 清潔な小さな丸底のステンレス鋼容器に少量のLNを追加します。
  2. メッシュサイズ150μmの40cm×40cmのマイクロシーブを2回折り、20cm×20cmの折り目になるようにして開きます。円錐形に似ていることを確認します(図5)。
  3. メッシュコーンを丸底のステンレス鋼容器の端に1つまたは2つの洗濯はさみで固定し、コーンの開いた部分が直立し、その尖った部分が部分的にLNに沈むようにします。
  4. LNとステップ2.6の白色粉末状物質をマイクロシーブコーンにそっと注ぎます。
  5. 幅の広いブラシをそっと当てて、残っている植物材料を集めて、最初の容器から150μmのメッシュコーンに移します。
  6. 最初の容器にさらにLNを追加し、すべての植物材料がマイクロシーブコーンに移されるまでブラッシング動作を繰り返します。
  7. 洗濯はさみを容器の蓋から慎重に取り外し、マイクロシーブコーンを開いて、トリコームが開いたマイクロシーブの中央に配置されるようにします。マイクロシーブの四隅をすべて一緒に保持して、毛状突起を含む中央部分がLNに沈んだままになるようにします(図6)。
  8. マイクロシーブの四隅すべてを保持しながら、ティーバッグを注入するようにスチール容器内のLNにマイクロシーブをゆっくりと浸して振る。このディッピング/シェイク(垂直および水平)の動きを1分間続けます。分離の質と量の間にはトレードオフがあります。浸漬動作が長くなると、毛状突起の量が増える可能性がありますが、分離グレードが低くなる可能性があります。全体として、質と量の両方に対して適切なものとして1分をお勧めします。
    注:このふるい分け動作はプロトコルの最も重要な部分であり、それに応じて実行する必要があります。
  9. オプション:マイクロシーブの中央に包まれているふるいにかけられていない植物の破片と大きな毛状突起(まだLNに沈んでいる)を13 mLまたは50 mLの試験管にすくい取り、将来の使用のために-80°Cで保管します。
    注意: (ドライアイスとLN残留物からの)圧力ガスの蓄積を避けるために、滅菌針で試験管のキャップに穴を開けてください。キャップは、圧力が下がったら、通常は24時間後に交換できます。

4.細孔径が小さくなるマイクロシーブにトリコームを通す

  1. 小さな丸底ステンレス鋼容器の底にあるLNに沈めたふるいにかけた毛状突起を、手順3で提示したのと同じ方法で、細孔サイズ(105 μm、80 μm、65 μm、および50 μm)を小さくしたマイクロシーブに順次移します。

5.希望する毛状突起の収集

  1. LNに沈めた目的の毛状突起を取り除き、事前に冷やした(LN中)スプーンを使用して50μmマイクロシーブで包みます。きれいな皿の上に置きます。
    注:この最終分離段階では、目的の毛状突起がふるいから収集されます。
  2. 粉末状の毛状突起を、事前に冷却したスパチュラまたはチューブに挿入したスクープラ を介して 、ラベルの付いたプレチルド1.5 mLチューブにすばやく移します(図7)。さらなる研究のために、チューブをすぐに-80°Cで保管してください。
    メモ: 絶縁プロトコル全体を示す概略ワークフローチャートを 図8に示します。

6. 精製された毛状突起の観察と分析

  1. 少量(10 mg)の分離された毛状突起を、予冷した(LN経由 の)ヘラを使用して顕微鏡スライドに置きます。一滴の水を加え、染色せずに光学顕微鏡で直接観察します。低倍率(10倍)と高倍率(40倍)を使用して、全体的な分離と汚染の程度を評価します。富化は、 図9に示すように、非毛状突起組織に対する毛状突起の相対量によって視覚的に推定される。
  2. 50 mgの単離された C.サティバ 腺頭蓋骨茎および固着性毛状突起からRNA抽出および品質分析を実行します。
    注:RNA抽出には、mRNA精製のポリAベースの戦略を採用した市販の抽出キット( 材料の表を参照)が使用されました。
    1. 単離された毛状突起の50mgを溶解溶液に再懸濁し、30秒間渦巻き、35kHzの氷冷超音波洗浄ユニットで5分間超音波処理し、メーカーのプロトコルに従ってサンプルからmRNAを抽出する( 材料表を参照)。
    2. トリコームから抽出されたRNAの完全性を推定するには、ラボオンチップシステムを使用して、RNA濃度、総量、およびRNA完全性数(RIN)値を決定します(材料の表を参照)。
    3. トリコーム画分のRNAseq分析を実行します(オプション)。配列決定されたリードのRNAseq解析およびバイオインフォマティクス解析は、標準的なアウトソーシングサービスで実行できます

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結果

従来のトリコーム分離プロトコルと比較してこのプロトコルに含まれる主な変更は、標準の分離媒体をLNに置き換えることです。単離媒体としてLNを使用すると、サンプルがLNに沈んでいる限り、代謝分解が起こりにくいため、ワークフローを緩和できます。さらに、このプロトコルは、従来のトリコーム分離媒体で使用される危険な成分(すなわち、オーリントリカルボン酸およびβ-メルカプトエタノール)を回避するため、作業は化学フードに限定されません。それでも、ドライアイスやLNを取り扱う際には、必要な予防措置を講じることが重要です。

本プロトコルの利点を評価するために、本プロトコルからのトリコーム分離結果を、従来のトリコーム分離手順(トリコーム分離に水性バッファー、ガラスビーズ、および微細篩を使用)12を使用して得られた結果と比較しました。光学顕微鏡検査によるさまざまな分離段階からの成分の比較は、分離プロセスが進むにつれてトリコーム分離度が増加することを示しています。単離プロセスの初期段階(105〜150μmマイクロシーブ)では、ほぼ完全に孤立...

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ディスカッション

現在利用可能なトリコーム単離プロトコルと比較して、2つの主要な変更が本プロトコルに記載されている。これらには、最初のステップでドライアイスを使用して植物材料からトリコームを剥離し、一般的に使用される液体緩衝媒体をLNに置き換えることが含まれます。 C. sativa trichome精製の最初の変更は、ゼラニウムペディセルからトリコームを分離するために砕いたドライアイスの使用を導入した以前のプロトコルに基づいています5。従来の毛状突起分離プロトコルでは、一般的に小型(50 mL)の試験管を使用しますが、この研究では、大量の砕いたドライアイスを含む1 Lのガラスビーカーを使用し、大量の初期植物材料(最大10 g)を処理できるようにしました。さらに、本プロトコルでは、マイクロシーブを通るトリコームの2つの追加の通路が、最初の単離工程で導入された。第1のステップは上下の激しいソルトシェーカーのような動きを採用し、第2のステップは小麦粉ふるいのマイクロふるいを通る水平ふるい分け運動を採用する。水平方向と垂直方向のふるい分け動作を組み合わせることで、毛状突起のサイズと形状に基づいて...

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開示事項

著者には利益相反はありません。

謝辞

著者らは、CannabiVar Ltd.からの財政的支援を認めている。すべての植物材料は、イスラエルのボルカニセンターのヒナニットコルタイ教授によって寛大に提供されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
バイオアナライザー RNA Pico 6000 チップAgilent, ドイツリオーダー番号 5067-1513Lab-on-a-chip system 
Transsonic-310エルマ、ドイツD-78224超音波洗浄ユニット 
TruSeq RNA Sample Prep Kit v2Illumina, USARS-122-2001Sample preparation for RNA sequencing library
Spectrum Plant Total RNA Kit SIGMA-ALDRICH, USASTRN50-1KTPlant Total RNA Kit 
メッシュサイズ350&マイクロのナイロンマイクロふるい。m(小麦粉ふるいの円周より40 x 40 cm以上)Sinun Tech、イスラエルr0350n350210ナイロン スクリーン開口部
マイクロふるい、メッシュサイズ150&マイクロ;m (30 x 30 cmのサイズ)Sinun Tech, Israelr0150n360465ナイロン スクリーン開口部
マイクロふるいメッシュサイズø 105 & マイクロ;m (30 x 30 cmのサイズ)Sinun Tech, Israelr0105n320718ナイロン スクリーン開口部
マイクロふるいメッシュサイズø 80 & マイクロ;m (30 x 30 cmのサイズ)Sinun Tech, Israelr0080n370465ナイロン スクリーン開口部
サイズø 65 & マイクロのナイロンマイクロふるい;m (30 x 30 cmのサイズ)Sinun Tech, Israelr0065n340715ナイロン スクリーン開口部
サイズø 50 & マイクロのナイロンマイクロふるい;m (30 x 30 cmのサイズ)Sinun Tech, Israelr0080n370465ナイロン スクリーン開口部
冷凍植物材料の最大10グラム(-80oCまたは液体窒素で保存)
低温
安全ゴーグル
1mmスクリーンドア(蚊)メッシュ(30 x 100 cmのストリップ)
約5 mmの穴が開いた大型ストレーナー(ザル)
1 Lガラスビーカー
ドライアイス1ブロック(0.5-1 kg)
ハンマーと硬く平らな物体
2つの5 Lプラスチック容器
輪ゴム
大きな小麦粉ふるいまたはふるいストレーナー-できれば円周に取り外し可能なプラスチックリングが付いたもの
大小の丸底ステンレス製容器数個。それらのうちの1つは、丸底のステンレス鋼容器の外側のふるいにかけられた塊の損失を最小限に抑えるために、小麦粉ふるいの円周(直径約40 cm)よりも大きくする必要があります
滅菌針
窒素
1cm幅のペイントブラシ
ナイロンナイロンナイロンメッシュメッシュを扱うための適切な手袋(液体窒素を介して)事前に冷却された(液体窒素を介して)ステンレス鋼のスプーン、へら、およびスクープーラクリーンプレートいくつかの洗濯ばさみで蓋に穴が開けられたラベル付き1.5mLチューブを事前に冷却(液体窒素経由) 液体の2つの容器

参考文献

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